Designing and Constructing the Lentiviral Vector Coding miRNA- 499a and Transduction of Human Mesenchymal Stem Cells

(1)

21

Designing and Constructing the Lentiviral Vector Coding miRNA- 499a and Transduction of Human Mesenchymal Stem Cells

Vajiheh Neshati¹, Samaneh Mollazadeh², Bibi Sedigheh Fazly Bazzaz^3,4,

Majid Mojarrad^5,6 Zeinab Neshati⁷, Mohammad AminKerachian^8,9

1 PhD Candidate, Biotechnology Research Center, Mashhad University of Medical Sciences, Mashhad, Iran

2 PhD in Biotechnology, Biotechnology Research Center, Mashhad University of Medical Sciences, Mashhad, Iran

3 Professor, Biotechnology Research Center, Institute of Pharmaceutical Technology, Mashhad University of Medical Sciences, Mashhad, Iran

4 Professor, Pharmaceutical Control Department, School of Pharmacy, Mashhad University of Medical Sciences, Mashhad, Iran

5 Associate Professor, Medical Genetics Research Center, Mashhad University of Medical Sciences, Mashhad, Iran

6 Associate Professor, Department of Medical Genetics, Faculty of Medicine, Mashhad University of Medical Sciences, Mashhad, Iran

7 Assistant Professor, Department of Biology, Faculty of Science, Ferdowsi University of Mashhad, Mashhad, Iran

8 Assistant Professor, Medical Genetics Research Center, Mashhad University of Medical Sciences, Mashhad, Iran

9 Assistant Professor, Department of Medical Genetics, Faculty of Medicine, Mashhad University of Medical Sciences, Mashhad, Iran

(Received December 28, 2017 ; Accepted June 10, 2018)

Abstract

Background and purpose: Lentiviral vectors (LVs) are suitable candidates for gene delivery to cells with stable and high-level of transgene expression in target cells. MicroRNAs (miRNAs, miRs) are non-protein coding, short (~22 nucleotides) and single-stranded RNAs that act as post-transcriptional regulators of gene expression, and are involved in various cellular processes, including proliferation, differentiation and apoptosis. Several studies have shown that miR-499a promotes cardiac differentiation in cardiac stem cells. So, the aim of our study was to construct lentiviruses carrying miRNA-499a.

Materials and methods: Specific sequences of miRNA-499a (3p and 5p) were designed and constructed. Then, miRNA-499a was cloned into lentiviral vector. Analytical digestion and nucleotide sequence analysis were performed to ensure successful introduction of the miRNA to the vector. Then, the lentiviral particles produced (miRNA-499a-3p and miRNA-499a-5p) were used for transduction of human bone marrow-derived mesenchymal stem cells (hBM-MSCs).

Results: Analytical digestion and sequence analysis confirmed the accuracy of the constructs.

The high expression of eGFP represented the high efficiency of transfection and transduction. The lentiviral particles carrying miRNA-499a-3p/5p weremade and could transduce hBM-MSCs.

Conclusion: In this study we made lentiviral particles carrying miR-499a that could be used for differentiation of stem cells to cardiomyocytes.

Keywords: lentiviral vectors, MicroRNA, miRNA-499a-3p/5p, differentiation

J Mazandaran Univ Med Sci 2018; 28 (166): 21-29 (Persian).

* Corresponding Author: Bibi Sedigheh Fazly Bazzaz - Biotechnology Research Center, Institute of Pharmaceutical Technology, Mashhad University of Medical Sciences, Mashhad, Iran (E-mail: fazlis@mums.ac.ir)

[ Downloaded from jmums.mazums.ac.ir on 2022-10-31 ]

(2)

هرود هرامش متشه و تسيب 611

نابآ لاس 6931 ( 93 - 96 )

