/
162هرود ،ﻪﺘﻓﺎﯾ 22
، ز نﺎﺘﺴﻣ 99
:ﻪﺒﺗﺎﮑﻣ سردآ*
ﯽﮑﺷﺰﭘ هﺪﮑﺸﻧاد ،ﯽﮑﺷﺰﭘ مﻮﻠﻋ هﺎﮕﺸﻧاد ،ﺪﻬﺸﻣ .ﯽﮑﺷﺰﭘ ﮏﯿﺘﻧژ تﺎﻘﯿﻘﺤﺗ ﺰﮐﺮﻣ ،
ﺖﺴﭘ :ﮏﯿﻧوﺮﺘﮑﻟا [email protected]
توا كﺎﻧ ﯽﻟﻮﻠﺳ هدر ﺪﯿﻟﻮﺗ ﯽﻧژ ﺶﯾاﺮﯾو ﮏﯿﻨﮑﺗ ﻂﺳﻮﺗ
IDUACRISPR/Cas
ردﺮﺑ ﯽﻤﺗﺎﺣ ﯽﻠﻋ داﮋﻧ ﯽﻤﯿﻈﻋ ﻦﺴﺤﻣ ، 1
ﺎﯿﻧ يﺮﻔﻌﺟ ﯽﺒﺘﺠﻣ ، 2
زردﻮﮔ ﺎﺿرﺪﯿﻤﺣ ، 3
ي ، 3
دﺮﺠﻣ ﺪﯿﺠﻣ
4
1 - ﻮﺠﺸﻧاد اﺮﺘﮐد ي ، هوﺮﮔ ﺖﺴﯾز
،ﯽﺳﺎﻨﺷ ﺪﺣاو
،ﺖﺷدوﺮﻣ هﺎﮕﺸﻧاد دازآ
،ﯽﻣﻼﺳا
،ﺖﺷدوﺮﻣ ناﺮﯾا
2 -
،رﺎﯾدﺎﺘﺳا هوﺮﮔ مﻮﻠﻋ ﻪﯾﺎﭘ ﺷﺰﭘ
،ﯽﮑ هﺎﮕﺸﻧاد مﻮﻠﻋ ﯽﮑﺷﺰﭘ
،رﻮﺑﺎﺸﯿﻧ
،رﻮﺑﺎﺸﯿﻧ ناﺮﯾا
3 - ،رﺎﯾدﺎﺘﺳا هوﺮﮔ ﺖﺴﯾز
،ﯽﺳﺎﻨﺷ ﺪﺣاو
،ﺖﺷدوﺮﻣ هﺎﮕﺸﻧاد دازآ
،ﯽﻣﻼﺳا
،ﺖﺷدوﺮﻣ ناﺮﯾا
4 - ،رﺎﯾدﺎﺘﺳا هوﺮﮔ ﮏﯿﺘﻧژ
،ﯽﮑﺷﺰﭘ هﺪﮑﺸﻧاد
،ﯽﮑﺷﺰﭘ هﺎﮕﺸﻧاد مﻮﻠﻋ ﯽﮑﺷﺰﭘ
،ﺪﻬﺸﻣ
،ﺪﻬﺸﻣ ناﺮﯾا
هرود / ﻪﺘﻓﺎﯾ 22
هرﺎﻤﺷ / 4
/ ز نﺎﺘﺴﻣ 99
ﻠﺴﻣ / ﻞﺴ
86
:ﻪﻟﺎﻘﻣ ﺖﻓﺎﯾرد 21
/ 8 / 99 :ﻪﻟﺎﻘﻣ شﺮﯾﺬﭘ 24
/ 9 / 99
:ﻪﻣﺪﻘﻣ
ﭗﯿﺗ زوﺪﯾرﺎﮐﺎﺳ ﯽﻠﭘﻮﮐﻮﻣ (MPSI) I
يرﺎﻤﯿﺑ ﻊﯾﺎﺷ دﻮﺒﻤﮐ ﻪﻄﺳاو ﻪﺑ ﻪﮐ ﺖﺳا ﯽﻣوزوﺰﯿﻟ يا هﺮﯿﺧذ ﺎـﻔﻟآ ﻢﯾﺰـﻧآ
-ا ل زاﺪـﯿﻧوروﺪﯾا–
(IDUA) موزﻮﻣوﺮﮐ يور ﺮﺑ 4
) 4p16.3 (ا ﻪﯾﺰﺠﺗ رد ﻢﯾﺰﻧآ ﻦﯾا .ددﺮﮔ ﯽﻣ دﺎﺠﯾ ﮑﯿﻠﮔ
ﺎﻣرد يﺎﻫﺪﯾرﺎﮐﺎـﺳ ﯽﻠﭘﻮـﮐﻮﻣ ﺎـﯾ ﺎـﻬﻧﺎﮑﯿﻠﮔﻮﻨﯿﻣآزﻮ نﺎـﺗ
ﺖﻟﺎﺧد تﺎﻔﻟﻮﺳ نارﺎﭙﻫ و تﺎﻔﻟﻮﺳ دراد
و ﺎـﻫ نﺎﮑﯿﻠﮔ ﻮﻨﯿﻣآ زﻮﮑﯿﻠﮔ ﺢﻄﺳ ﺶﯾاﺰﻓا ﻪﺑ ﺮﺠﻨﻣ رﻮﮐﺬﻣ ﻢﯾﺰﻧآ رد ﺺﻘﻧ (GAG)
ـﻤﺠﺗ و نﻮـﺧ رد ﻊ
دﻮﺷ ﯽﻣ نﺪﺑ ﻒﻠﺘﺨﻣ يﺎﻀﻋا رد نآ و ﯽﻟﻮﻠﺳ جرﺎﺧ ﺲﮑﯾﺮﺗﺎﻣ يرﺎﺘﺧﺎﺳ يﺎﻨﺑﺮﯾز ﯽﻧﺎﮑﯿﻠﮔﻮﺌﺗوﺮﭘ تﺎﺒﯿﮐﺮﺗ ﻦﯾا.
ﻣ ﯽﻃﺎﻘﻧ ﯽﻓوﺮﻀﻏ رﺎﺘﺧﺎﺳ ﻞـﺜ
ﻪﭽﯾرد ،ﻞﺻﺎﻔﻣ ﯽﻣ ﻢﻫاﺮﻓ ار ﯽﺒﻠﻗ يﺎﻫ
ﻢﺘـﺴﯿﺳ ﺎـﻣ ﻪـﻌﻟﺎﻄﻣ ﻦـﯾا رد .دراد ﺶﻘﻧ ﯽﻟﻮﻠﺳ تﺎﻃﺎﺒﺗرا ﻢﯿﻈﻨﺗ رد هوﻼﻌﺑ ؛ﺪﯾﺎﻤﻧ CRISPR/Cas
ر ا
ﻢﯾﺰﻧا هﺪﻨﻨﮐ ﺪﮐ نژ ﻪﮐ ﻢﯾدﺮﮐ ﯽﺣاﺮﻃ هداد راﺮﻗ فﺪﻫ درﻮﻣ ارIDUA
ﺖﺳا ﯿﻨﮐ ﺪﯿﻟﻮﺗ ار نژ ﻦﯾا توا كﺎﻧ يﺎﻫﻮﻠﺳ ﻢﯿﺘﺴﻧاﻮﺗ ﺎﻣ و .ﻢ
شور و داﻮﻣ :ﺎﻫ
اﺪﺘﺑا sgRNA فﺪﻫ ردIUDA ﺪﯿﻤﺳﻼﭘ px335 نﻮﻠﮐ ﺎﺑ ،ﺪﺷ هدﺎﻔﺘﺳا زا ﻪﺸﻘﻧ يرادﺮﺑ
،هﺪﻨﻨﮐدوﺪﺤﻣ ﺮﺗﻮﻧ ﺪﯿﻤﺳﻼﭘ
ﺐـﯿﮐ
ﺪﯿﯾﺄﺗ ﺪﺷ . ﺪﯿﻤﺳﻼﭘ ﺲﭙﺳ ﺐﯿﮐﺮﺗﻮﻧ
ﻪﺑ هدر لﺎﯿﻠﺘﯿﭘا ﯽﻟﻮﻠﺳ
،ﯽﻧﺎﺴﻧا HEK-293 ﺖﮑﻔﺴﻧاﺮﺗ
ﺪﺷ . يﺎـﻫ نﻮـﻠﮐ ﺶـﻬﺟ
ﻪـﺘﻓﺎﯾ ﺗ ﺰﯿﻟﺎـﻧآ ﻂـﺳﻮ
melting يﺮﮕﻟﺎﺑﺮﻏ ﺪﻧﺪﺷ و ﺶﻬﺟ ﺎﻬﻧآ ﺎﺑ ﻦﯿﯿﻌﺗ ﯽﻟاﻮﺗ ﺮﮕﻨﺳ ﺺﺨﺸﻣ ﺪﺷ .
