TUGAS BIMBINGAN STASE ORIENTASI 2 HEMA
oleh :
dr. Naura Nitti Kirana
Pembimbing:
Dr. dr. I Edward KSL, MH.Kes, M.M., MSi. Med, Sp.PK(K)
PROGRAM PENDIDIKAN DOKTER SPESIALIS I BAGIAN PATOLOGI KLINIK FAKULTAS KEDOKTERAN
UNIVERSITAS DIPONEGORO/RSUP DR KARIADI SEMARANG
2024
1. Sebutkan klasifikasi pengecatan secara garis besar ?
Pengecatan apusan darah tepi dibagi menjadi dua jenis utama, yaitu:
a. Pengecatan Sitokimia (Cytochemical Staining)
a. Pengecatan ini digunakan untuk mengidentifikasi komponen kimia spesifik dalam sel darah, seperti enzim, lipid, atau glikogen. Pengecatan sitokimia sering digunakan dalam diagnosis kelainan hematologi seperti leukemia. Contoh- contoh pengecatan sitokimia meliputi:
b. Sudan Black (untuk lipid dalam granula sel)
c. Pewarnaan Peroksidase (untuk mengidentifikasi aktivitas enzim peroksidase pada granula neutrofil)
d. PAS (Periodic Acid-Schiff) (untuk mendeteksi glikogen) b. Pengecatan Romanowsky
a. Pengecatan Romanowsky adalah pewarnaan dasar yang digunakan dalam pemeriksaan morfologi umum sel darah. Pewarnaan ini memungkinkan identifikasi jenis sel darah merah, sel darah putih, dan trombosit serta melihat perubahan morfologi yang terjadi pada sel-sel tersebut. Pewarnaan ini juga digunakan untuk mendeteksi parasit darah seperti malaria. Jenis-jenis pewarnaan Romanowsky meliputi:
o Pewarnaan Giemsa
o Pewarnaan Wright
o Pewarnaan Wright-Giemsa
o Pewarnaan Leishman
2. Perbedaan pengecatan MG, Wright dan Giemsa?
Pengecatan Romanowsky mencakup beberapa jenis pewarnaan yang digunakan untuk menganalisis morfologi sel darah dan mendeteksi parasit dalam darah. Masing- masing metode memiliki perbedaan dalam komposisi pewarnaan, cara kerja, dan penggunaannya. Berikut adalah perbedaan dari masing-masing jenis pengecatan Romanowsky:
a. Pewarnaan Giemsa
- Pewarna : Menggunakan campuran methylene blue (pewarna dasar) dan eosin (pewarna asam), dengan komponen Azure B.
- Tujuan Penggunaan : Sering digunakan untuk mengamati detail morfologi sel darah putih, eritrosit, dan trombosit. Juga digunakan secara khusus untuk mendeteksi parasit dalam darah seperti Plasmodium (penyebab malaria), serta parasit lain seperti Trypanosoma dan Leishmania .
- Keunggulan : Sangat baik untuk melihat detail inti sel (nukleus) dan sitoplasma, serta parasit.
- Waktu Pengecatan : Biasanya membutuhkan waktu lebih lama dibandingkan pewarnaan lainnya.
b. Pewarnaan Wright
- Pewarna : Menggunakan methylene blue dan eosin, tetapi tanpa Azure B yang dominan seperti pada pewarnaan Giemsa.
- Tujuan Penggunaan : Lebih umum digunakan dalam pemeriksaan darah rutin, terutama untuk diferensiasi sel darah putih (pemeriksaan hitung jenis leukosit).
- Keunggulan : Hasil pewarnaannya lebih cepat dibandingkan Giemsa dan memberikan hasil yang baik untuk diferensiasi sel darah putih serta pengamatan granula pada neutrofil dan eosinofil.
- Waktu Pengecatan : Lebih cepat, biasanya digunakan untuk analisis hematologi rutin.
c. Pewarnaan Wright-Giemsa
- Pewarna : Kombinasi dari pewarnaan Wright dan Giemsa, menggunakan methylene blue, eosin, dan Azure B.
- Tujuan Penggunaan : Sering dianggap sebagai pewarnaan standar dalam laboratorium hematologi. Pewarnaan ini digunakan untuk pemeriksaan morfologi eritrosit, leukosit, trombosit , serta untuk mendeteksi parasit dalam darah.
- Keunggulan : Menggabungkan keunggulan dari kedua pewarnaan, memberikan hasil yang tajam dan rinci dalam pengamatan morfologi sel darah serta granula pada leukosit. Juga lebih fleksibel dalam penggunaan rutin.