یحارط و

تخاس لماح

یتنل یسوریو نایب

هدننک

miRNA-499a

و

لاقتنا نآ

هب لولس یاه

یداینب یمیشنازم

ناسنا

یطاشن ههیجو 1

هدازلام هنامس 2

زازب یلضف هقیدص یب یب

3 و

4

درجم دیجم

5 و 6

یطاشن بنیز 7

نایچارک نیما دمحم

8 و 9

هدیكچ

هقباس :فده و ياهروتكو يتنل

يسوريو لماح لولس هب نژ لاقتنا يارب يبسانم ياه يم و هدوب اه

دنناوت ببس نايب و لااب

موادم نژ رد اه لولس ياه بزيم دنوش نا . زير ( اهRNA miRNAs

،) زا يهورگ ىاهRNA

ددك ريغ دنتدنه هدکوك هددننك

نايب هك نژ ار سپ زا ينيونور زا

قيرط راهم اي همجرت ءاقلا هديزجت لردتنكmRNA

دم و ددننك ددنينرآ قديرط ديا زا ياده

يتنيز يددعتم زا ار يلولس زيامت هلمج ميظنت

يم هداد نادشن يتاعلاطم .دنيامن ددنا

هدك

miRNA-499a

لولدس زيادمت رد ياده

لولس هب يداينب هدعلاطم ديا رد ،هددش ردكر بدلاطم هدب هجوت اب .دراد شقن يبلق ياه

يدتنل رودتكو تادس لدقان يدسوريو

miRNA-499a

لولس زيامت رد هدافتسا هج يبلق ياه

. آرگ رارق يسررب دروم

شور و داوم هتشر:اه

ياه 3p

و 5p

هدب طوبرم

miRNA-499a

ددش هتتادس و يدحارط ه

ه ديو ديمدسلاپ رد و نودلك يا

هتشر يا حيحص دورو زا نانيمطا يارب .دندش يلاودت و يدميزنن مدضه ،يديتوئلكون ياه

.دديدرگ مادجنا يبادي سسدس

تارر

يتنل هتشر لماح يسوريو ياده

miRNA-499a-3p

و 5p miRNA-499a-

دنددش هتتادس سناردت ياردب و

لولدس دشكاد ياده

ميشنازم .دنتآرگ رارق هدافتسا دروم ناننا ناوختسا زغم ي

هتفای :اه جياتن يلاوت و يميزنن مضه زا لصاح هتشر حيحص ندش نولك ،يباي

ياه 3p

و 5p

هب طوبرم

miRNA-499a

هب

نايب .دنداد ناشن ار ديمسلاپ لتاد يلااب

ناشنeGFP

هدنهد يياراك يلااب سنارت شکآ و سنارت شكاد دودب . ورديو ياده

هتشر لماح ياه

miRNA-499a-3p/5p

سنارت ببس دنتنناوت ،هدش هتتاس لولس شكاد

.دندرگ يميشنازم يداينب ياه

:جاتنتسا لماح هعلاطم يا رد يتنل ياه

لقان يسوريو

miRNA-499a-3p/5p

بدسانم نازديم هب هجوت اب هك ،دندش ديلوت

سنارت شكاد لولس يم ،يميشنازم يداينب ياه وت

لولس يا زيامت رد دننا لولس هب اه

.دنريگ رارق هدافتسا دروم يبلق ياه

:یدیلک یاه هژاو يتنل

زير ، وريو زيامت ،RNA

همدقم

ياهروتكو يفلتخم

هج لاقتنا نژ رد ياهددنينرآ

يراکتسد يکيتنژ

لولس اه دروم هدافتسا رارق يدم ددنريگ هك

هوحن ظاحل زا هدولن

دورو ،يزاس هب

س لول و مه يدنک

ياپ د يراد رد س د لول ياه م د بزي د

،نا اب ي د يدک د رگ توادفدتم

فلوم :لوئسم زازب یلضف هقیدص یب یب -

دهشم : راولب ليكو

،دابن سيدرپ

،هاگشناد هدکشناد

،يزاسوراد هورگ وراد لرتنك fazlis@mums.ac.ir

mail:

- E

1

،يژولونکتويب تاقيقحت زكرم ،يصصخت يارتكد يوجشناد . ناريا ،دهشم ،دهشم يکشزپ مولع هاگشناد

2 . زكرم ،يژولونکتويب يصصخت يارتكد تاقيقحت

ناريا ،دهشم ،دهشم يکشزپ مولع هاگشناد ،يژولونکتويب

3 . ناريا ،دهشم ،دهشم يکشزپ مولع هاگشناد ،يئوراد يژولونکت وتيتننا ،يژولونکتويب تاقيقحت زكرم ،داتسا

4 . د ،وراد لرتنك هورگ ،داتسا ناريا ،دهشم ،دهشم يکشزپ مولع هاگشناد ،يزاسوراد هدکشنا

5 . ناريا ،دهشم ،دهشم يکشزپ مولع هاگشناد ،يکشزپ هدکشناد ،يکشزپ هيتنژ هورگ ،رايشناد

6 . ناريا ،دهشم ،دهشم يکشزپ مولع هاگشناد ،يکشزپ هيتنژ تاقيقحت زكرم ،رايشناد

7 . د ،مولع هدکشناد ،يسانش نيز هورگ ،رايداتسا ناريا ،دهشم ،دهشم يسودرآ هاگشنا

8 . ،رايداتسا ،يکشزپ هيتنژ تاقيقحت زكرم ناريا ،دهشم ،دهشم يکشزپ مولع هاگشناد

9 . ،رايداتسا هدکشناد ،يسانش نيز هورگ يکشزپ

، ناريا ،دهشم ،دهشم يکشزپ مولع هاگشناد

: آايرد خيرات 17

/ 11 / 1396 : تاحلاصا هج عاجرا خيرات 17

/ 11 / 1396 : بيوصت خيرات 21

/ 3 / 1397

(3)

یطاشن ههیجو ناراکمه و

ناردنزام يكشزپ مولع هاگشناد هلجم

هرامش ،متشه و تسيب هرود 611

نابآ ، 6931 99

یشهوژپ

يم دنشاب . يکي زا بسانم يردت ادهروتكو ياردب

لادقتنا و

نايب نژ ياه

،رظن دروم ياهروتكو

يتنل يدسوريو يدم ددشاب .

زا مهم يرت ياهروتكو يتنل

يسوريو يياهروتكو دنتنه

هك رب هدياپ ورديو

HIV-1

هتتادس يدم دنودش . ورديو

هيHIV

رتر وريو و و

يوضع زا رديز يدتنل هداونادت

هديريو و سنج يتنل وريو اه دسا هدوب و

ياراد يرايدنب

تايصوصتزا يکيزيآ

ييايميشو ه يو يا هداونات يم ددشاب .

