PEMERIKSAAN ELEKTROFORESIS HEMOGLOBIN METODE KAPILER
Sri Anita, Darwati Muhadi, Mansyur Arif
Departemen Ilmu Patologi Klinik FK UH-RSUP dr.Wahidin Sudirohusodo, Makassar
I. PENDAHULUAN
Tugas utama dalam sel darah merah dan berperan dalam pengangkutan oksigen secara normal ke jaringan dilaksanakan oleh hemoglobin (Gambar 1).
Hemoglobin (Hb) adalah pigmen yang terdapat dalam eritrosit, dengan BM 64.000 Dalton terdiri dari persenyawaan heme dan globin. Heme adalah senyawa porifin- besi, terdiri dari sebuah atom Fe yang terletak di tengah-tengah struktur porfirin (Fe- porifin). Globin adalah suatu protein yang terdiri dari dua pasang rantai polipeptida dengan jumlah, jenis dan urutan asam amino tertentu. Masing-masing rantai polipeptida mengikat satu gugus heme.1,2,3,4
Gambar 1. Molekul Hemoglobin
(Sumber:Wirawan R., Analisa Hemoglobin Dengan Cara Konvensional dan Mikrokapiler Elektroforesis)4
Jenis hemoglobin ditentukan oleh rantai polipeptida yang terdapat pada globin. Rantai polipeptida ada bermacam-macam yaitu rantai α, β, γ, δ, ε, dan ζ.
Hemoglobin terdiri dari tiga jenis, yaitu: 1,5,6 a. Embrionik:
1. Gower 1 (ζ2ε2) 2. Gower 2 (α2ε2)
Tutorial Hematologi
3. Portland I (ζ2γ2) 4. Portland II (ζ2β2) b. Fetus (α2γ2)
c. Dewasa:
1. Hemoglobin A (α2β2), dengan nilai normal 90-98 % 2. Hemoglobin A2 (α2δ2), dengan nilai normal 1,5-3,5 % 3. Hemoglobin F (α2γ2), dengan nilai normal < 1 %
Kelainan pada hemoglobin dapat terjadi disebabkan oleh berbagai faktor
antara lain: 1,3,7
a.Kelainan hemoglobin kualitatif (hemoglobinopati): kelainan yang disebabkan karena subtitusi asam amino pada rantai polipeptida diganti asam amino lain.
Varian hemoglobin yang sering ditemui adalah Hb S, Hb C, Hb E, Hb O-Arab dan Hb D-Los Angeles.
b. Kelainan hemoglobin kuantitatif (talasemia): kelainan yang disebabkan karena gangguan produksi 1 (satu) atau lebih rantai polipeptida.
Elektroforesis adalah suatu teknik yang mengukur laju perpindahan atau pergerakan partikel-partikel bermuatan dalam suatu medan listrik. Pemisahan komponen atau molekul bermuatan berdasarkan perbedaan tingkat migrasinya dalam sebuah medan listrik. Medan listrik dialirkan pada suatu medium yang mengandung sampel yang akan dipisahkan. Elektroforesis kapiler adalah metode elektroforesis yang digunakan untuk memisahkan asam amino, protein, lipid, karbohidrat, dan nukleotida dengan memamfaatkan medan listrik berkekuatan tinggi yang dilakukan pada pipa kapiler berisi buffer.7,8,9,10
Elektroforesis kapiler pada hemoglobin dapat mendeteksi fraksi hemoglobin normal (A,A2, dan F) dan mengetahui adanya fraksi hemoglobin varian (S,C,E, dan D). Fraksi hemoglobin tersebut bermigrasi dengan kecepatan berbeda-beda tergantung besar dan jenis muatan listrik masing-masing.1,4,7
II. TUJUAN
Tutorial ini bertujuan mendeteksi adanya hemoglobin normal dan hemoglobin varian secara kualitatif dan kuantitatif dengan metode Elektroforesis kapiler menggunakan Minicap Capillarys Flex-Piercing dari Sebia (Perancis). 1,4,7 Beberapa keunggulan dari teknik ini adalah:1,4
1. Proses otomatis mulai dari persiapan hemolisat sampai pengukuran dan identifikasi fraksi-fraksi hemoglobin.
2. Kapasitas pemeriksaan dari 2-9 bahan pemeriksaan setiap jam.
3. Hanya membutuhkan volume sampel kecil ± 45 uL.
4. Hasil kurva yang bersih memudahkan interpretasi, tanpa puncak tambahan.
5. Pemisahan yang jelas untuk fraksi HbC dan HbE dari fraksi HbA2 dan deteksi yang sangat baik unuk varian HbA2.
6. Dapat mengidentifikasi HbH dan Hb Bart.
III. METODE A. Pra analitik
1. Persiapan pasien7
Tidak ada persiapan khusus.