- Waktu Pengecatan : Waktu pengecatan dan hasil cukup cepat dan efisien.
d. Pewarnaan Leishman
- Pewarna : Mirip dengan pewarnaan Wright dan Giemsa, menggunakan methylene blue dan eosin. Pewarna ini sering dianggap sebagai pewarnaan yang lebih sederhana dibandingkan pewarnaan Giemsa.
- Tujuan Penggunaan : Umumnya digunakan dalam situasi lapangan atau untuk mendeteksi parasit seperti Leishmania dan Plasmodium (penyebab malaria).
Pewarnaan ini juga digunakan untuk melihat morfologi sel darah secara umum.
- Keunggulan : Pewarnaan ini lebih cepat dibandingkan pewarnaan Giemsa dan cocok digunakan di laboratorium yang tidak memerlukan hasil yang sangat rinci.
- Waktu Pengecatan : Proses pewarnaan yang lebih singkat dibandingkan pewarnaan Giemsa.
e. Pewarnaan May-Grünwald
- Pewarna : Menggunakan methylene blue dan eosin seperti pewarnaan lainnya, tetapi dengan preparasi yang sedikit berbeda.
- Tujuan Penggunaan : Digunakan untuk morfologi sel darah merah, sel darah putih, dan trombosit . Sering digunakan bersama dengan pewarnaan Giemsa sebagai bagian dari pewarnaan May-Grünwald-Giemsa (MGG) untuk pengamatan detail yang lebih tajam.
- Keunggulan : Pewarnaan ini dapat memberikan kontras yang baik antara sitoplasma dan inti sel, mempermudah pengamatan morfologi.
- Waktu Pengecatan : Relatif cepat dan efisien, sering digunakan sebagai langkah awal sebelum pewarnaan Giemsa dalam pemeriksaan hematologi.
f. Pewarnaan Field
- Pewarna : Merupakan pewarnaan cepat yang menggunakan methylene blue dan eosin, tetapi dengan komposisi dan metode yang lebih sederhana.
- Tujuan Penggunaan : Digunakan terutama untuk diagnosis cepat malaria di daerah endemik atau dalam situasi darurat.
- Keunggulan : Proses pewarnaan sangat cepat dan sederhana, membuatnya ideal untuk diagnosis awal dalam situasi lapangan. Namun, detail morfologi yang dihasilkan mungkin tidak sebaik pewarnaan Giemsa atau Wright.
- Waktu Pengecatan : Sangat cepat, dapat diselesaikan dalam beberapa menit.
Perbandingan:
- Giemsa : Paling rinci, baik untuk morfologi sel dan parasit.
- Wright : Cepat, baik untuk analisis rutin hematologi.
- Wright-Giemsa : Kombinasi, fleksibel untuk morfologi dan parasit.
- Leishman : Lebih sederhana, cocok untuk lapangan.
- May-Grünwald : Biasanya digabung dengan Giemsa untuk hasil lebih tajam.
- Field : Paling cepat, terutama untuk diagnosis malaria.
3. Bagaimana metode pemeriksaan alat SEBIA ( Capillary Elektroforesis)?
Kapiler elektroforesis (Capillary Electrophoresis, CE) adalah teknik analitik yang digunakan untuk memisahkan molekul berdasarkan ukuran, muatan, dan bentuknya dalam medium kapiler (tabung kaca kecil dengan diameter yang sangat kecil, biasanya 10-100 µm). Pemisahan ini terjadi ketika sampel diberi tegangan listrik, yang membuat molekul bermuatan bergerak melalui larutan buffer di dalam kapiler.
Molekul yang lebih kecil atau bermuatan lebih besar akan bergerak lebih cepat daripada yang lebih besar atau bermuatan lebih kecil.
Sistem Sebia menggunakan prinsip elektroforesis kapiler (CE) dalam larutan bebas. Molekul bermuatan dipisahkan oleh mobilitas elektroforesisnya pada pH tertentu dalam buffer alkali. Pemisahan terjadi sesuai dengan pH elektrolit dan aliran elektroosmotik. CE memiliki aliran yang stabil, dibandingkan dengan aliran parabola yang dipompa dari teknik Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (HPLC). Aliran yang stabil menghasilkan puncak yang lebih sempit dan resolusi yang lebih baik. Instrumen elektroforesis kapiler Sebia dilengkapi dengan beberapa kapiler paralel yang memungkinkan beberapa analisis simultan dan throughput yang dapat diskalakan:
Metode Elektroforesis kapiler hemoglobin normal dan hemoglobin varian secara kualitatif dan kuantitatif dengan menggunakan Minicap Capillarys Flex-Piercing dari Sebia (Perancis).Beberapa keunggulan dari teknik ini adalah:
1. Proses otomatis mulai dari persiapan hemolisat sampai pengukuran dan identifikasi fraksi-fraksi hemoglobin.
2. Kapasitas pemeriksaan dari 2-9 bahan pemeriksaan setiap jam.
3. Hanya membutuhkan volume sampel kecil ± 45 uL.
4. Hasil kurva yang bersih memudahkan interpretasi, tanpa puncak tambahan.
5. Pemisahan yang jelas untuk fraksi HbC dan HbE dari fraksi HbA2 dan deteksi yang sangat baik unuk varian HbA2.
6. Dapat mengidentifikasi HbH dan Hb Bart.
METODE
A. Pra analitik 1. Persiapan pasien
Tidak ada persiapan khusus.
2. Persiapan sampel
Darah EDTA disentrifus pada 5000 rpm selama 5 menit, lapisan plasma dibuang.
3. Alat dan bahan Alat:
a. Alat Minicap Capillarys Flex-Piercing dari Sebia.
b. Rak sampel.
c. Container Kit, terdiri dari : Rinse, wash solution dan waste container.
d. Cup, 1 pak berisi 125 cup, digunakan sebagai tempat pengenceran dan migrasi dalam alat otomatis. Satu cup dapat memuat 2 sampel.
e. Filter: 3 filter.
f. Bins for used cups (with lids): tempat sampah dan penutupnya.
g. Hemolyzing solution barcode labels: 5 lembar berisi 4 label.
Gambar 2. Komponen alat Minicap Capillarys Flex-Piercing
(Sumber: Kit Minicap Hemoglobin, Capillarys Hemoglobin(E) Using The Capillarys Flex-Pierching Instrumen, Sebia, Perancis, diakses dari www.sebia.com.).
Bahan:
a. Buffer, berisi alkali penyangga pH 9,4. Tahan sampai tanggal kadaluarsa yang tertera pada kemasan, jika disimpan pada suhu ruang atau refrigerated (2-80C).
Buffer stabil sampai dengan 1 bulan setelah dibuka dan dipasang pada alat.
b. Hemolyzing solution, penyimpanan pada suhu 2-80C dapat tahan sampai tanggal kadaluarsa yang tertera pada kemasan dan jangan dibekukan.
c. Wash solution, diencerkan sampai 250 ml aqua destilata atau deionisasi. Dapat disimpan pada suhu ruang atau 2-80C. Bila masih pekat dapat tahan sampai tanggal kadaluarsa yang tertera pada kemasan, sedangkan bila sudah diencerkan tahan sampai dengan 3 bulan.
B. Analitik 1. Prinsip tes
Metode ini memisahkan komponen atau molekul bermuatan berdasarkan perbedaan tingkat migrasinya dalam sebuah medan listrik. Sampel diinjeksikan ke bagian ujung kapiler yang bermuatan positif (anoda), kemudian komponen dalam campuran ditransport melalui tabung kapiler yang dilapisi silika dengan menggunakan listrik bertegangan tinggi di sepanjang tabung yang berisi buffer alkalis. Hal ini menyebabkan semua komponen ion atau molekul netral bergerak ke katoda yang dapat dideteksi menggunakan detektor pada panjang gelombang 415 nm.
Gambar 3. Instrumen dasar Elektroforesis Kapiler
(Sumber: Sachin Kuhire, National Chemical Laboratory, Pune)1
Di dalam kapiler terjadi proses elektromagnetik yang bergerak ke katoda, sehingga menyebabkan aliran buffer dari anoda ke katoda dan seluruh ion positif dan negatif akan terdorong pada arah yang sama oleh aliran elektroosmotik (electroosmotic flow = EOF) dan analit akan terpisah sesuai aliran elektroforetik (electroporetic flow = EPF) saat migrasi melewati kapiler. Keadaan inilah yang menyebabkan perbedaan waktu migrasi antar ion di dalam kapiler, sehingga:
a. Molekul bermuatan (+) mencapai katoda paling cepat karena EOF & EPF arahnya sama.
b. Molekul netral bergerak ke katoda dengan kecepatan ditentukan oleh EOF.
c. Molekul bermuatan (-) bergerak paling lambat karena EOF & EPF berbeda arah.