ياهروتكو يتنل

يسوريو يلباق لاقتنا نژ هب لولس ياده

لاحرد مينقت و ينچمه لولس يياه هك مينقت يمن دنوش

ار بس و دنراد ب

نايب موادم نژ اه رد لولدس ياده نادبزيم

يم دنوش

( 1

، 2

. )

يا اهروتكو هورگ ياده يلولدس يدددعتم

دننام لولس ياه هاگتسد يبصع

،يزكرم

،هيکبش ولدس ل ياده

، سلابوربيآ لولس

ياه تلاضع يتلکسا

،يبلقو لولس ياده

ددغ نورد

،زير لولس يدبك ياه و

ينچمه لولدس ياده

يداينب فلتخم دروم ار فده رارق يم دنهد . يادهروتكو

يتنل يسوريو روط ي يحارط يم دنوش هدك دميا هدودب و

رد نابزيم آايرد هدننك ببس يراميب داجيا ياه

بتردم

اب وريو دندرگن

( 3

.)

زير اهRNA

يهورگ زا ىاهRNA

هددننكدك رديغ

هکوك ( 24 - 21 يديتوئلكون )

دنتنه هك رد يرايدنب زا

تويراكوي اه

عب ه ناون ردصانع يدميظنت سدپ زا يدنيونور

آاي م ي دنوش و نايب نژ ار زا قديرط رادهم هدمجرت

mRNA

اي ءاقلا هيزجت نن لرتنك يم دننك . لوکلوم ياه

miRNA

اب لاصتا هب يلاوت لمکم يور فددهmRNA

رد هديحان

'

UTR-3

'(

untranslated region-3

) ىاددهتنا لوددکلوم

، mRNA

ببس ميدظنت يدفنم ناديب نژ سدپ زا يدنيونور

يددم دنوددش و زا دديا قدديرط نرآ دددني ياه يکيژوددلويزيآ

يددعتم زا هلمج ريثکت

،يلولس

،زيامت زوتپوپن و هرديغ ار

ميظنت يدم ددننك

( 4

، 5

.)

هداد نادشن تادعلاطم زدير هدك ددنا

ياهRNA

آاب زيامت و لماکت رد يددعتم فلتخم ياه

يم شقن يافيا تادوجوم ندب يزيامت رينم هعلاطم .دننك

هك سا هداد ناشن زين بلق زير

يادهRNA

رد يدفلتخم

نن ناديم رد هدك ،دنتدنه لديتد بدلق لدماکت و دشر اده

miR-499a

لولددس داددجيا رد ار يددمهم شددقن يددبلق يادده

يسويمويدراك(

يم ادفيا )اه ددنك

( 8 - 6

. ) miR-499a

دسوت

نژ

Myh7b

و هدددش دددك هداوناددت زا يوددضع

499 - miR

يم دحت هدش هتتانش وضع ود ياراد هداونات يا .دشاب

ناوددنع

miR-499a

و

miR-499b

يددم ياراد هددك دددشاب

هقاددس راتتاددس -

و هدوددب بوددل ، زادرددپ زا سددپ ود ردده

ياهديتوئلكونوگيلوا 3p

و 5p

يم داجيا ار .ددننك

miR-

لولس رد499a

نايب غلاب دارآا و نادازون ،ينينج يبلق ياه

نن نادديب و هدددش شيازددآا بددلق لددماکت لددحارم يددط رد

يم دباي

( –11 8

. )

لاقتنا

miR-499a

يادهروتكو هدمك هدب

يتنل لولس هب يسوريو رادياپ نايب ببس ،يداينب ياه

ديا

زير لولس ردRNA

دسا هدش روبزم ياه

( 9

، 11

مده .)

يدنک

زددير دديا يراددبجا نادديب لولددس ردRNA

يداددينب يادده

لولدس ه يو ياهرگناشن نايب شيازآا ببس ،فلتخم ياده

لولدس ديا زيامت و يبلق هدب اده

ويدراك يدسويم هددش اده

سا

( 11

.)

ورديو يتنل ياربانب لدماح ياده

miR-499a

يم لولس زيامت رد رثؤم يرازبا ناونعب دنناوت يدادينب ياه

لولس هب دديلوت ادب و ددنريگ راردق هدافتسا دروم يبلق ياه

يسويمويدراك نادمرد رد ،اه

يرادميب يدترب يدبلق ياده

هب ،بلق آاب بيسن اب بترم .دنوش هتآرگ راك

يا زا فده

هعلاطم يتنل ديلوت ، وريو

هتشر لماح ياه ياه

3p

و 5p

هب طوبرم

miRNA-499a

يم لولس رب رثا اب هك دشاب ياه

سنارت و يداينب نن شكاد

زدير يا يمياد نايب ببس ،اه

لولس ردRNA

.دنتشگ هدش كادننرت ياه هدافتدسا ادب

يددتنل لددماح دديا زا رادددياپ نادديب شيازددآا و يددسوريو

miRNA-499a

د لولددس ر ناوختددسا زددغم يداددينب يادده

،ناننا يم لولس يا زيامت تاعلاطم يارب ار هنيمز ناوت اده

لولس هب لولس زا ينامرد هدافتسا و يبلق ياه زيادمت ياده

. تاس مهارآ هتآاي

اه شور و داوم

. سا يبرجت هعلاطم هي رضاح هعلاطم ندرك نولك و تاس ،يحارط

miR-499a

يلاوت غلاب ياه

hsa-microRNA-499a

(

hsa-miR-

499a-3p

و

hsa-miR-499a-5p

) ياددددس زا

miRBase

(4)

