特殊ポリケチドライブラリの創生を目指して - J-Stage

タイプIモジュラーポリケチド合成酵素（モジュラーPKS）

は，極めて多様な構造の化合物を合成するという特性から，

優 れ た 天 然 の 化 学 工 場 と 言 え る．モ ジ ュ ラ ーPKSは ア シ ルCoAを 基 質 と し て 利 用 す る ポ リ メ ラ ー ゼ で あ り，さ ま ざ ま な ア シ ルCoAを 順 次 縮 合 す る こ と に よ り，一 般 に ポ リ ケチドと総称されるさまざまな化合物を合成する．最近，基 質 と な る ア シ ルCoAの 種 類 が タ ン パ ク 質 合 成 に お け る ア ミ ノ酸のそれに匹敵することが明らかになった．これら多様な ア シ ルCoAを 自 在 に 縮 合 す る こ と が で き れ ば，合 成 し う る 化合物の種類は天文学的な数になる．本稿では，その鍵とな るモジュラーPKSの基質特異性のリプログラミングに関す る最新の研究成果を概説する．

はじめに

抗菌薬として現在でも広く使用されているエリスロマ イシンやその誘導体（クラリスロマイシン，アジスロマ イシン）

，免疫抑制剤として有名なFK-506（別名タクロ

リムス）

，また大村博士のノーベル賞受賞で脚光を浴び

た抗寄生虫薬のイベルメクチン（アベルメクチンの誘導 体）はすべて，微生物（主に放線菌）由来のモジュラー PKSにより自然界で生産されたもの，もしくはその誘 導体である（図

1

_）

．1990年代以前は，天然物やその誘

導体が創薬スクリーニングにおいて非常に重要な位置を 占め，100を超える化合物が薬としてアメリカ食品医薬 品局（FDA）に承認されている⁽¹⁾

．1990年代以降も天

然物をベースとしたスクリーニングは続いていたもの の，利用可能な化合物の数に限界があり，化合物ライブ ラリの構築においては徐々に化学合成が主流となって いった．たとえば，グラクソ・スミスクライン社は 1995年から2001年にかけて，50種類を超える潜在的な 抗菌薬のターゲットに対して約50万種類の合成化合物 を用いてスクリーニング行った．しかしながら蓋を開け てみると，そのヒット率は天然物やその誘導体比べに著 しく低く，100億円規模のこのプロジェクトにおいても 新たな薬は生み出されなかったようである⁽²⁾

．これはグ

ラクソ・スミスクライン社に限った話ではなく，一般に 天然物を模倣していない合成化合物が薬になる確率は非 常に低い．この経験から，最近は再び天然物が薬剤シー ドとして注目を集め始めている⁽³⁾

．しかし，大規模かつ

Toward  the  Construction  of  a  Specialty  Polyketide  Library: 

Engineering a Bacterial Chemical Factory

Satoshi YUZAWA, Biological Systems and Engineering Division,  Lawrence Berkeley National Laboratory

特殊ポリケチドライブラリの創生を目指して

天然の優れた化学工場のリプログラム

湯澤 賢

日本農芸化学会

● 化学 と 生物 

【解説】

高品質な化合物ライブラリをどのように準備するのか．

その答えはまだ模索中と言っていいだろう．以下では，

その解決策の一つとしてモジュラー PKSの基質特異性 の人工的なリプログラミングに着目し，その可能性を掘 り下げていく．

タイプIモジュラーポリケチド合成酵素（モジュ ラーPKS）とは

1991年にアメリカの研究グループによってモジュ ラー PKSの反応機構が初めて提唱された⁽⁴⁾

．

モジュ ラー PKSは多数のタンパク質ドメインからなる巨大な 酵素であり，その大きさはリボソームの大きさに匹敵す る．たとえば，エリスロマイシンの基本骨格である6-デ オキシエリスロノリドB（6-dEB）を合成する6-dEB合 図1■タイプIモジュラーポリケチド合成酵 素由来の天然物あるいはその誘導体

日本農芸化学会

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人類が天然物を治療に用いた歴史は長く，古い例 では紀元前のものもある．おそらく皆さんはペニシ リンという単語を聞いたことがあるだろう．ペニシ リンは1928年にフレミング博士により発見された世 界初の抗菌薬である．その後，ペニシリンはフロー リー博士とチェイン博士によって単離され（ペニシリ