2. Persiapan sampel4,7
Darah EDTA disentrifus pada 5000 rpm selama 5 menit, lapisan plasma dibuang.
3. Alat dan bahan6 Alat:
a. Alat Minicap Capillarys Flex-Piercing dari Sebia (Gambar 2).
b. Rak sampel.
c. Container Kit, terdiri dari : Rinse, wash solution dan waste container.
d. Cup, 1 pak berisi 125 cup, digunakan sebagai tempat pengenceran dan migrasi dalam alat otomatis. Satu cup dapat memuat 2 sampel.
e. Filter: 3 filter.
f. Bins for used cups (with lids): tempat sampah dan penutupnya.
g. Hemolyzing solution barcode labels: 5 lembar berisi 4 label.
Gambar 2. Komponen alat Minicap Capillarys Flex-Piercing
(Sumber: Kit Minicap Hemoglobin, Capillarys Hemoglobin(E) Using The Capillarys Flex- Pierching Instrumen, Sebia, Perancis, diakses dari www.sebia.com.).8
Bahan:7
a. Buffer, berisi alkali penyangga pH 9,4. Tahan sampai tanggal kadaluarsa yang tertera pada kemasan, jika disimpan pada suhu ruang atau refrigerated (2-80C). Buffer stabil sampai dengan 1 bulan setelah dibuka dan dipasang pada alat.
b. Hemolyzing solution, penyimpanan pada suhu 2-80C dapat tahan sampai tanggal kadaluarsa yang tertera pada kemasan dan jangan dibekukan.
c. Wash solution, diencerkan sampai 250 ml aqua destilata atau deionisasi.
Dapat disimpan pada suhu ruang atau 2-80C. Bila masih pekat dapat tahan sampai tanggal kadaluarsa yang tertera pada kemasan, sedangkan bila sudah diencerkan tahan sampai dengan 3 bulan.
B. Analitik
1. Prinsip tes4,7,10,11
Metode ini memisahkan komponen atau molekul bermuatan berdasarkan perbedaan tingkat migrasinya dalam sebuah medan listrik (Gambar 3). Sampel diinjeksikan ke bagian ujung kapiler yang bermuatan positif (anoda), kemudian komponen dalam campuran ditransport melalui tabung kapiler yang dilapisi silika dengan menggunakan listrik bertegangan tinggi di sepanjang tabung yang berisi buffer alkalis. Hal ini menyebabkan semua komponen ion atau molekul netral bergerak ke katoda yang dapat dideteksi menggunakan detektor pada panjang gelombang 415 nm.
Gambar 3. Instrumen dasar Elektroforesis Kapiler
(Sumber: Sachin Kuhire, National Chemical Laboratory, Pune)10
Di dalam kapiler terjadi proses elektromagnetik yang bergerak ke katoda, sehingga menyebabkan aliran buffer dari anoda ke katoda dan seluruh ion positif dan negatif akan terdorong pada arah yang sama oleh aliran elektroosmotik (electroosmotic flow = EOF) dan analit akan terpisah sesuai aliran elektroforetik (electroporetic flow = EPF) saat migrasi melewati kapiler. Keadaan inilah yang menyebabkan perbedaan waktu migrasi antar ion di dalam kapiler (Gambar 4), sehingga:
a. Molekul bermuatan (+) mencapai katoda paling cepat karena EOF &
EPF arahnya sama.
b. Molekul netral bergerak ke katoda dengan kecepatan ditentukan oleh EOF.
c. Molekul bermuatan (-) bergerak paling lambat karena EOF & EPF berbeda arah.
Gambar 4. Prinsip pemeriksaan Elektroforesis Kapiler
(Sumber:Budiwiyono I. Pemeriksaan Hemoglobin Elektroforesis, JOGLOSEMAR V)1
2. Cara Kerja7
a. Buka pintu reagen bay, periksa apakah buffer, wash solution, cup dan aqua destilata sudah tersedia dan terpasang pada tempatnya. Periksa kertas printer masih cukup atau tidak.
b. Pilih program elektroforesis hemoglobin pada menu.
c. Masukkan sampel dan kontrol ke dalam rotating sampler. Letakkan sampel pada posisi 1-26, posisi 27 diletakkan 5 ml hemolysing solution dan posisi 28 diletakkan kontrol.
d. Tutup pintu Minicap dan analisis akan berjalan secara otomatis. Langkah otomatis ini meliputi:
1. Pembacaan barcode pada tabung.
2. Pengenceran sampel dengan buffer dan pencucian probe.
3. Pencucian kapiler.
4. Sampel yang telah diencerkan dimasukkan ke dalam kapiler.
5. Proses migrasi berlangsung dengan tegangan yang konstan selama 8 menit.
6. Hemoglobin dibaca langsung pada panjang gelombang 415 nm dan hasilnya muncul pada layar LCD.
e. Setelah semua rangkaian elektroforesis hemoglobin selesai, keluarkan semua sampel dan kontrol.