(

http://www.mirbase.org/

ددب ) ه دديا زا و دددمن ددسد

يلاوت يدديتوئلكونوبيروگيلوا هتشر هي تاس يارب اه

،روبزم هتشر رد .دش هدافتسا بيترت هب

يلاودت هدب طودبرم

ميزنن رثا هاگياج

SgrAI

يلاوت ، ودکعم لدمکم يلاودت

هدددننكدك

hsa-miR-499a-3p

اددي

hsa-miR-499a-5p

،

ميزدنن ردثا هادگياج هب طوبرم يلاوت دب هدكXhoI

ه ناودنع

يم لمع بول ،دنك

هدننكدك يلاوت

hsa-miR-499a-3p

اددي

hsa-miR-499a-5p

، ياهددديتوئلكون لانگيددس هددكT

يارب ينيونور ناياپ

RNA polymerase III

يم دنشاب و

ميزدنن رثا هاگياج هب طوبرم يلاوت

EcoRI

.ددنتآرگ راردق

ادب و ددش هدتآرگ ردظن رد وردشيپ هتشر ناونع هب هتشر يا .دش هتتاس وريپ هتشر نن هب هجوت هرامش ريوصت

1 - ،فلا

يلاوت يلاوت و هدننكدك ياه ناشن ار وکعم لمکم ياه

يم .دهد نويساديربيه همادا رد مادجنا وردشيپ و وريپ هتشر ود

،نويدساديربيه شنكاو ماجنا يارب .دش ياهدديتوئلكونوگيلا

ورددشيپ و وردديپ دك

هدددننك

-3p/5p miR-499a

اددب لغ ددظ

111µM

،هيهت عادس هدي تدم هب و دندش طولخم و

سوت نويساديربيه لوصحم .دنتآرگ رارق قاتا يامد رد يددتنل روددتكو لتاددش دراو نويددساگيل دددنينرآ يددسوريو

SHC007

(

Sigma-Aldrich

ماددجنا يارددب .دددش )ناددملن ،

ميزنن سوت ديمسلاپ يا ادتبا نويساگيل ياده

EcoRI

و

SgrAI

يدم دادجيا هدنبنک ياهتنا ود ره هك ددننك

ردب

دش هداد رد هك نويساگيل شنكاو يط . يادمد

قادتا و هدب

تدم هي عاس و مين ماجنا اهديتوئلكونوگيلوا ، آرگ

دافتدسا ادب ميزدنن زا ه

T4 DNA lygase

(

Fermentase

،

هرامش ريوصت .دندش روتكو دراو ) اکيرمن 1

- هدشقن ،ب

روددتكو يددکيتنژ

SHC007

يددم ناددشن ار شنددكاو .دددهد

لدتاد هدب بيكرتون ياهروتكو دورو و نويسامروفننارت يرتكاب

Escherichia coli

هيوس

Gene Hog

هدافتدسا اب

نكاو .ديدرگ ماجنا يترارح کوش زا هب يميزنن مضه ش

يلاوت حيحص دورو دييأت روظنم هدب طودبرم ياده

-3p/5p

miR-499a

ظن دروم روتكو هب بديترت يددب .دش ماجنا ر

روتكو هك يدتنل ياه

دسوت ،طودبرم يدسوريو 4

ميزدنن

( ،AccI HaeII

، وPVuI

هددك )XhoI

يددم دنتددنناوت يددب

هنومن ياه روتكو يلصا ( هنومن يياه هك

miRNA

هب نن اه

دراو هدشن و اي يبيكرت دوت هدرك

دنا ) و يادهروتكو يوادح

miRNA

، توافت دادجيا

،ددننك ردب هداد دنددش . ياردب

ديمدسلاپ هدب هدش دراو ياهديتوئلكونوگيلوا يلاوت دييأت .دش هدافتسا رگنس يباي يلاوت ور زا زين بيكرتون

هرامش ریوصت 1

رميارپ يحارط: هتدشر ياردب ورديپ و ورشيپ ياه

ياده

هدددننك دددك miRNA-499a

نن ندرددك نوددلك و يددتنل لتاددش رد ادده

يلاوت :فلا ،يسوريو هتشر شور زبس ياه

زبدس و هددننك ددك ياده

يلاوت هريت يدم نادشن ار نن وکعم لمکم ياه زدمرق يلاودت .ددنهد

يروردض يردس قاجندس راتتادس ليکدشت و بودل دادجيا يارب گنر سا يلاوت و هاگياج زين گنر هايس ياه لکدش ار يدميزنن ردثا ياه