ﻪﺘﻓﺎﯾ :ﺎﻫ
ﻦﯿﯿﻌﺗ و ﯽﻤﯾﺰﻧآ ﻢﻀﻫ ﯽﻟاﻮﺗ
،ﺮﮕﻨﺳ يﺎﻘﻟا ﺶﻬﺟ لﺪﻨﯾا ار رد ود نﻮﻠﮐ تﻮﮕﯾزوﺮﺘﻫ و
ﮏﯾ نﻮﻠﮐ تﻮﮕﯾزﻮﻤﻫ ﺪﯿﯾﺎﺗ
دﺮﮐ .
ﻪﺠﯿﺘﻧ و ﺚﺤﺑ يﺮﯿﮔ
:
رد ﻦﯾا
،ﻪﻌﻟﺎﻄﻣ ﺎﻣ ﺎﺑ هدﺎﻔﺘﺳا زا ﻢﺘﺴﯿﺳ CRISPR-Cas9 ﮏﯾ
لﺪﻣ ﯽﻟﻮﻠﺳ مرﺪﻨﺳ ﻫ ﺮﻟرﻮ ﺪـﯿﻟﻮﺗ ﻢﯾدﺮـﮐ ﻦـﯾا ﻪـﮐ
لﺪﻣ ﯽﻣ ﺪﻧاﻮﺗ دﺮﮑﯾور رد هدﺎﻔﺘﺳا ﺖﻬﺟ يﺎﻫ
يرﺎﻤﯿﺑ ﻦﯾا ﯽﻧﺎﻣرد هدﺎﻔﺘﺳا
دﻮﺷ .
هژاو يﺪﯿﻠﮐ يﺎﻫ :
مرﺪﻨﺳ
،ﺮﻟﺮﻫ CRISPR-Cas
، نژ كﺎﻧ
،توا .IDUA
هﺪﯿﮑﭼ
/
163هرود ،ﻪﺘﻓﺎﯾ 22
، نﺎﺘﺴﻣز 99
ﻪﻣﺪﻘﻣ
مرﺪﻨــﺳ ﺮﻟرﻮــﻫ ) (HS
ﺎــﯾ ﻦﯾﺮــﺗ ﻊﯾﺎــﺷMPSI
ﻞﮑــﺷ
تﻻﻼﺘﺧا هﺮﯿﺧذ
ﯽـﻣوزوﺰﯿﻟ )
(LSD
ﺖـﺳا ) 1 (.
ﻦـﯾا زوﺮـﺑ
لﻼﺘﺧا ﮏﯾ درﻮﻣ رد ﺮﻫ 100000 ﺪﻟﻮﺗ
ﺖـﺳا هﺪﻧز .
ردHS
ﻪﺠﯿﺘﻧ زا ﺖﺳد نداد ﺶﻬﺟ يﺎﻫ يدﺮﮑﻠﻤﻋ رد
نژ ﺎﻔﻟآ - 1 -
زاﺪﯿﻧوروﺪﯾا )
(IDUA
خر ﯽـﻣ ﺪـﻫد . ﺎـﻔﻟآ - 1 - زاﺪـﯿﻧوروﺪﯾا
ﺰﯿﻟورﺪﯿﻫ ﯽﯾﺎﻬﻧﺎﮑﯿﻠﮔﻮﻨﯿﻣآزﻮﮑﯿﻠﮔ
ﺪﻨﻧﺎﻣ تﺎﻔﻟﻮﺳ نﺎـﺗﺎﻣرد و
تﺎﻔﻟﻮﺳ نارﺎﭙﻫ ار ﺰﯿﻟﺎﺗﺎﮐ ﯽﻣ ﺪﻨﮐ . لﻼﺘﺧا رد ﺖﯿﻟﺎﻌﻓ ﻦـﯾا
نژ ﺮــﺠﻨﻣ ﻪــﺑ ﻊــﻤﺠﺗ نﺎــﮑﯿﻠﮔﻮﻨﯿﻣآزﻮﮑﯿﻠﮔ ﯽﺠﯾرﺪــﺗ رد
موزوﺰﯿﻟ ﺎﻫ و رد ﻪﺠﯿﺘﻧ ﺐﯿﺳآ و زا رﺎﮐ ندﺎـﺘﻓا ماﺪـﻧا يﺎـﻫ
ﻒﻠﺘﺨﻣ ﯽﻣ دﻮﺷ ) 2 (.
نﺎﮐدﻮﮐ ﻼﺘﺒﻣ ﻪﺑ زاMPSI
وﺪﺑ ﺪﻟﻮﺗ ﯽـﻌﯿﺒﻃ ﻪـﺑ ﺮـﻈﻧ
ﯽﻣ رد ﺎﻣا ﺪﻨﺳر ﻦﺳ
12 ﺎﺗ 24
،ﯽﮕﻫﺎـﻣ ﻒـﯿﻃ ﯽﻌﯿـﺳو زا
ﻢﺋﻼﻋ ﺪﻨﻧﺎﻣ ﺮﯿﺧﺄﺗ رد
،ﺪﺷر
،ﯽﻟﺎﻔـﺳوﺮﮐﺎﻣ يرﺎـﺠﻨﻫﺎﻧ
يﺎـﻫ
ﻪـــﭽﯾرد
،ﺐـــﻠﻗ
،ﻦـــﺸﺧ ترﻮـــﺻ ﯽﻟﺎﮕﻣﻮﻨﻠﭙـــﺳﻮﺗﺎﭙﻫ
و
ﯽﺳﻮﻠﮔوﺮﮐﺎﻣ ار
نﺎﺸﻧ ﯽﻣ ﺪﻨﻫد . نوﺪﺑ
،نﺎﻣرد ﺮﺜﮐا نارﺎﻤﯿﺑ
ﻂﻘﻓ ﺎﺗ ﺮﺧاوا ﯽﮐدﻮﮐ ز هﺪﻧ ﯽﻣ ﺪﻨﻧﺎﻣ . يرﺎﻤﯿﺑ يﺎـﻫ ﯽـﺒﻠﻗ و
داﺪﺴﻧا يرﺎﺠﻣ ﯽﺴﻔﻨﺗ هﺪﻤﻋ ﻦﯾﺮﺗ ﻞﯾﻻد گﺮﻣ و ﻦـﯾا ﺮـﯿﻣ
نارﺎﻤﯿﺑ ﺪﻨﺘﺴﻫ ) 3 (.
زا ﯽﯾﺎﺠﻧآ ﻪﮐ ﺎـﻔﻟآ - 1 - زاﺪـﯿﻧوروﺪﯾا ﯽـﻣ
ﺗ ﺪـﻧاﻮ ﻂـﺳﻮﺗ
لﻮﻠﺳ
،ﺎﻫ رد نﺎﯾﺮﺟ نﻮﺧ ﺢﺷﺮﺗ دﻮـﺷ و ﻂـﺳﻮﺗ ﻦﯿـﻨﭽﻤﻫ
لﻮﻠﺳ يﺎﻫ ﺮﮕﯾد بﺬﺟ
،دﻮﺷ نﺎﻣرد يﺎﻫ ﺮﺿﺎﺣ ﺮـﺑ ﻦﯿﻣﺄـﺗ
ﻢﯾﺰﻧآ يدﺮﮑﻠﻤﻋ رد
نﺎـﯾﺮﺟ نﻮـﺧ ﺰـﮐﺮﻤﺘﻣ ﺖـﺳا . نﺎـﻣرد
ﯽﻨﯾﺰﮕﯾﺎﺟ ﻢﯾﺰﻧآ
) (ERT
و ﺪﻧﻮﯿﭘ ﺰﻐﻣ ناﻮﺨﺘـﺳا )
(BMT
ود
ﻪﻨﯾﺰﮔ ﯽﻧﺎﻣرد ﻦﯾا يرﺎﻤﯿﺑ ﺪﻨﺘﺴﻫ . ﺎﺑ ﻦﯾا
،لﺎـﺣ ﻦـﯾا شور
يﺎﻫ ﯽﻧﺎﻣرد ﺎﺑ ﺶﻟﺎﭼ يﺎﻫ يا هﺪﻨﻨﮐدوﺪﺤﻣ وﺮﺑور
ﺪﻨﺘـﺴﻫ .