C. Pasca analitik 1. Nilai Normal. 7,12
HbA2 : 2,2 – 3,2 % HbA : 96,8 – 97,8 % HbF : < 0,5 %
2. Alat Minicap Capillarys Flex-Piercing ini, memisahkan molekul hemoglobin dalam 15 zona mulai dari katoda ke anoda dalam bentuk elektrophoregram (Gambar 5.)
Zona Elektroforesis Kapiler minicap Sebia
Z1 : Hb δA2, varian HbA2 Hasharon, varian HbA2 winnipeg, HbA2 Q-India,...
Z2 : HbC, Hb Constant Spring, varian HbA2 Setif,...
Z3 : HbA2, HbO-Arab,...
Z4 : HbE, Hb Koln, varian HbA2 M-Iwale, denaturasi HbC,...
Z5 : HbS, Hb Hasharon, Hb Handsworth, denaturasi HbO-Arab,...
Z6 : HbD-Punjab, Hb Lepore, Hb Korle-Bu, Hb Koln, denaturasi HbE,...
Z7 : HbF, Hb Porto-Alegre, denaturasi HbS,...
Z8 : Acetylated HbF, Hb Atlanta, Hb Athens-GA,...
Z9 : HbA, Hb Phnom penh, Hb Okayama,...
Z10: Hb Hope,HbM-Iwate,...
Z11: Hb Kaoshsiung, Hb Himeji, Denaturasi HbA,...
Z12: Hb Bart’s, Hb J-Providence, Hb J-Mexico, Hb J-Baltimore,...
Z13: HbJ-Rovigo, HbN-Baltimore,...
Z14: Hb N-Seattle,..
Z15: HbH, Hb I-Toulouse, Hb Sudbury,...
Gambar 5. Fraksi Hemoglobin dengan Minicap Elektroforesis Kapiler
(Sumber:Budiwiyono I. Pemeriksaan Hemoglobin Elektroforesis, JOGLOSEMAR V)1 Interpretasi Klinik
DAFTAR PUSTAKA
1. Budiwiyono I., Pemeriksaan Hemoglobin Elektroforesis, dalam Continuing Profesional Development on Clinical Pathology and Laboratory Medicine, JOGLOSEMAR ,. Solo, April 2013: 139-60.
2. Benz EJ Jr., Longo DL., Disorders of Hemoglobin, in Harrison’s Hematology and Oncology, Mc Graw Hill Medica, Bethesda, 2010: 81.
3. Ciesla B., Hematology in Practice, FA Davis Company, Philadelphia, 2007: 51-4.
4. Wirawan R., Analisa Hemoglobin Dengan Cara Konvensional dan Mikrokapiler Elektroforesis, Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia, Jakarta, 2011: 12-3, 41-4.
5. Sudiono., dkk., Hemoglobin, dalam Penuntun Patologi Klinik Hematologi, Biro Publikasi Fakultas Kedokteran Ukrida, Jakarta,2009: 43-7.
6. Mehta A. and Hoffbrand., A.Normal Blood Cells 1:Red Cells and Platelet, in Heamatology at a Glance London.Blackwell Science, 2000: 12-3.
7. Kit Minicap Hemoglobin, Capillarys Hemoglobin(E) Using The Capillarys Flex- Pierching Instrumen, Sebia, Perancis, diakses dari www.sebia.com.2014.
8. Klug,W.S. and M.R.Cummings., Concepts of Genetics, 4 th Ed, Prentice Hall, Englewood, 1994: 779.
9. Sachin Kuhire, National Chemical Laboratory, Pune.
10. Teori Elektroforesis Kapiler, dalam Jurnal Ilmiah Farmasi Metode Pemisahan Elektroforesis Kapiler, Selasa, 19 Oktober 2010.
11. Pratiwi R.. Mengenal Metode Elektroforesis. diakses dari www.
oseanografi.lipi.go.id. Oseana, Volume XXVI, Nomor 1, 2001: 25-31
12. Barbara J.W, Dacie and Lewis., Investigation of Abnormal haemoglobins and Thalassaemia, in Practical Haematology, Eleventh Edition, Imperial College Faculty of Medicine, London, 2012: 318-30.