يم روتكو يکيتنژ هشقن :ب ،دنهد SHC007

شدخب نن رد هك ياده

ميزدنن ردب ياده هاگياج ،روتكو فلتخم ياده

EcoRI و SgrAI و

يريگرارق لحم miRNA-499a

. سا هدش هداد ناشن

شکآ سنارت لولس

ياه

HEK-293T

ادددتبا لولددس يادده

293T -

ردHEK

هددسلاآ يادده

cm2

175 شك و دندش ينادمز هدك مكاردت لولدس اده هدب

71 - 65 دصرد

،ديسر يحم دشکآ سنارت هدب

لولدس اده

(5)

نابآ ، 6931 92

یشهوژپ

هآاددضا .دددش دديا يددحم يواددح (NaCl

151mM

و )

يلپ ( يميا ليتا )PEI

PolysciencesEurope

،)نادملن،

لدماح ديمسلاپ

-3p/5p miR-499a

و ديمدسلاپ ود يدکمك

psPAX2

،

pLPVSVG

بدنن ادب بديترت هب 1:1:2

.دودب

سپ زا يريگرارق لولس

اه هب تدم 16 - 14 رد عاس يا

، يحم لولس کفننرت نازيم اده

دسوت بوکدسورکيم

نسرولآ يسررب دش . سسس يحم دشکآ سنارت يودعت

هدش و زا سپ وشتنش ي لولس اب اه هدب هزادت يدحمPBS

نن هآاضا اه يدرگ د .

شيازآا ظلغ و وري ياه هب سد هدمن

زا سپ 48 عاس

، شك يحم لولس

اه يوادح هك

دوب يسوريو تارر

، ژويفيرتناس لولس ات دش

دودجوم ياه

تارر ريدلغت و ويدلخت رودظنم هب .دندرگ فذح نن رد يتنل نوکلادآ هدب ورديو يواح شك يحم ،يسوريو

زوركوس و هدش لقتنم 21

هدب .دديدرگ هآادضا نن هدب دصرد

ود تدم عاس 15111 يامد رد هقيقد رد رود 4

هدجرد

يتناس وريو .دش ژويفيرتناس ارتلوا دارگ هب هديبنک ياه

رد نوکلاآ هت 511

رتيلوركام (BSA

1 و دش لح )دصرد

رزيرآ رد 81°C

- .دندش يرادهگن

سنارت لولس شكاد يميشنازم يداينب ياه

لولس ياده يدادينب نادننا ناوختدسا زدغم يميدشنازم

(

hBM-MSCs

) زا ،هدش يصوصت ييعت تاقيقحت زكرم

لولس يهاگدشناد دادهج يدميمرت يکدشزپ و يدادينب ياه

لولس .دندش هيهت دهشم ياه

ژاساپ زا زاين دروم 3

باختنا

دش و هب دادعت 113

× 5 دشك دنددش . دوددح 48 عادس

سپ زا شك لولس

،اه نازيم نن اه هدب يددح ديدسر هدك

دودددح 81 دددصرد فددك هددسلاآ ار دندناددشوپ .

دديا رد

لولس هلحرم ياه

روكذم اب وريو ياه لرتنك ( ورديو

زير نودب )RNA

، وريو ياده لدماح

miR499a-3p

و

mir499a-5p

اب ظلغ

µl/ml

3 هدب روط هدناگادج رادميت

دندش . يدحم يوادح ورديو هدب تددم 16 عادس رد

ضرعم لولس اه رارق آرگ و سپ زا نن هدب رودط لدماك هتشادرب

دش و لولس اده هدس هدبترم ادب ودشتنشPBS

هداد

هددب ،ندددش نن

ادده يددحم ددشك يلوددمعم يواددح

FBS

( 11 )دصرد هآاضا يياراك .دش سنارت

شكاد اب هدافتسا

زا رودددن ندددسرولآ زبدددس

طادددس هددددش دددسوت

eGFP

(

enhanced Green Fluorescent Protein

،) 72 عاس

سپ زا ريثأت

، وريو يسررب دش .

اه هتفای

يلاوت حيحص دورو دييأت هب طوبرم ياه

miR-499a-3p

و

miR-499a-5p

يدتنل ياهروتكو لدماح يدسوريو

miRNA-499a-

3p/5p

،لرتنك و سوت

4 ( ميزدنن ،AccI HaeII

،

PVuI

و يددکيتنژ هددشقن هددب هددجوت اددب .دندددش هداد رددب )XhoI

يلاوت لماح روتكو ياه

-3p/5p miR-499a

تروص رد ،

يلاوت حيحص دورو ادب هبادشم يياهددناب ددياب روتكو هب اه

هرامددش ريوددصت 2

- نن زا .ددرددگ داددجيا فددلا هددك يياددج

نولك زا رظن دروم ياهروتكو هدمن سدب يفلتخم ياه

رودط هدب هدك يياده روتكو يميزنن مضه شنكاو ،دندوب ار دددندوب هدرددك ددآايرد ار اهددديتوئلكونوگيلوا حيحددص هرامش ريوصت( درك دييأت 2

- كاو .)ج و ب يلاوت شن

يباي

ياهدديتوئلكون يدب رد شدهج مددع ددييأت روظنم هب هك هدددش دراو يلاوددت حددص اددهنت دددش ماددجنا رددظن دروددم حيحددص ياددهروتكو .درددك دددييأت ار اددهروتكو يددترب رد يلاوت لماح ياه