ﺪﻧﻮﯿﭘ ﺰﻐﻣ ناﻮﺨﺘﺳا ﺎﺑ هاﺮﻤﻫ
بﻮﮐﺮﺳ ﻢﺘﺴﯿﺳ ﯽـﻨﻤﯾا نﺪـﺑ
ﺖﺳا ﻪﮐ ﻪﺑ رﻮﻃ ﻞﺑﺎﻗ ﯽﻬﺟﻮﺗ ﯽﮔﺪﻧز رﺎـﻤﯿﺑ ار ﺮﯿﺛﺎـﺗ ﺖـﺤﺗ
راﺮﻗ ﯽﻣ ﺪﻫد .
زا فﺮﻃ ﺮـﮕﯾد نﺎـﻣرد ﯽﻨﯾﺰﮕﯾﺎـﺟ
،ﻢﯾﺰـﻧآ ﮏـﯾ نﺎـﻣرد
ﯽﻤﺋاد ﺖﺴﯿﻧ و مواﺪـﺗ هدﺎﻔﺘـﺳا ﻦـﯾا زا ﻢﯾﺰـﻧآ يﺎـﻫ ناﺮـﮔ
نﺎﻣرد ،ﺖﻤﯿﻗ ار
زا ﺮﻈﻧ يدﺎﺼﺘﻗا ﯽﺑ ﺠﯿﺘﻧ ﻪ هدﺮﮐ ﺖـﺳا . ﺎـﺑ ﻪﺟﻮﺗ
ﻪﺑ ﺖﯾدوﺪﺤﻣ يﺎﻫ
،دﻮﺟﻮﻣ ﮏﯾ نﺎﻣرد ﯽﻤﺋاد و نوﺪﺑ
ﻦﯾا ﺖﯾدوﺪﺤﻣ ﺎﻫ
ياﺮﺑ ﺖﯾﺮﯾﺪـﻣ نارﺎـﻤﯿﺑ
رﺎﯿـﺴﺑ يروﺮـﺿ
ﺖﺳا ) 3 ( . رد يﺎﻬﻟﺎﺳ ﺮﯿﺧا ، ﺶﯾاﺮﯾو ﯽﻧژ يﺎﻬﻟﻮﻠﺳ يدﺎـﯿﻨﺑ
ﺰﻐﻣ ناﻮﺨﺘﺳا
،رﺎﻤﯿﺑ ﺞﯾﺎﺘﻧ راوﺪﯿﻣا هﺪـﻨﻨﮐ يا ار نﺎـﺸﻧ هداد
ﺖﺳا حﻼﺻا و ﯽﮑﯿﺘﻧژ نژ وIDUA
ﯽﻨﯾﺰﮕﯾﺎﺟ نژ
بﻮـﯿﻌﻣ
ﺎﺑ ﮏﯾ ﻪﺨﺴﻧ ﻢﻟﺎﺳ ﮏﯾ نﺎﻣرد هﺪـﯾا لآ ﺪـﻫد ﯽـﻣ ﻪـﯾارا ار .
ﻪﻌﺳﻮﺗ ﻦﯾا دﺮﮑﯾور ﯽﻧﺎﻣرد ﯽﻣ ﺪﻧاﻮﺗ ﺪﯿﻣا ﻪﺑ ﯽﮔﺪﻧز نارﺎﻤﯿﺑ
ارMPSI
ﺶﯾاﺰﻓا ﺪﻫد ) 4 (.
The Clustered Regularly Interspaced Palindromic Repeats
)
CRISPR
( و ﻦﯿﺌﺗوﺮـــﭘ زاCas9
ياﺰــﺟا ﻢﺘــﺴﯿﺳ ﯽــﻨﻤﯾا ﯽــﻘﯿﺒﻄﺗ ﯽــﺑوﺮﮑﯿﻣ
ﺖــﺳا ﻪــﮐ رد
يﺎﻬﻟﺎﺳ ﺮﯿﺧا ياﺮﺑ مﻮﻧژ يرﺎﮑﺘﺳد رد
يﺎﻬﻟﻮﻠﺳ ﺖﺸﮐ
ﻪﺘﻓﺎﯾ
ﺎﯾ و ﻞﮐ ﻢﺴﯿﻧﺎﮔرا ﺎﻫ
درﻮﻣ هدﺎﻔﺘﺳا راﺮـﻗ ـﺘﻓﺮﮔ ﺖـﺳا ﻪ ) 5 (.
زﺎﺌﻠﮐﻮﻧوﺪﻧا ﻂﺳﻮﺗCas9
ﮏـﯾ يﺎـﻤﻨﻫار ﻪﺘـﺷر ﮏـﺗRNA
ﻪﻣﺎﻧﺮﺑ يﺰﯾر هﺪﺷ )
sgRNA
( دﺎﺠﯾا ياﺮﺑ ﯽﮕﺘﺴﮑﺷ
يﺎﻫ ود
ﻪﺘﺷر يا رد نﺎﮑﻣ يﺎﻫ زا ﯽﺻﺎﺧ ﺪﻧﻮﺷ ﯽﻣ ﺖﯾاﺪﻫ مﻮﻧژ
.
ﻦﯾا ﺖﺴﮑﺷ يﺎﻫ ود ﻪﺘﺷر يا نﺎﮑﻣ ﯽﺒـﺳﺎﻨﻣ ار ياﺮـﺑ
يرﺎﮑﺘﺳد ﺮﺛﻮﻣ
نژ ﻢﻫاﺮﻓ ﯽﻣ ﺪﻨﻨﮐ . رد لﺎﺳ يﺎﻫ ﺮﯿﺧا ، ﺎـﺑ
ﮏﻤﮐ يروﺎﻨﻓ
CRISPR
، ﺖﻓﺮﺸﯿﭘ يﺎﻫ ﯽﻤﯿﻈﻋ رد ﻪﻨﯿﻣز
يﺎﻫ ﻒﻠﺘﺨﻣ نژ ﯽﻧﺎﻣرد رد عاﻮﻧا يرﺎﻤﯿﺑ ﺎـﻫ ﻞـﺻﺎﺣ هﺪـﺷ
ﺖﺳا . ﺎﺑ ﻦﯾا
،لﺎﺣ ﯽﻧاﺮﮕﻧ يﺎﻫ يدﺎﯾز رد درﻮـﻣ يﺎـﻘﻟا ﺮـﯿﻏ
ﯽﺻﺎﺼﺘﺧا ﺖﺴﮑﺷ
يﺎﻫ ود ﻪﺘـﺷر جرﺎـﺧ يا زا
فاﺪـﻫا رد
مﻮﻧژ ﻂﺳﻮﺗ
CRISPR
دﻮﺟو دراد ﻪﮐ ﻦﮑﻤﻣ ﺖﺳا ﺮﺠﻨﻣ ﻪـﺑ
ﺞﯾﺎﺘﻧ ﻪﺘﺳاﻮﺧﺎﻧ .دﻮﺷ
لﺎـﻌﻓﺮﯿﻏ ،ﻞﮑـﺸﻣ ﻦـﯾا ﻞـﺣ يﺎﻫﺮﮑﯾور زا ﯽﮑﯾ ندﺮـﮐ
ﯽﮑﯾ زا ﻦﯿﻣد يﺎﻫ زﺎﮑﯿﻧDNA
رد ﻢﯾﺰﻧآ ﺖـﺳاCas9
. ﻦـﯾا
ﺶــﻬﺟ ﺖــﯿﻟﺎﻌﻓ يزﺎــﺌﻠﮐﻮﻧ ارCas9
زا ﻦﯿــﺑ ﯽــﻣ
،دﺮــﺑ ﺎــﻣا
نﺎﻨﭽﻤﻫ يارادCas9
ﺖﯿﻟﺎﻌﻓ يزﺎﮑﯿﻧ ﺪﺷﺎﺑ ﯽﻣ . ﺎﺑ ﯽـﺣاﺮﻃ
ود
sgRNA
،روﺎــﺠﻣ ﯽــﻣ ناﻮــﺗ ود زﺎــﮑﯿﻧ ار رد ﯽــﮑﯾدﺰﻧ
ﺮﮕﯾﺪﮑﯾ ﺎﻘﻟا دﺮﮐ و ﺶﻬﺟ ارDSB
دﻮﻤﻧ ﺎﻘﻟا . ﺢﺿاو ﺖﺳا ﻪﮐ
يﺎﻘﻟا ﮏﯾ زﺎﮑﯿﻧ رد ﺮﺛا DNA
ﺶـﻬﺟ ﯽـﯾاز ﺮـﺑ يور مﻮـﻧژ
دراﺪﻧ . ﺎﺑ هدﺎﻔﺘﺳا زا ﻦـﯾا
،يﮋﺗاﺮﺘـﺳا ﻢﺘـﺴﯿﺳ ﺖﯿـﺻﺎﺼﺘﺧا
CRISPR
ﻪﺑ رﻮﻃ يﺮﯿﮕﻤﺸﭼ ﺶﯾاﺰﻓا
ﺪﺑﺎﯾ ﯽﻣ .