Gambar 4. Prinsip pemeriksaan Elektroforesis Kapiler
(Sumber: Budiwiyono I. Pemeriksaan Hemoglobin Elektroforesis, JOGLOSEMAR V)
2. Cara Kerja
a. Buka pintu reagen bay, periksa apakah buffer, wash solution, cup dan aqua destilata sudah tersedia dan terpasang pada tempatnya. Periksa kertas printer masih cukup atau tidak.
b. Pilih program elektroforesis hemoglobin pada menu.
c. Masukkan sampel dan kontrol ke dalam rotating sampler. Letakkan sampel pada posisi 1-26, posisi 27 diletakkan 5 ml hemolysing solution dan posisi 28 diletakkan kontrol.
d. Tutup pintu Minicap dan analisis akan berjalan secara otomatis. Langkah otomatis ini meliputi:
1. Pembacaan barcode pada tabung.
2. Pengenceran sampel dengan buffer dan pencucian probe.
3. Pencucian kapiler.
4. Sampel yang telah diencerkan dimasukkan ke dalam kapiler.
5. Proses migrasi berlangsung dengan tegangan yang konstan selama 8 menit.
6. Hemoglobin dibaca langsung pada panjang gelombang 415 nm dan hasilnya muncul pada layar LCD.
e. Setelah semua rangkaian elektroforesis hemoglobin selesai, keluarkan semua sampel dan kontrol.
C. Pasca analitik 1. Nilai Normal.
HbA2 : 2,2 – 3,2 % HbA : 96,8 – 97,8 % HbF : < 0,5 %
2. Alat Minicap Capillarys Flex-Piercing ini, memisahkan molekul hemoglobin dalam 15 zona mulai dari katoda ke anoda dalam bentuk elektrophoregram.
Fraksi Hemoglobin dengan Minicap Elektroforesis Kapiler
(Sumber: Budiwiyono I. Pemeriksaan Hemoglobin Elektroforesis, JOGLOSEMAR V)
Zona Elektroforesis Kapiler minicap Sebia
Z1 : Hb δA2, varian HbA2 Hasharon, varian HbA2 winnipeg, HbA2 Q-India,...
Z2 : HbC, Hb Constant Spring, varian HbA2 Setif,...
Z3 : HbA2, HbO-Arab,...
Z4 : HbE, Hb Koln, varian HbA2 M-Iwale, denaturasi HbC,...
Z5 : HbS, Hb Hasharon, Hb Handsworth, denaturasi HbO-Arab,...
Z6 : HbD-Punjab, Hb Lepore, Hb Korle-Bu, Hb Koln, denaturasi HbE,...
Z7 : HbF, Hb Porto-Alegre, denaturasi HbS,...
Z8 : Acetylated HbF, Hb Atlanta, Hb Athens-GA,...
Z9 : HbA, Hb Phnom penh, Hb Okayama,...
Z10: Hb Hope,HbM-Iwate,...
Z11: Hb Kaoshsiung, Hb Himeji, Denaturasi HbA,...
Z12: Hb Bart’s, Hb J-Providence, Hb J-Mexico, Hb J-Baltimore,...
Z13: HbJ-Rovigo, HbN-Baltimore,...
Z14: Hb N-Seattle,..
Z15: HbH, Hb I-Toulouse, Hb Sudbury,...
Interpretasi Klinik
Kelebihan HPLC dibandingkan Elektroforesis Kapiler
1. Sensitivitas Tinggi: HPLC biasanya lebih sensitif untuk mendeteksi senyawa pada konsentrasi rendah. Ini sangat berguna untuk analisis sampel dengan senyawa target yang sangat sedikit atau dalam jumlah jejak.
2. Detektor Beragam: HPLC mendukung berbagai jenis detektor, seperti UV-Vis, detektor indeks bias, detektor fotodioda array (PDA), dan detektor massa, yang memungkinkan fleksibilitas dalam analisis berbagai jenis senyawa.
3. Kemampuan untuk Analisis Molekul Non-Ionik: HPLC tidak tergantung pada mobilitas ion seperti CE, sehingga cocok untuk menganalisis molekul netral dan non- ionik, seperti banyak senyawa organik.
4. Kapasitas Muatan Sampel Lebih Tinggi: Kolom HPLC dapat menampung lebih banyak sampel dalam satu kali injeksi, sehingga cocok untuk analisis yang memerlukan volume sampel yang lebih besar.
5. Fleksibilitas Fase Gerak: Dalam HPLC, fase gerak dapat dimodifikasi sesuai kebutuhan, baik polaritas, komposisi, maupun laju alirnya, yang membantu dalam mengoptimalkan pemisahan senyawa.
Kekurangan HPLC dibandingkan Elektroforesis Kapiler
1. Penggunaan Pelarut yang Lebih Banyak: HPLC membutuhkan lebih banyak pelarut organik sebagai fase gerak, yang meningkatkan biaya dan menghasilkan lebih banyak limbah, sehingga kurang ramah lingkungan dibandingkan CE.