-3p/5p miR-499a

يدتنل تادس يارب

وريو .دندش هدافتسا هطوبرم ياه

(6)

ميزدنن دسوت يدميزنن مدضه زا لصاح جياتن: ياده

،ICCA HaeII ، وPVuI رادظتنا درودم ياده ددناب هزادنا :فلا ،XhoI

ميزنن رثا زا سپ هنومن رب اه

هددش دادجيا ياه دناب :ب ،فلتخم ياه

د يميزنن مضه زا لصاح نودلك ر

زا فدلتخم ياده miR-499a-3p

،

:ج miR-499a-5p نولك ،

نادشن يدنيلگنا فوردح ادب فدلتخم ياه

،دنا هدش هداد مادجنا نن يور ردب يميزنن مضه هك يلصا روتكو(V

.) سا هدش

شکآ سنارت ياه لولس

HEK-293T

سنارت جياتن لولس شکآ

ياده

HEK-293T

نادشن

دودددح هددك داد 91

لولددس زا دددصرد يادده

HEK-293T

،

يم نايب ارeGFP

هرامش ريوصت( دننك 3

- .)فلا

سنارت لولس شكاد ياه

يميشنازم يداينب

سنارت جياتن لولس شكاد

يميدشنازم يدادينب ياده

يدتنل تارر ضرعم رد هك ددندوب هدتآرگ راردق يدسوريو

دودددح رد هددك داد ناددشن 81

لولددس دددصرد زا سددپ ادده

زور هس شذگ نايب ارeGFP

هرامش ريوصت( دندرك 3

-

نن زا .) ب يلااب نايب هك يياج

ناديب هددنهد ناشنeGFP

نژ يلااب يم نن هارمه هدش نولك ياه لولدس ،دشاب

ياده

يبدسانم نازديم هب دنتنناوت يميشنازم يداينب

miR-499a-

3p/5p

.دننك نايب ار

نايب يسررب: ا .eGFP

نايب :فل لولدس ردeGFP

ياده

HEK-293T لولددس :ب ،

رد هددك روطناددمه .يميددشنازم يداددينب يادده

يم هدهاشم ريوصت دودح دوش

81 لولس دصرد ياه

HEK-293T و

71 لولس دصرد يميشنازم يداينب ياه

eGFP+

ار زبدس گدنر و هدوب

هداد ناشن .دنا

ثحب

وتكرافنا زا يبلق

للع گرم هدمع و

ريم رد ناهج

نوددت مدددع اددي شهاددك ددلع هددب و هدوددب رد يناددسر

شخب لولدس هدب بيدسن نن بقاعتم و بلق زا يياه ياده

يبلق ددرگ يم داجيا

( 12

يکدشزپ مدهم فادها زا يکي .)

يرادميب ادب بترم يميمرت دآاب ميمردت ،يدبلق ياده

ياده

ددج و هددديد بيددسن نن ندوددمن يزگيا

لولددس اددب ادده يادده

يم يدرکلمع دشاب

( 13

بادنم .)

يلولدس هدلمج زا يدددعتم

لولددس يادده يداددينب يددنينج و

،غلاددب هددب زياددمت يياددناوت

يسويمويدراك هدب دنويپ زا سپ بلق درکلمع دوبهب و اه

ار نن دددنراد

( 14 ، 15

هددب ).

ددسد ندرون دادددعت يدادديز

دنمزاين يسويمويدراك يلادمعا

نودک ءادقلا لولدس ياده

يداينب رد يارش

in vitro

و هدافتسا زا ور يياه ددننام

دورو نژ هب يا لولس اه و زيامت دنمآده نن اه سا . ادب

يتنل دننام يسوريو ياهروتكو زا هدافتسا وريو

يدم اه

ادم ءاقلا ناوت نژ يگشيمه نايب و مو

رد ردظن درودم ياه

لولس دش ببس ار فده ياه

( 12

.)

هعلاطم رينم يزيامت بلق ناشن يم ددهد هدك نژ ،اده

زير اهRNA

و يددعتم لماوع رد

يودکت و لدماکت

،بدلق

زيامت لولس ياه يبلق و داجيا يدسويمويدراك اده

لديتد

دنتنه

( 16

هداد ناشن يون تاعلاطم نايم يا رد).

زدير هدك دنا

يدسويمويراك دادجيا و زيادمت ببس يددعتم ياهRNA

اده

يم نن ناديم زا هدك دنوش شدقن اده

miR-499a

لديلد هدب

(7)

نابآ ، 6931 91

یشهوژپ

زيادمت ادب بتردم هدناگدنک يلولدس ياهريدنم رد كرش لولس دسا هدجوت لدباق ،يبلق ياه

( 17

بدلاطم هدب هدجوتاب .)