/
164د ،ﻪﺘﻓﺎﯾ هرو 22 ، نﺎﺘﺴﻣز 99
يژﻮـﻟﻮﻨﮑﺗ ﺪـﯾﺪﺟ يﺎﻫ شور رد
CRISPR
ﺮـﺑ ﯽـﻨﺘﺒﻣ
ـﮐ ﻢﺘـﺴﯿﺳ ﻦـﯾا ﯽﺻﺎﺼﺘﺧا ﺮﯿﻏ دﺮﮑﻠﻤﻋ ناﺰﯿﻣ ،زﺎﮑﯿﻧ ﺶﻫﺎ
،ﺖﺳا ﻪﺘﻓﺎﯾ ﺎﻣا
ﻦﯾا ا ﻪﺟاﻮﻣ ﺶﻟﺎﭼ ﻦﯾا ﺎﺑ ﺰﯿﻧ يﮋﺗاﺮﺘﺳا ﺖﺳ
ﻪﮐ ﺪﯾﺎﺑ ﻦﯾﺪﻨﭼ
sgRNA
ﻪﺑ نﺎﻣﺰﻤﻫ لﻮﻠـﺳ
دﻮـﺷ دراو .
ﻪـﺑ
ناﻮﻨﻋ
،لﺎﺜﻣ يﺎـﻘﻟا ﮏـﯾ ﺶـﻬﺟ فﺬـﺣ زﺎـﯿﻧ ﻪـﺑ 4 ﯽﻟاﻮـﺗ
sgRNA
دراد . يﺎﻬﺷور ﯽـﻔﻠﺘﺨﻣ ياﺮـﺑ
ﻞـﺣ ﻦـﯾا ﻞﮑـﺸﻣ
دﺎﺠﯾا هﺪﺷ ﺖﺳا ﺪﻨﻧﺎﻣ لﺎﻘﺘﻧا نﺎﻣﺰﻤﻫ
sgRNA
ﺎﺑ ﻦﯿﺌﺗوﺮـﭘ
ﺎﯾCas9
ﻟﻮﺗ ﺪﯿ يﺎﻫﺪﯿﻤﺳﻼﭘ ﺪﻨﭼ
ﺖﺳﺎﮐ .
ﺎﺑ ﻪﺟﻮﺗ ﻪﺑ ﺖﯾدوﺪﺤﻣ يﺎﻫ
ﻒﻠﺘﺨﻣ ﻦﯾا يﮋﺗاﺮﺘـﺳا
،ﺎـﻫ
ﻪﻌﺳﻮﺗ ﯽﺷور ياﺮﺑ لﺎﻘﺘﻧا نﺎﻣﺰﻤﻫ
sgRNA
يﺎﻫ دﺪـﻌﺘﻣ و
ﻪﺑCas9
ترﻮﺻ ﮏﯾ
،ﺪﺣاو ﻪﺑ لﻮﻠﺳ فﺪﻫ زﻮﻨﻫ درﻮﻣ زﺎـﯿﻧ
ﺖﺳا . رد ﯽﻃ لﺎـﺳ 2006
، Xie
و ﺶﻧارﺎـﮑﻤﻫ هﺎﮕﺘـﺳد زا
ﺶﯾاﺮــﯿﭘ ياﺮــﺑtRNA
ﺖــﯾﻮﻘﺗ ﺶﯾاﺮــﯾو ﯽﺘﻟﻮــﻣ
ﺲــﮑﻠﭘ
CRISPR / Cas9
رد ﺞﻧﺮﺑ هدﺎﻔﺘﺳا ﺪﻧدﺮﮐ . ﺞﯾﺎﺘﻧ ﺎﻬﻧآ نﺎـﺸﻧ
داد ﻪﮐ هدﺎﻔﺘﺳا زا ﻢﺘﺴﯿﺳ شزادﺮـﭘ ياز نورد
ﯽـﻣtRNA
ﺪــﻧاﻮﺗ ﻪــﺑ رﻮــﻃ ﻞــﺑﺎﻗ ﯽﻬﺟﻮــﺗ ترﺪــﻗ و ﯽﯾارﺎــﮐ ﻢﺘــﺴﯿﺳ
CRISPR / Cas9
ار ﺶﯾاﺰﻓا ﺪﻫد . ﺮﺑ ﻦـﯾا
،سﺎـﺳا ﺎـﻣ ﮏـﯾ
ﺪﯿﻤﺳﻼﭘ نﺎﯿﺑ هﺪﻨﻨﮐ ود
sgRNA
ﯽﺣاﺮﻃ ار ﻢﯾدﺮـﮐ
ﻪـﮐ زا
ﻦﯾا ﻢﺘﺴﯿﺳ ﻔﺘﺳا ﺪﻨﮐ ﯽﻣ هدﺎ و
ﯽﻣ ﺪﻧاﻮﺗ ياﺮﺑ فﺪـﻫ راﺮـﻗ
نداد نژ هدﺎﻔﺘﺳاIDUA
دﻮﺷ .
شور و داﻮﻣ ﺎﻫ
زا ﺎﺠﻧآ ﻪﮐ داﺪﻌﺗ يدﺎﯾز ﺶﻬﺟ ردIDUA
نوﺰـﮔا 7 خر
ﯽـﻣ
،ﺪـﻫد
sgRNA
ﺎـﻫ ياﺮـﺑ فﺪـﻫ راﺮـﻗ نداد نوﺰـﮔا 7
ﯽﺣاﺮﻃ هﺪﺷ ﺪﻧا . ﯽﺣاﺮﻃ
sgRNA
ﺎﺑ ﻪﺟﻮﺗ ﻪـﺑ يﺎـﻫﺮﺘﻣارﺎﭘ
ﻖﯿﻗد مﺎﺠﻧا هﺪﺷ ﺖﺳا .
sgRNA
ﺪﯾﺎﺒﻧ فﺪﻫ ا ﺮﯿﻏ ﯽﺻﺎﺼﺘﺧ
ﺪﺷﺎﺑ ﻪﺘﺷاد .
هوﻼﻋ ﺮﺑ
،ﻦﯾا ياﺮﺑ ﺶﯾاﺰﻓا ﺖﯿﺻﺎﺼﺘﺧا
،فﺪـﻫ
زا
Cas9n
) زﺎﮑﯿﻧ
Cas-9
( ياﺮﺑ راﺮﻗ فﺪﻫ درﻮﻣ نژ
هدﺎﻔﺘﺳا
ﺪﺷ . ﻦﯾاﺮﺑﺎﻨﺑ
sgRNA
يﺎﻫ ﯽﻨﺘﺒﻣ ﺮﺑ زﺎـﮑﯿﻧ ﻪـﺑ ترﻮـﺻ ود
sgRNA
ﯽﺣاﺮﻃ ﺪﻧﺪﺷ ﻪﮐ هﺎﮕﯾﺎﺟ ار ﯽﯾﺎﻫ يور ﻪﺘﺷر يﺎﻫ
ﻞﻤﮑﻣ فﺪﻫ راﺮﻗ ﯽﻣ ﺪـﻨﻫد . ﺮـﻫ
sgRNA
ﻪـﻟﺎﺒﻧد ﮏـﯾ ﺎـﺑ
tracrRNA
ﯽﺣاﺮﻃ هﺪﺷ و زا
sgRNA
روﺎﺠﻣ ﻂـﺳﻮﺗ دﻮـﺧ
ﮏﯾ ﻦﯿﺴﯿﻠﮔtRNA
اﺪﺟ هﺪﺷ ﺖـﺳا ).