ンはペニシリウム属のカビが生産する），医薬品とし

て感染症の治療に利用できるようになり，第二次世 界大戦において広く用いられた．この功績から，フレ ミング博士，フローリー博士，チェイン博士は1945 年にノーベル生理学・医学賞を受賞した．その7年後 に同じくノーベル生理学・医学賞を受賞したワクス マン博士は，土壌細菌の放線菌に着目し，ストレプト マイシンを含むさまざまな抗菌薬を発見した（ストレ プトマイシンはストレプトマイセス属の細菌が生産 する）．ペニシリンは，抗菌薬の分類では

β

-ラクタム 系に分類され，ストレプトマイシンはアミノグリコシ ド系に分類される．ほかにもさまざまな種類の抗菌 薬があるが，今回の記事に関連するのはマクロライ

ド系である．マクロライド系で最も有名なのは，

1952年にマクロライド系抗菌薬として世界で初めて 実用化されたエリスロマイシン，あるいは2015年に ノーベル生理学・医学賞を受賞した大村博士が発見 したアベルメクチンだろう．エリスロマイシンとア ベルメクチンは放線菌によって生産される．そして これら2つの化合物はともにタイプIモジュラーポリ ケチド合成酵素（モジュラー PKS）によって合成さ れる．モジュラー PKSは，極めて巨大な酵素であり，

自然界に存在する最も大きな酵素の一つである．タ ンパク質を合成するリボソームに匹敵する，あるい はさらに大きいと言えばおそらく驚く読者もいるの ではないか．当然，その大きさゆえ，この酵素を相 手に仕事をするのは容易ではない．しかし，その大 きさには非常に重要な意味があり，その大きさだか らこそ非常に多様な構造の化合物を生み出せるので

ある．また，自然界では，さまざまなモジュラー

PKSの自然交配により，さらなる多様性が今現在も 生み出されている可能性があるが，その進化速度は 遅い．本文では，モジュラー PKSの人工交配により，

自然界を超える多様性を生み出し，新薬を創り出そ うというわれわれの試みについて解説する．

コ ラ ム

成酵素（DEBS）は28の異なるタンパク質ドメインから なり，約2 MDaの酵素として働く．基質は，プロピオ ニルCoAとメチルマロニルCoA, NADPHの3つであり，

これらたった3つの基質から複雑な化学構造をもつ 6-dEBを合成する（図

2

_）

．しかしながら，その反応機構

はそれほど難解ではなく，モジュールと呼ばれる複数の タンパク質ドメインの塊に分割するとわかりやすい．モ ジュールの定義は，ポリケチド鎖伸長反応を1回触媒す るために必要なタンパク質ドメインの塊である．通常，

各モジュールでポリケチド鎖は2炭素伸長される．先に 述べたDEBSの例では，6つのモジュールからなる．し たがって，DEBSではポリケチド鎖開始反応後（プロピ オニルCoAが基質となる）

，2×6＝12炭素伸長されると

いうことである．この ルール は非常に重要で，モ ジュラー PKSはタンパク質の大きさ（モジュールの数）

によってポリケチドの長さをコントロールする．これま で報告された最大のモジュラー PKSはネオメディオマ イシンを合成する酵素で，30モジュールからなり⁽⁵⁾

，60

炭素伸長する．当然，この酵素はリボソームよりもはる

かに大きいということになる．次にモジュラー PKSが 合成しうる化合物の多様性に関して触れておきたい．

DEBSが3つの単純な基質から複雑な化合物を合成する ことはすでに述べた．しかし，各モジュールの基質を変 えることができれば，多種多様な化合物ライブラリを合 成しうる．図

3

に示したように，現在知られているモ ジュールの基質の種類は，タンパク質合成のアミノ酸の それに匹敵する．仮にDEBSの各モジュールで図3に示 した20種類の基質が使えるとしよう．その場合，鎖伸 長反応の基質を変えるだけで，6モジュールで20⁶（約 10⁸）多様性を生み出すことができる．各モジュールに は，伸長反応に必要な触媒ドメインと伸長したポリケチ ド鎖の主鎖の修飾にかかわる触媒ドメインが存在する

（後述）

．主鎖の修飾にかかわる触媒ドメインによる反応

も自在に操作できれば，化合物の多様性は6モジュール で約10¹¹にもなる⁽⁶⁾

．これがたとえば30モジュールとも

なれば，まさに天文学的な数の多様性を生み出すことが 理論的には可能になる．モジュラー PKSは主に放線菌 から単離されてきたが，この巨大なタンパク質はさまざ 図2■タイプIモジュラーポリケチド合成 酵素の反応機構

図3■タイプIモジュラーポリケチド合成酵

素の基質

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まな細菌の種間で進化的に保存されている．一般的に考 えれば，これほど大きなタンパク質を維持するのはコス トがかかるはずだが，合成しうる酵素産物の多様性を考 えれば，そのコストに十分に見合うということなのかも しれない．