،هعلاطم يا رد هدش ركر لماح تاس

يدتنل ياده يدسوريو

لددقان

miRNA-499a-3p

و -5p miRNA-499a

ددهج

لولس ءاقلا نا يميشنازم يداينب ياه

نان رارق يسررب دروم

يدب . آرگ هتشر يلاوت روظنم

ياه 3p

و 5p

هدب طودبرم

miRNA-499a

ديمددسلاپ رد و هدددش هتتاددس و يددحارط

ه يو .دندش نولك يا يلاوت و يميزنن مضه زا لصاح جياتن نودلك ،يبادي

هتدشر حيحص ندش ياده

3p

و 5p

هدب طودبرم

miRNA-

يدتنل ديمدسلاپ لتاد هب499a

ار يدسوريو .ددنداد نادشن

يتنل تاس زا سپ وريو

لولس رب رثا و اه يداينب ياه

سناردت ييارادك ،نادننا ناوختسا زغم يميشنازم دشكاد

وريو هدك داد نادشن جياتن و دش دييأت هدش هتتاس ياه

لولس زا يدايز دادعت هتدنناوت يميشنازم يداينب ياه

ددنا

زير لماح وريو .دننك آايرد ارRNA

علاطم هداد نادشن يدايز تا هدك ددنا

miRNA-499a

يکيژولوتاددپ و يکيژوددلويزيآ ياهدددنينرآ زا يرايدنب رد يم و هتشاد شقن ندب يتدنيز رگناشن هي ناونع هب دناوت

يراميب يترب رد دريگ رارق هجوت دروم اه

( 18

ناودنع هدب .)

ديا ناديب لاثم زدير

زدغم دآاب بيدسن مادگنه ردRNA

هددتآاي شيازددآا يددم لااددب نن يمرددس حطددس و

دور

( 19 ، 21

. )

هداد نادشن زدين يرگيد تاعلاطم ناديب هدك ددنا

miRNA-

يم رييغت ناطرس زا يعاونا رد يصخشم روطب499a

ددنك

،ددشر رد يرادهم لدماع هدي ناودنع هب نن يلااب نايب و لولس ترجاهم و ريثکت و هير ناطرس دننام يناطرس ياه

يدم لمع هنيس ددنك

( 21

. )

رد ،ددش ردكر هدك رودط نادمه

ديا يدردکلمع شقن تاعلاطم زا يراينب زدير

ردRNA

لولس زيامت و بلق لماکت دنينرآ يدسررب زدين يدبلق ياده

لوکلوم . سا هدش

miRNA-499a

نايب لرتنك يداددعت

نژ زا شدقن ردما ديا هك دراد هدهع رب ار يبلق ه يو ياه

لودکلوم يا مهم يدم دشور بدلق زيادمت رد ار يتدنيز

دزاس

( 11

. )

شيازآا يرابجا نايب

miR-499a

، ببس يرنت

و آرشيپ زيامت لولس ياه يداينب هب يسويمويدراك اده

يم دوش . يعاونا زا لولس ياه يداينب مه لولس نوک ياده

يداينب لولس ،ينايور ياه

يداينب يبلق ناننا و لولس ياه

يداينب يميشنازم

،تر اب وريو يتنل ياه

لدماح

miR-

ءاقلا499a

هددش و هدب يدسويمويدراك اده

غلادب و ياراد

درکلمع زيامت هدتآاي ددنا

( 9 ، 11 ، 12

.)

تادعلاطم ادسا ردب

سنارت نونكات لولس شكاد

يميدشنازم يدادينب ياه زدغم

اب ناننا ناوختسا يتنل

وريو ياه لدماح

miR-499a

و

هتشر ياه 3p

و 5p

زا . دسا هددشن مادجنا نن هدب طودبرم

نن سنارت يياراك هك يياج لولدس دشكاد

يدادينب ياده

ورديو يتنل سوت ناننا ناوختسا زغم يميشنازم ياده

يم ، سا هدوب لااب هدش هتتاس وريو يا زا ناوت

رد اده

علاطم لولس زيامت هب طوبرم تا ياهدربراك و يداينب ياه

نن ينامرد هرامدش ريوصت( دومن هدافتسا اه

3 - يدنچمه .)ب

ءاددقلا

hBM-MSCs

، وردديو يددتنل ددسوت لددماح يادده

هتشر ياه 3p

و 5p miR-499a

، يم توادفتم شدقن دناوت

هتشر ياه 3p

و 5p

لولس يا زيامت دنينرآ رد ار وخدشم اه

.دزادس لادس رد ادده پ ،رديتا ي يددميمرت يکدشز

، فددده ادب

آاب ينيزگياج ياراد و هددنز يتآاب اب هتآر سد زا ياه

هتاش زا يکي ناونع هب ،بسانم درکلمع ياده

مدهم مدلع

يکشزپ

، يراميب نامرد رد يراميب هلمجزا فلتخم ياه

ياده

لولس زا هدافتسا . سا هدش قاو هجوت دروم ،يبلق ياده

نن ءاقلا و يداينب دسوت اده

زدير ادب ادهRNA

هدجوت هدب

ياهدركراك مهم

نن يم ،اه درکلمع دناوت يا

لوکلوم اه

رد هددنيهب و هداد ناددشن ار زياددمت دددنينرآ زياددمت يزاددس

لولس آاب هب يداينب ياه .ددرگ ببس ار رظن دروم ياه

یرازگساپس

يارددتكد هددمان ناددياپ هژورددپ زا يتمددنق هددعلاطم دديا يکشزپ مولع هاگشناد يصصخت يدشهو پ پردط( دهدشم

هرامش 911787 تادقيقحت زكرم يلام يامح اب و هدوب )

هددش مادجنا دهدشم يکدشزپ مولع هاگشناد يژولونکتويب زا ار دوددت ينادردددق بددتارم هددلاقم ناگدنددنيون . ددسا ،يژولويدراددك هاگددشيامزن ءاددضعا هناميمددص يراددکمه يم ملاعا دنله نديلا يکشزپ هاگشناد زكرم .دنراد

(8)

References

1. Barth AS, Kizana E, Smith RR, Terrovitis J, Dong P, Leppo MK, et al. Lentiviral vectors bearing the cardiac promoter of the Na+-Ca2+

exchanger report cardiogenic differentiation in stem cells. Mol Ther 2008; 16(5): 957-964.