ﻞﮑـﺷ 1A
( ﺲﭙـﺳ ﯽﻟاﻮﺗ
ﯽﺣاﺮﻃ
،هﺪﺷ ﺰﺘﻨﺳ ﺪﺷ و رد ﺪﯿﻤـﺳﻼﭘ نﻮـﻠﮐpGH
ﺪﯾدﺮﮔ ) ﻞﮑﺷ 1B
(.
ﻞﮑﺷ 1،A ﻪﺳ ﺖﻔﺟ sgRNA
ﻞﮑﺷ 1B ﻪﺸﻘﻧ ، ﺪﯿﻤﺳﻼﭘ pGH
نﻮﻠﮐ SgRNA رد
ﺪﯿﻤﺳﻼﭘ pX335
ﺪﯿﻤﺳﻼﭘ ﺰﺘﻨﺳ
هﺪﺷ ﮓـﻨﯿﻧﻮﻠﮐ ﻂﺳﻮﺗ ﺮـﯿﺜﮑﺗ
و ﺪـﺷ ﺎـﺑ
ﻢﯾﺰﻧآ ﻢﻀﻫBbsI
ﺪﯾدﺮﮔ . ﻪﺑ رﻮﻃ
،ﻪﺻﻼﺧ 31μl
زا ﺪﯿﻤﺳﻼﭘ
،pGH
5 μl
زا ﺮﻓﺎـﺑ 10x NEB Cut Smart
و 2 ﺪـﺣاو زا
ﻢﯾﺰﻧآ دوﺪﺤﻣ هﺪﻨﻨﮐ طﻮﻠﺨﻣBbsI
و ﺪﺷ ﺎـﺑ بآ ﻪـﺑ ﺮـﻄﻘﻣ
ﻢﺠﺣ 50μl
و ﺪﯿﺳر ﻪﺑ تﺪﻣ 3 ﺖﻋﺎﺳ رد يﺎﻣد 37 ﻪـﺟرد
داﺮﮕﯿﺘﻧﺎﺳ ﻪـﺑﻮﮑﻧا
ﺪـﺷ . ﻪـﯾارآ هﺪـﻨﻨﮐ نﺎـﯿﺑ
sgRNA
زا لژ
زرﺎﮔآ جاﺮﺨﺘﺳا ﺪﯾدﺮﮔ . ﺪﯿﻤﺳﻼﭘ
pX335
ﺰﯿﻧ ﻖﺒﻃ ﻞـﮑﺗوﺮﭘ
قﻮﻓ ﻂﺳﻮﺗ ﻢﯾﺰﻧآ ﻢﻀﻫBbsI
ﺪﺷ . ﯽﻟاﻮﺗ يﺎـﻫ ﺪﯿﻤـﺳﻼﭘ و
sgRNA
هدﺎــﻣآ هﺪــﺷ ﺎــﺑ هدﺎﻔﺘــﺳا زا
T4 DNA
زﺎــﮕﯿﻟ ﻪــﺑ
/
165هرود ،ﻪﺘﻓﺎﯾ 22
، نﺎﺘﺴﻣز 99
ﻞﺼﺘﻣ ﺮﮕﯾﺪﮑﯾ ﺪﻧﺪﺷ
.
μg
5/
0 ﻪﯾارآ نﺎـﯿﺑ هﺪـﻨﻨﮐ
sgRNA
،هﺪﺷ ﺺﯿﻠﺨﺗ
μg
1 ﺪﯿﻤﺳﻼﭘ
pX335
ﻢﻀﻫ
،هﺪﺷ
μl
1 ﺮﻓﺎـﺑ
10x DNA
ــﮕﯿﻟ زﺎ و 10 ﺪــﺣاو
HC T4 DNA Ligase
طﻮﻠﺨﻣ و هﺪﺷ ﺎـﺑ بآ ﺮـﻄﻘﻣ ﻢـﺠﺣ ﻪـﺑ
μl
10 و ﺪﯿـﺳر رد
يﺎﻣد 16 ﻪﺟرد داﺮﮕﯿﺘﻧﺎﺳ ﮏﯾ تﺪﻣ ﻪﺑ
زور ﻪﻧﺎﺒـﺷ ﻪـﺑﻮﮑﻧا
ﺪﺷ . ﻞﺻﺎﺣ لﻮﻠﺤﻣ ﻂﺳﻮﺗ
ﻞﮑﺗوﺮﭘ دراﺪﻧﺎﺘﺳا كﻮﺷ
ﯽﺗراﺮﺣ
ﻪﺑ يﺎﻬﻟﻮﻠﺳ
DH5α
ﺪﺟاو هداد لﺎﻘﺘﻧا ﻂﯾاﺮﺷ ﺪﺷ
.
ﻢﻀﻫ ﯽﻤﯾﺰﻧآ
ﯽﻧﻮﻠﮐ يﺎﻫ تﺪﻣ ﻪﺑ ﺐﯿﮐﺮﺗﻮﻧ ﮏﯾ
ﺷ زور ﻪﻧﺎﺒ رد ﻂﯿﺤﻣ
ﺖــﺸﮐLB
هداد ﺪﻧﺪــﺷ . ﺎﻫﺪﯿﻤــﺳﻼﭘ ﺎــﺑ
هدﺎﻔﺘــﺳا زا ﺖــﯿﮐ
ﻖــﺒﻃ و دراﺪﻧﺎﺘــﺳا ﻞﻤﻌﻟارﻮﺘــﺳد
جاﺮﺨﺘــﺳا ﺪــﻧﺪﯾدﺮﮔ
.
يﺎﻫﺪﯿﻤﺳﻼﭘ ﺐﯿﮐﺮﺗﻮﻧ
ﻂﺳﻮﺗ ﻢﻀﻫ ﯽﻤﯾﺰﻧآ ﯽـﺳرﺮﺑSmaI
ﺪﻧﺪﺷ . رﻮﻄﻧﺎﻤﻫ ﻪﮐ رد ﻞﮑﺷ 2 نﺎﺸﻧ هداد هﺪﺷ
،ﺖﺳا ﻢﻀﻫ
ﯽﻤﯾﺰﻧآ ﺪﯿﻤﺳﻼﭘ ﺐﯿﮐﺮﺗﻮﻧ
pX335-sgRNA
ﺗ ﻂـﺳﻮ
SmaI
ﻪﺳ ﺪﻧﺎﺑ ﺑﺎ لﻮﻃ يﺎﻫ 2974 ﺖﻔﺟ
،زﺎﺑ 5548 ﺖـﻔﺟ زﺎـﺑ و
168 ﺖﻔﺟ زﺎﺑ دﺎﺠﯾا .ﺪﻨﮐ ﯽﻣ
ﻞﮑﺷ 2 ﻢﻀﻫ ، ﯽﻤﯾﺰﻧآ ﺪﯿﻤﺳﻼﭘ ﺐﯿﮐﺮﺗﻮﻧ pX335-sgRNA ﺗ
ﻂﺳﻮ
SmaI
ﺖﺸﮐ ﯽﻟﻮﻠﺳ و ﻦﺸﮑﻔﺴﻧاﺮﺗ
هدر ﯽﻟﻮﻠﺳ لﺎﯿﻠﺘﯿﭘا ﻪﯿﻠﮐ ﯽﻨﯿﻨﺟ ﯽﻧﺎﺴﻧا
HEK293
، رد
ﻂﯿــﺤﻣ
RPMI 1640
ﺎــﺑ 20 مﺮــﮔوﺮﮑﯿﻣ رد
ﯽــﻠﯿﻣ ﺮــﺘﯿﻟ
ﻦﯿــﺴﯾﺎﻣﺎﺘﻨﺟ و
10
٪ ﺖــﺸﮐFBS
هداد يﺎــﻫ لﻮﻠــﺳ .ﺪــﺷ 105
× 5 /2 تﺪﻣ ﻪﺑ 3 زور ﻞﺒﻗ زا رد ﻦﺸﮑﻔﺴﻧاﺮﺗ ﮏﺳﻼﻓ