2. Biaya Operasional dan Perawatan yang Lebih Tinggi: Sistem HPLC lebih kompleks dan membutuhkan kolom yang bekerja pada tekanan tinggi, sehingga memerlukan perawatan lebih rutin dan biaya operasional yang lebih tinggi.
3. Resolusi Pemisahan yang Lebih Rendah untuk Molekul Bermuatan: Untuk molekul- molekul bermuatan, CE umumnya memberikan resolusi yang lebih tinggi daripada HPLC, sehingga HPLC mungkin kurang ideal untuk analisis molekul bermuatan kecil yang mirip.
4. Memerlukan Sampel dalam Volume Lebih Besar: HPLC biasanya membutuhkan volume sampel yang lebih besar daripada CE, yang mungkin kurang ideal untuk sampel langka atau mahal.
5. Waktu Analisis Lebih Lama: Meskipun HPLC cukup cepat, CE sering kali menawarkan waktu analisis yang lebih singkat, terutama untuk senyawa yang bermuatan dan memiliki perbedaan mobilitas elektroforetik.
Kesimpulan
HPLC adalah pilihan yang sangat baik untuk analisis sampel dengan konsentrasi rendah, molekul non-ionik, dan senyawa yang membutuhkan fleksibilitas deteksi yang tinggi. Namun, CE lebih unggul dalam resolusi untuk senyawa bermuatan, memerlukan volume sampel yang kecil, dan lebih hemat pelarut.
Kelebihan Elektroforesis Kapiler dibandingkan HPLC
1. Resolusi Tinggi: CE umumnya memiliki resolusi yang lebih baik dibandingkan HPLC, terutama untuk pemisahan molekul bermuatan yang memiliki perbedaan muatan atau ukuran yang sangat kecil.
2. Kecepatan Analisis: CE biasanya lebih cepat dari HPLC, terutama untuk molekul- molekul yang memiliki perbedaan mobilitas elektroforetik yang signifikan.
3. Penggunaan Sampel dan Pelarut yang Minimal: CE hanya membutuhkan sedikit sampel (biasanya dalam ukuran nanoliter), dan tidak memerlukan pelarut dalam jumlah besar seperti HPLC, sehingga lebih ramah lingkungan dan hemat biaya.
4. Temperatur yang Stabil: CE menggunakan kapiler yang tipis, yang memudahkan dalam pengaturan dan pengendalian suhu, sehingga mengurangi variasi dalam hasil analisis.
5. Pemeliharaan Lebih Rendah: Karena tidak menggunakan kolom tekanan tinggi seperti pada HPLC, CE cenderung memerlukan pemeliharaan yang lebih sedikit, yang membuatnya lebih tahan lama.
Kekurangan Elektroforesis Kapiler dibandingkan HPLC
1. Sensitivitas Lebih Rendah: CE umumnya memiliki sensitivitas yang lebih rendah untuk senyawa dengan konsentrasi sangat rendah, terutama jika tidak dilengkapi detektor yang sensitif seperti fluoresensi atau detektor massa.
2. Kapasitas Muat Sampel Terbatas: CE memiliki kapilaritas yang sangat kecil, sehingga jumlah sampel yang dapat dianalisis dalam satu kali injeksi sangat terbatas.
HPLC, dengan kolom berkapasitas lebih besar, dapat menangani volume sampel yang lebih banyak.
3. Pemilihan Buffer yang Rumit: Buffer dalam CE harus dipilih dengan hati-hati agar menghasilkan pemisahan optimal, terutama karena pengaruhnya terhadap mobilitas elektroforetik. Pada HPLC, fase gerak sering lebih fleksibel dan lebih mudah dioptimalkan.
4. Detektor yang Terbatas: CE biasanya menggunakan detektor berbasis UV atau fluoresensi, tetapi ketersediaan detektor untuk CE tidak seberagam HPLC (misalnya, detektor UV-Vis, PDA, atau detektor indeks bias pada HPLC).
5. Kurang Cocok untuk Molekul Non-Ionik: CE bergantung pada mobilitas elektroforetik, sehingga kurang efektif untuk pemisahan molekul non-ionik dibandingkan HPLC, yang tidak tergantung pada muatan senyawa.
Kesimpulan
Elektroforesis kapiler lebih unggul untuk analisis molekul kecil atau molekul bermuatan, serta untuk aplikasi yang memerlukan resolusi tinggi dan volume sampel yang kecil. Di sisi lain, HPLC lebih ideal untuk analisis molekul dalam konsentrasi rendah, sampel yang kompleks, dan aplikasi yang memerlukan kapasitas kolom lebih besar serta fleksibilitas deteksi.