2. Limoni SK, Salimi F, Moghaddam MF.

Designing pLEX-LAMP-DARPin Lentiviral Vector for Exression of HER2 Targeted DARPin on Exosome Surface. J Mazandaran Univ Med Sci 2017; 27(151):12-23 (Persian).

3. Allahverdi A, Abroun S, Jafarian A, Soleimani M, Taghikhani M, Eskandari F. Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells into Insulin Producing Cells by Using A Lentiviral Vector Carrying PDX1. Cell J 2015; 17(2): 231-242.

4. Wahid F, Shehzad A, Khan T, Kim YY.

MicroRNAs: Synthesis, mechanism, function, and recent clinical trials. Biochim Biophys Acta 2010; 1803(11): 1231-1243.

5. Zheng S, Zhang S, Song Y, Guo W, Zhai W, Qiu X, et al. MicroRNA-297a regulates vascular calcification by targeting fibroblast growth factor 23. Iran J Basic Med Sci 2016;

19(12): 1331-1336 (Persian).

6. Tao L, Bei Y, Zhou Y, Xiao J, Xinli L. Non- Coding RNAs in Cardiac Regeneration.

Oncotarget 2015; 6(40): 42613–42618.

7. Tian J, An X, Niu L. Role of microRNAs in cardiac development and disease. Exp Ther Med 2017; 13(1): 3-8.

8. Jakob P, Landmesser U. Role of microRNAs in stem/progenitor cells and cardiovascular repair. Cardiovasc Res 2012;(4): 614-422.

9. Hosoda T, Zheng H, Cabral-Da-Silva M, Sanada F, Ide-Iwata N, Ogórek B, et al. Human cardiac stem cell differentiation is regulated by a mircrine mechanism. Circulation 2011;

123(12): 1287-1296.

10. Wilson KD, Hu S, Venkatasubrahmanyam S, Fu J, Sun N, Abilez OJ, et al. Differentiation of Human Embryonic Stem Cells Role for miR-499. Circ Cardivasc Genet. 2010;

3(5):426–435.

11. Li X, Wang J, Jia Z, Cui Q, Zhang C, Wang W, et al. MiR-499 regulates cell proliferation and apoptosis during late-stage cardiac differentiation via Sox6 and cyclin D1. PLoS One 2013; 8(9): e74504.

12. Zhang L lu, Liu J jin, Liu F, Liu W hua, Wang Y shun, Zhu B, et al. MiR-499 induces cardiac differentiation of rat mesenchymal stem cells through wnt/β-catenin signaling pathway. Biochem Biophys Res Commun 2012; 420(4): 875-881.

13. Moran AE, Forouzanfar MH, Roth GA, Mensah GA, Ezzati M, Flaxman A, et al. The global burden of ischemic heart disease in 1990 and 2010: the global burden of disease 2010 study. Circulation 2014; 129(14): 1493- 1501.

14. Gimble JM, Katz AJ, Bunnell BA. Adipose- derived stem cells for regenerative medicine.

Circ Res 2007;100(9):1249–1260.

15. Rajala K, Pekkanen-mattila M, Aalto-set K.

Cardiac Differentiation of Pluripotent Stem Cells. Stem Cells Int 2011; 2011(1).

16. Serradifalco C, Zummo G, Felice V.

MicroRNA and Cardiac Stem Cell Therapy. J Clin Exp Cardiolg 2012; S11.

17. Fu JD, Rushing SN, Lieu DK, Chan CW, Kong CW, Geng L, et al. Distinct roles of microRNA-1 and-499 in ventricular specification and functional maturation of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes.

PLoS One 2011; 6(11): e27417.

18. Xin Y, Yang C, Han Z. Circulating miR-499

(9)

نابآ ، 6931 93

یشهوژپ

as a potential biomarker for acute myocardial infarction. Ann Transl Med 2016; 4(7): 7–10.

19. Hu Z, Yu D, Almeida-suhett C, Tu K, Marini AM, Eiden L, et al. Expression of miRNAs and Their Cooperative Regulation of the Pathophysiology in Traumatic Brain Injury.

Plos One 2012; 7(6): e39357.

20. You WD, Tang QL, Wang L, Lei J, Feng JF, Mao QY, et al. Alteration of microRNA expression in cerebrospinal fl uid of

unconscious patients after traumatic brain injury and a bioinformatic analysis of related single nucleotide polymorphisms. Chin J Traumatol 2016; 19(1): 11-15.

21. Li M, Zhang S, Wu N, Wu L, Wang C, Lin Y. Overexpression of miR-499-5p inhibits non-small cell lung cancer proliferation and metastasis by targeting VAV3. Nat Publ Gr 2016; 1-10.