25 ﯽﻠﯿﻣ ﺮﺘﻣ ﻊﺑﺮﻣ هداد راﺮﻗ ﺪﻧﺪﺷ . ﺲﭘ زا لﻮﻠـﺳ نﺪﯿـﺳر
ﺎﻫ ﻪﺑ ﻢﮐاﺮﺗ ﺢﻄﺳ 60
، ٪ ﻖﺒﻃ
،ﻞﻤﻌﻟارﻮﺘﺳد 8
مﺮـﮔوﺮﮑﯿﻣ
زا ﺪﯿﻤـﺳﻼﭘ
pX335-sgRNA
ﺎــﺑ هدﺎﻔﺘـﺳا زا ﻦﯿﻣﺎــﺘﮑﻓﻮﭙﯿﻟ
2000 ﻪــﺑ ﺎﻬﻟﻮﻠــﺳ ﺖﮑﻔــﺴﻧاﺮﺗ ﺪــﺷ
. 24 ﻋﺎــﺳ ﺖ ﺲــﭘ زا
،ﻦﺸﮑﻔﺴﻧاﺮﺗ ﺖـﺸﮐ ﻂﯿـﺤﻣ
ﺎـﺑ
RPMI 1640
يوﺎـﺣ 10
٪
ﻦﯾﺰﮕﯾﺎــﺟFBS
ﺪــﺷ . دﺎــﺘﻔﻫ و ود ﺖﻋﺎــﺳ
،ﺪــﻌﺑ ﺎﻬﻟﻮﻠــﺳ
ﻪﻨﯿﺴﭙﯾﺮﺗ هﺪﺷ
و ﮏﺗ ﺎﻬﻧﻮﻠﮐ شور ﺎﺑ يزﺎـﺳ ﻖﯿﻗر ﯽﻟﺎﯾﺮـﺳ
هدﺎﻣآ ﺪﻧﺪـﺷ . لﻮﻠـﺳ ﺲﭙـﺳ ﺎـﻫ
ﻪـﺑ تﺪـﻣ ﮏـﯾ ﻪـﺘﻔﻫ رد
ﺖــﯿﻠﭘوﺮﮑﯿﻣ 96
ﻪــﻧﺎﺧ ﺖــﺸﮐ هداد ﺪﻧﺪــﺷ و زاDNA
ﻦــﯾا
ﺎﻫ ﮏﻫﺎﭼ جاﺮﺨﺘـﺳا
ﺪـﯾدﺮﮔ . ـﮐاو ﺶﻨ ﺎـﺑPCR
هدﺎﻔﺘـﺳا زا
ﯽﺻﺎﺼﺘﺧا يﺎﻫﺮﻤﯾاﺮﭘ نوﺰﮔا
7 نژ
IDUA
مﺎﺠﻧا ﺪﺷ . ﯽﻟاﻮﺗ
يﺎﻫ رد ﺮﻤﯾاﺮﭘ لوﺪﺟ
1 ﺮﮐذ هﺪـﺷ ﺖـﺳا . ﭻﯾﺎـﺘﻧ ﺎـﺑPCR
هدﺎﻔﺘــﺳا شور زا ﯽــﻨﺤﻨﻣ بوذ دراﺪﻧﺎﺘــﺳا درﻮــﻣ
ﻪــﯾﺰﺠﺗ و
ﻞﯿﻠﺤﺗ راﺮﻗ ﺪﻨﺘﻓﺮﮔ و ﻪﻧﻮﻤﻧ ﺎﻫ ﺎﺑ يﻮﮕﻟا بوذ توﺎﻔﺘﻣ ﺖﺤﺗ
ﯽﺑﺎﯾ ﯽﻟاﻮﺗ ﺮﺠﻨﺳ
.ﺪﻨﺘﻓﺮﮔ راﺮﻗ
لوﺪﺟ 1 . يﺎﻫﺮﻤﯾاﺮﭘ ﯽﻟاﻮﺗ
نوﺰﮔا 7 Primer
name
Sequence Product size IDUAEX7F ACTACATCTCCCTCCACAG
489bp IDUAEX7R CATTGTCGTTGCTCAGGA
ﺎﻫ ﻪﺘﻓﺎﯾ
ﺪﯿﻟﻮﺗ ﺪﯿﻤﺳﻼﭘ فﺪﻫ
IDUA
يﺎﻫﺪﯿﻤﺳﻼﭘ ﺐﯿﮐﺮﺗﻮﻧ
ﺎﺑpGH
هدﺎﻔﺘﺳا زا ﻢﯾﺰـﻧآ
BbsI
ﻢﻀﻫ ﺪﻧﺪﺷ . ﻖﺒﻃ ﻪﺸﻘﻧ ﺪﯿﻤـﺳﻼﭘ ﺐـﯿﮐﺮﺗﻮﻧ
، pGH
ﻢـﻀﻫ
ﺪﯿﻤﺳﻼﭘ
pGH-sgRNA
ﺎﺑ ﻢﯾﺰﻧآ ﮏـﯾBbsI
ﻪـﻌﻄﻗ
، DNA
443 ﺖﻔﺟ زﺎﺑ ﯽﻣ ﺪﻫد . يﺎﻫﺪﯿﻤﺳﻼﭘ ﻢﻀﻫ
هﺪـﺷ ﺮـﺑ يور
لژ زرﺎﮔآ 1 زرﻮﻓوﺮﺘﮑﻟا٪ ﺪﻧﺪـﺷ
و ﻪـﻌﻄﻗ درﻮـﻣ ﺮـﻈﻧ زا لژ
جاﺮﺨﺘــﺳا و
ﻪــﺑ ﺪﯿﻤــﺳﻼﭘ
pX335
ﯽــﻄﺧ ﻞــﺼﺘﻣ ﺪــﺷ .
ﺺﯿﺨﺸﺗ ﺪﯿﻤﺳﻼﭘ
pX335-sgRNA
ﺐﯿﮐﺮﺗﻮﻧ ﺎﺑ هدﺎﻔﺘﺳا زا
ﻢــﻀﻫ ﯽــﻤﯾﺰﻧآ ﻧاSmaI
مﺎــﺠ ﺪــﺷ . ﻖــﺒﻃ ﻪــﺸﻘﻧ
pX335-
sgRNA
، ﻢﻀﻫ ﺪﯿﻤﺳﻼﭘ ﻂﺳﻮﺗ ﻪﺳSmaI
ﻪـﻌﻄﻗ ﺎـﺑ لﻮـﻃ
يﺎﻫ 5558 ﺖﻔﺟ زﺎﺑ ، 2950 ﺖﻔﺟ زﺎﺑ و 173 ﺖـﻔﺟ زﺎـﺑ
دﺎﺠﯾا ﯽﻣ ﺪﻨﮐ . يﺎﻫﺪﯿﻤﺳﻼﭘ ﻢﻀﻫ
هﺪﺷ ﺮـﺑ يور لژ زرﺎـﮔآ
/
166د ،ﻪﺘﻓﺎﯾ هرو 22 ، نﺎﺘﺴﻣز 99
1 زرﻮﻓوﺮﺘﮑﻟا٪
،ﺪﻧﺪﺷ ﯽﺧﺮﺑ زا ﺎﻫﺪﯿﻤﺳﻼﭘ يﻮﮕﻟا
درﻮﻣ ﺮﻈﻧ
ار نﺎﺸﻧ رد .ﺪﻧداد ﺖﯾﺎﻬﻧ
ﯽﻟاﻮﺗ يﺎﻫﺪﯿﻤـﺳﻼﭘ ﺐـﯿﮐﺮﺗﻮﻧ
ﺎـﺑ
هدﺎﻔﺘﺳا زا ﯽﺑﺎﯾ ﯽﻟاﻮﺗ ﺮﮕﻨﺳ
ﺪﯿﯾﺄﺗ ﺪﺷ .