基質特異性は変えられるのか？

前項で述べたように，各モジュールはさまざまな基質 を取り込み，ポリケチド鎖を伸長することができる．鎖 伸長反応にかかわる触媒ドメインはケト合成酵素（KS）

ドメイン，アシル転移酵素（AT）ドメイン，アシル キャリアープロテイン（ACP）ドメインの3つである．

したがって，最小のモジュールはこの3つのタンパク質 ドメインのみから構成される（図2のDEBSで言えばモ ジュール3）

．主鎖の修飾にかかわるのは，ケト還元酵

素（KR）ドメインや脱水酵素（DH）ドメイン，エノイ ル還元酵素（ER）ドメインなどである．このうち，基 質の取り込みを担っているのがATドメインであり，モ ジュールの基質特異性を変えたい場合，まずATドメイ ンの基質特異性を変える必要がある．モジュラー PKS の基質特異性のリプログラミングの研究の歴史は古く，

最初の報告は1996年であった⁽⁷⁾

．この論文では，ATド

メインスワッピングという方法を提案している．文字ど おり，ATドメイン全体を別の基質特異性のATドメイ ンに置き換えるという方法である．ATドメインの基質 特異性を変える方法はほかにも提案されているが⁽⁸⁾

，実

はこの最初の方法が，現在まで最も頻繁に用いられてい るものであり，ATドメインスワッピングを使ってこれ までにさまざまな特殊ポリケチドが合成された．この方 法の特筆すべき点は，任意のモジュラー PKSの任意の ATドメインの基質特異性を思いどおりに変えられるこ とである．ただし問題点もあり，8割程度の確率で，生 産性が8割以上落ちてしまうのである^(7〜16)

．基質特異性

を変える前の酵素では，ポリケチドが単位時間当たり 100作れたとしよう．ATドメインスワッピング後は，

特殊ポリケチドの生産量が単位時間当たり20以下にな る確率が8割程度ということである．これは非常に重要 な点でありながら，課題解決に取り組んだ事例は少な く，筆者らが最近論文を発表するまで具体的な解決法は 提示されてこなかった⁽¹⁷⁾

．筆者らが着目したのは，AT

ドメインスワッピングをする際のドメイン境界である．

すなわち，ATドメインがどこから始まり，どこで終わ るかを正確に捉える試みである．複数のタンパク質ドメ インからなる酵素のドメインを丸ごと一つ置き換えるの

は容易なことではない．間違ったドメイン境界を用いれ ば，酵素の4次構造を破壊することにつながり，活性を 著しく失う．モジュラー PKSはモジュール内で複数の 化学反応を順序立てて触媒しており，各ドメインの空間 的配置が非常に重要だと考える．この空間的配置は各反 応によって変わるかもしれない．少なくともACPドメ インの相対的位置は各反応において物理的に変わらざる を得ないことが構造生物学の研究から推測され，非常に 繊細なデザインの上に成り立っているはずである．筆者 らは，さまざまなドメイン境界を利用してATドメイン スワッピングを行い，得られた酵素の活性を で 絶対的に評価した．その結果，任意のモジュールの4次 構造に影響を与えることなく，ATドメインを交換でき る可能性のある境界を発見した（図

4

_）

_{．興味深いこと}

に，筆者らが同定したドメイン境界はアミノ酸配列が高 度に保存されており，自然界におけるモジュラー PKS の進化の観点からもその重要性が示唆された．

特殊ポリケチドライブラリの創生を目指して モジュールの基質特異性を変えるにはATドメインの 基質特異性を変える必要があり，筆者らの最新の研究か ら達成の見通しがつきそうであることを紹介した．しか しまだ第2の障壁があり，それはKSドメインによる鎖 伸長反応における基質特異性である．先に述べたよう に，モジュール内には主鎖の修飾にかかわる触媒ドメイ ンも存在する（KR, DH, ERなど）

．任意のモジュールの

基質特異性を変えた場合，新しい基質とこれらドメイン とのかかわりも考慮しなければならないものの，KSド メインによる鎖伸長がモジュール内の律速反応だと示唆 する研究は多い⁽¹⁸⁾