ﺪﯿﻟﻮﺗ هدر ﯽﻟﻮﻠﺳ توا كﺎﻧ IDUA
رد ﻦــﯾا
،ﻪــﻌﻟﺎﻄﻣ ﺎــﺑ
هدﺎﻔﺘــﺳا زا ﻢﺘــﺴﯿﺳ
CRISPR-
nCas9
، ﺖﺴﮑﺷ يﺎﻫ ﮏﺗ ﻪﺘﺷر يا روﺎﺠﻣ رد نوﺰﮔا 7 نژ
دﺎﺠﯾا IDUA
ﺪﺷ ﻪـﮐ رد ﺖـﯾﺎﻬﻧ ﺮـﺠﻨﻣ ﻪـﺑ ﯽﮕﺘـﺴﮑﺷ ود
ﻪﺘﺷر رد ﻦﯾا نژ ﯽﻣ دﻮﺷ . ﻪﺑ لﺎﺒﻧد ﻢﯿﻣﺮﺗ يﺎﻫ ﺖﺴﮑﺷ ود
يا ﻪﺘــﺷر زا
ﻢﺘــﺴﯿﺳ ﻖــﯾﺮﻃ
non-homologous end
joining
فﺬــﺣ يﺎــﻫ ﺶــﻬﺟ ، و
رد جرد ﻦــﯾا ﻪــﻠﺣﺮﻣ خر
ﯽﻣ ﺪﻫد ﻪﮐ ﺐﻠﻏا ﺮﺠﻨﻣ ﻪﺑ ﺮﯿﯿﻐﺗ بﻮﭼرﺎﭼ رد نﺪﻧاﻮﺧ
و زا
ﻦﯿﺑ ﻦﺘﻓر دﺮﮑﻠﻤﻋ نژ ﯽﻣ دﻮﺷ . هد
نﻮــﻠﮐ زا تﻻﻮــﺼﺤﻣ ﻦــﺸﮑﻔﺴﻧاﺮﺗ
اﺪــﺟ ﺪــﺷ و ﺎــﺑ
هدﺎﻔﺘﺳا زا شور ﺰﯿﻟﺎﻧآ ﯽﻨﺤﻨﻣ بوذ درﻮﻣ ﻪـﯾﺰﺠﺗ و ﻞـﯿﻠﺤﺗ
راﺮﻗ ﺖﻓﺮﮔ . نوﺰﮔا 7 ردIDUA
ﯽﯾﺎﻬﻟﻮﻠﺳ ﻪﮐ
ﯽﻨﺤﻨﻣ بوذ
،ﺖـﺷاد فاﺮﺤﻧا نآ ﺎـﺑ
هدﺎﻔﺘـﺳا ﯽـﺻﺎﺼﺘﺧا يﺎـﻫﺮﻤﯾاﺮﭘ زا
ﺮﯿﺜﮑﺗ و ﯽﻟاﻮﺗ ﯽﺑﺎﯾ ﺪﺷ . رﻮﻄﻧﺎﻤﻫ ﻪﮐ رد ﻞﮑـﺷ 3 هﺪﻫﺎـﺸﻣ
ﯽــﻣ
،دﻮــﺷ نﻮــﻠﮐ يﺎــﻫ هرﺎﻤــﺷ 3 و 5 ياراد ﺶــﻬﺟ
تﻮﮕﯾزوﺮﺘﻫ ﺪﻧدﻮﺑ
. رد
،ﻞـﺑﺎﻘﻣ يﺎﻬﻟﻮﻠـﺳ نﻮـﻠﮐ
8 ياﺮـﺑ ود
ﺶﻬﺟ ﻒﻠﺘﺨﻣ ﻨﯾا لﺪ تﻮﮕﯾزوﺮﺘﻫ ﺪـﻧدﻮﺑ
. ﺮـﻫ ﻪـﺳ ﺶـﻬﺟ
هﺪﻫﺎﺸﻣ هﺪﺷ ﺶﻬﺟ ﺎﺑ ﯽﯾﺎﻫ ﺮﯿﯿﻐﺗ بﻮﭼرﺎﭼ رد ﺪﻨﺘﺴﻫ
ﻪﮐ
ﺮﺠﻨﻣ ﻪﺑ زا ﺖﺳد نداد دﺮﮑﻠﻤﻋ نژ ﯽﻣ ﺪﻧﻮﺷ . ﺎﺑ ﻦﯾا
،لﺎـﺣ
ﻪﺑ ﻞﯿﻟد ﺖﯿﻫﺎﻣ ﯽﻣوزﻮﺗا بﻮﻠﻐﻣ مرﺪﻨﺳ
،ﺮﻟﺮﻫ ﻂﻘﻓ نﻮﻠﮐ 8
ﭗﯿﺗﻮﻧژ درﻮﻣ ﺮﻈﻧ ار ﺖﺷاد
.
ﻞﮑﺷ 3 . ﻪﺠﯿﺘﻧ نژ ﯽﺑﺎﯾ ﯽﻟاﻮﺗ ردIDUA
نﻮﻠﮐ هرﺎﻤﺷ 3A)
، ( هرﺎﻤﺷ نﻮﻠﮐ 5
3B) و ( هرﺎﻤﺷ نﻮﻠﮐ 8
3C) (
يﺮﯿﮔ ﻪﺠﯿﺘﻧ و ﺚﺤﺑ
رد لﺎﺣ
،ﺮﺿﺎﺣ يﺎﻬﺷور يدﺪﻌﺘﻣ ياﺮﺑ ﻞﯿﻬﺴﺗ نﺎـﻣرد
دﻮــﺟوLSD
دراد ) 6(
. ﺶﯾاﺮــﯾو ﯽــﻧژ
ﯽــﻣ ﺪــﻧاﻮﺗ نﺎــﻣرد
ﯽﺒﺳﺎﻨﻣ ياﺮﺑ ﻦﯾا يرﺎـﻤﯿﺑ ﺎـﻫ ﻢﻫاﺮـﻓ ﺪـﻨﮐ . ﻪـﺳ ﻢﺘـﺴﯿﺳ
ﺶﯾاﺮﯾو نژ ﻞﻣﺎﺷ ) 7 (
zinc finger nucleases (ZFNs)
،
transcription activator-like effectors nucleases (TALENs)
) 8 ( و ) 9 (
homing endonucleases
ﻪــﯾارا
ﺪﻧﺪﺷ . ﺎﻣا ﻪﺑ ﻞﯿﻟد ﺖﯿﻫﺎﻣ هﺪﯿﭽﯿﭘ و ﺶﻟﺎـﭼ ﺰـﯿﮕﻧاﺮﺑ ﺶﯿـﭘ
ﯽﻨﯿﺑ نﺎﯿﻣ ﺶﻨﮑﻤﻫﺮﺑ
،ﻦﯿﺌﺗوﺮﭘ وDNA
ﯽﺣاﺮﻃ و هدﺎﻔﺘﺳا
زا ﻦﯾا شور ﺎﻫ راﻮﺷد ﺖـﺳا . ﻢﺘـﺴﯿﺳ
CRISPR-Cas9
ﻪـﺑ
ناﻮﻨﻋ ﮏﯾ ﮏﯿﻨﮑﺗ ﺶﯾاﺮﯾو مﻮﻧژ
ًاﺮﯿﺧا درﻮـﻣ ﻪـﻌﻟﺎﻄﻣ راﺮـﻗ
ﻪﺘﻓﺮﮔ ﺖﺳا ) 10 (.
ﻪﮐ شور ﮏﯾ ﯽﻧﺎﻣرد
ياﺮﺑ نارﺎﻤﯿﺑ ﻼﺘﺒﻣ ﻪــﺑ
ﺖــﻬﺟ ،LSD
ﯽﺑﺎــﯾزﺎﺑ ﺖــﯿﻟﺎﻌﻓ ﯽــﻤﯾﺰﻧآ رد يﺎﻬﻟﻮﻠــﺳ
گﻮﻟﻮﺗآ ﻪﺘﻓﺮﮔ هﺪﺷ زا رﺎﻤﯿﺑ ﺪﻫد ﯽﻣ ﻪﯾارا ار )
11 (.
ﻪـﭼﺮﮔا
هدﺎﻔﺘﺳا زا
CRISPR / Cas9
زﻮﻨﻫ رد ﻞﺣاﺮﻣ ﻪـﯿﻟوا ﯽﻨﯿﻟﺎـﺑ
،دراد راﺮﻗ ﺎﻣا
حﻼﺻا يﺎﻬﻟﻮﻠﺳ ـﺴﻧا
ﯽﻧﺎ ﺎـﺑ هدﺎﻔﺘـﺳا زا ﺮﯾﺎـﺳ
ﻢﺘﺴﯿﺳ ﺶﯾاﺮﯾو ﯽـﻧژ رد يﺎﻬﻟﺎـﺳ ﺮـﯿﺧا هار دﻮـﺧ ار ياﺮـﺑ
يﺎﻫدﺮﺑرﺎﮐ ﯽﻨﯿﻟﺎﺑ
زﺎﺑ هدﺮﮐ ﺖﺳا ) 12 (.
ﻢـﺴﯿﻧﺎﮑﻣ ﯽﻟﻮـﮑﻟﻮﻣ
ﻪﮐ ياﺮﺑ راﺮﻗ نداد تﺎﻌﻄﻗ ﻞﻤﻋ مﻮﻧژ ردDNA
ﯽـﻣ ﺪـﻨﻨﮐ
ﻪﻄﺳاو ﻪﺑ ﻢﺘﺴﯿﺳ
ﻢﯿﻣﺮﺗ زاDNA
ﻖﯾﺮﻃ ﺖﺴﮑﺷ ود ﻪﺘـﺷر
يا هﺪﺷ دﺎﺠﯾا ﻂﺳﻮﺗ
لﺎﻌﻓCas9
ﯽﻣ ﺪﻧﻮﺷ ) 13 (.
ﻪـﮐ ﻞـﻟآ
يﺎﻫ درﻮﻣ فﺪﻫ ﺐﻠﻏا تاﺮﯿﯿﻐﺗ ﯽﻓﺎﺿا ﺪﻨﻧﺎﻣ
،فﺬـﺣ مﺎـﻏدا
ﯽﺋﺰﺟ ﺎﯾ ﻪﻧﺎﮔﺪﻨﭼ ﺪﯿﻤﺳﻼﭘ فﺪﻫ
و ﯽﺘﺣ يزﺎـﺳ ﻒﻋﺎﻀﻣ ار
/
167هرود ،ﻪﺘﻓﺎﯾ 22
، نﺎﺘﺴﻣز 99
ﺪﻧراد ) 14 (.
ﺎﻣا يروﺎـﻨﻓ ﯽـﺳﺪﻨﻬﻣ مﻮـﻧژ
CRISPR / Cas9
ﺎﺑ رﺎﯿﺴﺑ راﺰﺑا شزرا
رد ار رﺎﯿﺘﺧا نﺎﻘﻘﺤﻣ راﺮﻗ هداد ﺖﺳا ﺎـﺗ
ﺪﯿﻟﻮﺗ لﺪﻣ يﺎﻫ ﻒﻠﺘﺨﻣ ﺮﺑ يا تﺎﻘﯿﻘﺤﺗ ﺖﺴﯾز
ﯽﮑـﺷﺰﭘ رد
ﻞﺧاد نﺪﺑ ار ﻊﯾﺮﺴﺗ ﺪﻨﻨﮐ ) 15،16 .(
ﯽﻧادرﺪﻗ و ﺮﮑﺸﺗ
ﻦﯾا ﻪﻌﻟﺎﻄﻣ رد هﺎﮕﺸﻧاد مﻮﻠﻋ ﯽﮑﺷﺰﭘ ﺪﻬﺸﻣ مﺎﺠﻧا هﺪـﺷ
ﺖﺳا . ﯽﻣﺎﻤﺗ زا ﯽﻧﺎﺴﮐ ﻪﮐ ـﻧدﺮﮐ يرﺎـﯾ ار ﺎﻣ هژوﺮﭘ ﻦﯾا رد ﺪ
ﻪﺑ هﮋﯾو ﺪﯿﻌﺳ يﺎﻗآ گرﺰﺑ
ﯽﻤﻗ ﺮﮑﺸﺗ ﯽﻣ ﻢﯿﻨﮐ .
/
168د ،ﻪﺘﻓﺎﯾ هرو 22 ، نﺎﺘﺴﻣز 99 References
1. Aldenhoven M, van den Broek BTA, Wynn RF, O'Meara A, Veys P, Rovelli A, et al.
Quality of life of Hurler syndrome patients after successful hematopoietic stem cell transplantation. Blood advances.
2017;1(24):42-2236.
2. Tatapudi R, Gunashekhar M, Raju PS.
Mucopolysaccharidosis type I Hurler-Scheie syndrome: A rare case report. Contemporary clinical dentistry. 2011;2(1):8-66.
3. Beck M, Arn P, Giugliani R, Muenzer J, Okuyama T, Taylor J, et al. The natural history of MPS I: global perspectives from the MPS I Registry. Genetics in medicine : official journal of the American College of Medical Genetics. 2014;16(10):65-759.
4. Moore D, Connock MJ, Wraith E, Lavery C.
The prevalence of and survival in Mucopolysaccharidosis I: Hurler, Hurler- Scheie and Scheie syndromes in the UK.
Orphanet journal of rare diseases. 2008;3:24.
5. Shalem O, Sanjana NE, Zhang F. High- throughput functional genomics using CRISPR-Cas9. Nature reviews Genetics.
2015;16(5):299-311.
6. Sun A. Lysosomal storage disease overview.
Annals of translational medicine.
2018;6(24):476.
7. Carroll D. Genome engineering with zinc- finger nucleases. Genetics. 2011;188(4):82- 773.
8. Joung JK, Sander JD. TALENs: a widely applicable technology for targeted genome editing. Nature reviews Molecular cell biology. 2013;14(1):49-55.
9. Chevalier BS, Stoddard BL. Homing endonucleases: structural and functional insight into the catalysts of intron/intein mobility. Nucleic acids research.
2001;29(18):74-3757.
10. Tsai SQ, Joung JK. Defining and improving the genome-wide specificities of CRISPR- Cas9 nucleases. Nature reviews Genetics.
2016;17(5):12-300.
11. De Carvalho TG, da Silveira Matte U, Giugliani R, Baldo G. Genome editing:
potential treatment for lysosomal storage diseases. Current Stem Cell Reports.
2015;1:9-15.
12. Ran FA, Hsu PD, Wright J, Agarwala V, Scott DA, Zhang F. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nature protocols. 2013;8(11):308-2281.
13. Lieber MR. The mechanism of double-strand DNA break repair by the nonhomologous DNA end-joining pathway. Annual review of biochemistry. 2010;79:181-211.
14. Li J, Shou J, Guo Y, Tang Y, Wu Y, Jia Z, et al. Efficient inversions and duplications of mammalian regulatory DNA elements and gene clusters by CRISPR/Cas9. Journal of molecular cell biology. 2015;7(4):98-284.
15. Qin W, Kutny PM, Maser RS, Dion SL, Lamont JD, Zhang Y, et al. Generating Mouse Models Using CRISPR-Cas9- Mediated Genome Editing. Current protocols in mouse biology. 2016;6(1):39-66.
16. Reardon S. CRISPR gene-editing creates wave of exotic model organisms. Nature.
2019;568(7753):2-441.
/
169هرود ،ﻪﺘﻓﺎﯾ 22
، نﺎﺘﺴﻣز 99
Generation of IDUA knockout cell lines by CRISPR/Cas mediated genome editing
Hatami bardar A1, Aziminejad M2 , Jafarinia M3 , Goodarzi H3 , Majid Mojarad4
1- PhD students, Department of Biology, Marvdasht Branch, Islamic Azad University, Marvdasht, Iran.
2- Assistant professor, Department of Basic Medical Sciences, Neyshabour University of Medical Sciences, Neyshabour, Iran.
3- Assistant professor, Department of Biology, Marvdasht Branch, Islamic Azad University, Marvdasht, Iran.
4- Assistant professor, Department of Medical Genetics, School of Medicine, Mashhad University of Medical Sciences, Mashhad, Iran, [email protected]
Received: 11 Nov 2020 Accepted: 14 Dec 2020
Abstract
Background: The hurler syndrome is the most common form of lysosomal storage diseases (LSDs). In the present experiment, we intended to generate an IDUA targeting CRISPR-Cas system and deactivate the target gene using it.
Materials and Methods: IUDA targeting sgRNA pair were cloned into the px335 plasmid and resulted plasmid identity was confirmed using restriction mapping. Recombinant plasmid was transfected into the human epithelial cell line, HEK-293. Mutated clones were screened by melting analysis and their mutation was characterized by Sanger sequencing.
Results: Analytical digestion and Sanger sequencing confirmed indel mutation induction in two clones in heterozygote and one clone in homozygote state.
Conclusion: In this study, we produced an IDUA knockout cell model using CRISPR-nCas9 system. This model can be used in the therapeutic approaches of this disease.
Keywords: Hurler syndrome, CRISPR-Cas, Gene knock out, IDUA
*Citation: Hatami bardar A, Aziminejad M, Jafarinia M, Goodarzi H, Majid Mojarad. Generation of IDUA knockout cell lines by CRISPR/Cas mediated genome editing.Yafte. 2021; 22(4):162-169.