．したがって，特殊ポリケチドライ

ブラリの創生には，KSドメインの基質特異性の理解と 図4^■最適化されたATドメインスワッピングのドメイン境界

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エンジニアリングが最大の鍵であろうと筆者は考えてい る．では，モジュラー PKSのKSドメインの基質特異性 の理解はどの程度進んでいるのか．たとえば，マイコラ クトンを合成する酵素は16モジュールからなり，各モ ジュールに存在するKSドメインはさまざまな基質を受 け入れ，鎖伸長反応を触媒する必要がある．しかしなが ら，その16のKSドメインの相同性は97％以上である⁽¹⁹⁾

．

この例を見れば，KSドメインは鎖伸長反応において非 常に非特異的であるとの結論に至るが，他のモジュラー PKSにおいてはある程度の基質特異性を示唆する論文 もあり⁽²⁰⁾

，KSドメインのより詳細な理解のためにはさ

らなる研究成果が待たれる．こうした背景から，大規模 かつ高品質な特殊ポリケチドライブラリを実際に用意す るには，任意のKSドメインの基質特異性を予測する高 精度なアルゴリズムが必要不可欠になるであろう．その ためには，さまざまなKSドメインを対象に生化学的，

構造生物学的な研究を行い，その基質特異性の実験的 データを収集することが急務である．信頼できるアルゴ リズムがあれば，どのモジュールに対してATドメイン スワッピングを行えば，特殊ポリケチドを高確率かつ高 い生産量で生合成できるかが予測できるようになるかも しれない．任意のKSドメインの基質特異性を変えるこ ともおそらく可能であろう．モジュラー PKSの基質特 異性のリプログラミングによって合成しうる化合物の新 規性や多様性を考えれば，特殊ポリケチドライブラリを ベースにした創薬スクリーニングによってさまざまな化 合物がこれまでよりも高い確率でFDAに承認される未 来もそう遠くはないと信じている．

おわりに

次世代DNAシーケンサーの導入により，ここ数年に 読まれたゲノムの情報は爆発的に増加している．カナダ のチームによる最新の研究によると，これまで読まれた 微生物のゲノムの数は数万にもなり，このほぼすべてが 2010年以降に読まれたものである⁽²¹⁾

．このうちモジュ

ラー PKSをコードする新規遺伝子の数は約1,000種類も あると予測され，これまでと比較して約10倍の新規ポ リケチドが今後発見される可能性があることを示唆して いる．また，アメリカの研究グループは，1万5,000種 類の放線菌のゲノム情報が得られれば，自然界に存在す るすべてのモジュラー PKSの遺伝子が見つかるだろう と予測しており，その総数は約1万とされる⁽²²⁾

．これは

創薬スクリーニングにとっては大きな励みとなるニュー スかもしれないが，さまざまな問題も想定される．第一

に，それら遺伝子をコードする微生物の培養の難しさで ある．現在われわれが一般的に使用する実験室の条件下 では，地球上の微生物の約1％しか培養できないとも言 われており⁽²³⁾

，残りの99％は微生物を増やす段階にも

至らないのである．次に遺伝子サイレンシングの問題で ある．仮に目的の遺伝子をもつ微生物を研究室で培養で きたとしよう．しかしながら，目的の遺伝子がその条件 下で発現され，実際にその酵素産物を検出できる割合は 2〜3割程度と言われている⁽²⁴⁾

．したがって，ゲノム

シークエンシングにより予測された多様な新規ポリケチ ドを実際に得て，創薬スクリーニングに使用できる可能 性は低いと言わざるを得ない．これでは現在下降の一途 をたどっている薬剤承認率を上げることは難しいのでは ないだろうか．本稿で述べたように，まだまだ発展途上 ではあるが，モジュラー PKS（あるいは非リボソーム 型ペプチド合成酵素とのハイブリッド型のモジュラー PKS）の基質特異性のリプログラミングにより，爆発的 な多様性を生み出すことが新薬発見の近道だと筆者は信 じている．いずれはそれが薬剤開発のスタンダードとな る日が来ることを期待して，分野の発展に貢献できるよ う，これからも尽力していきたい．

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プロフィール

湯 澤  賢（Satoshi YUZAWA）

＜略歴＞2009年東京大学工学系研究科化学 生命工学専攻博士課程修了，博士（工学）／

その後，米国スタンフォード大学，米国カ リフォルニア大学バークレー校，米国ロー レンスバークレー国立研究所にて，ケミカ ルバイオロジーや合成生物学の領域で研究 を推進＜研究テーマと抱負＞新しい化合物 ライブラリを構築するための化学，生物学 的ツールの開発．＜趣味＞アメリカの国立 公園の散策．69ある国立公園のうちこれ まで14公園を制覇

Copyright © 2017 公益社団法人日本農芸化学会 DOI: 10.1271/kagakutoseibutsu.55.611

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