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Title 「顎骨疾患プロジェクトからの情報発信」２１．口唇裂
・口蓋裂の原因遺伝子の追究
Author(s) 渡邊, 章; 柴野, 正康; 吉田, 秀児; 加藤, 宏; 髙野, 正行
Journal 歯科学報, 122(4): 399‑403
URL http://doi.org/10.15041/tdcgakuho.122.399 Right
Description
はじめに
口唇裂・口蓋裂は，遺伝要因と環境要因が相互に 関与した多因子遺伝性疾患と考えられているが，発 症原因は不明のままである（図１）。これまでの再 発危険率や罹患率などの報告から，罹患同胞相対危 険率（λs）は５から１０で遺伝疾患であることが示 唆される１）。また，本疾患は他人種で家族集積性が 指摘されているが，日本人を含むアジア人では，家 族集積は少ないものの諸外国と比べ発症頻度が高い 外表奇形である２）。われわれが，この発症頻度が高 いアジア人を対象に口唇裂・口蓋裂の発症原因の追 究プロジェクトを始めたのがヒトゲノムプロジェク トの完了した２００３年の頃である。本プロジェクト は，長崎大学，愛知学院大学，東京歯科大学の倫理 審査委員会（５８４）の承認を得て行われた。当時，
国内外で行われている SNPs（一塩基多型）を用い た多因子遺伝病と目される疾患の解析においても，
糖尿病，高血圧，アレルギー疾患といった生化学的 にある程度機能的な候補遺伝子に絞ったものが多 かった。なぜなら，当時の手法・知識において，全 ゲノムを対象とした関連研究による連鎖不平衡の検 定は事実上不可能であった。今回，時代とともに変
化する解析技術とこの疾患の原因がどこまで明らか にされたのかを報告する。
サンガーシークエンス法を用いた 変 異 解 析，
SNPs を用いた相関解析（casecontrol study），
TDT（伝達不平衡テスト）
まず，本研究ではこれまでに報告されたノックア ウトマウスにおける表現型などを参考にして候補遺 伝子を選定した。長崎大学，東京歯科大学，愛知学 院大学の共同研究で，日本人患者１４５名およびその 両親２７１名，ベトナム人患者２１０名およびその両親 ２９４名，コントロール日本人４７４名，ベトナム人４７４ 名を対象に行った。候補遺伝子は，RYK（３q２２），
EPHB2（１p３６．１−３５），EPHB3（３q２８−２７），TGF
−B3（１４q２４），DLX3（１７q２３），PAX9（１４q１２−q１３），
CLPTM1（１９q１３．２），TBX10（１１q１３．１），PVRL1
（１１q２３），TBX22（Xq２１．１）の１０遺 伝 子 で あ る。
そして，さまざまな口唇裂・口蓋裂の遺伝形式の可 能性を考慮し，諸外国で家族集積性がある点から単 一遺伝子病と考えサンガーシークエンス法を用いた 変異解析を，多因子遺伝子病と考え SNPs を用いた 相関解析（casecontrol study）および，TDT（伝 達不平衡テスト）での解析の計画を立てた。
変異解析では，日本人唇顎口蓋裂の患者兄弟と母 親でPAX9に６４０A＞G（S２１４G）のミスセンス変異 が認められ，この部位は種を超えて保存されている 領域であった。PAX遺伝子は DNA binding paired domain を持ち，クラスター構造を取らないホメオ ボックス遺伝子の１つであり，特にPAX9は口蓋や 歯の形成に関与している神経提由来の間葉細胞にお
歯学の進歩・現状
「顎骨疾患プロジェクトからの情報発信」
２１．口唇裂・口蓋裂の原因遺伝子の追究
渡邊 章１−３） 柴野正康４） 吉田秀児１−３） 加藤 宏１−３） 髙野正行１）
１）東京歯科大学口腔顎顔面外科学講座
２）口腔科学研究センター
３）東京歯科大学研究ブランディング事業
４）独立行政法人国立病院機構高崎総合医療センター口腔外科
キーワード：私立大学研究ブランディング事業，顎骨疾患 プロジェクト，口唇裂・口蓋裂，多因子遺伝 子病，機能障害
（２０２２年９月１４日受付，２０２２年１０月１１日受理）
http : //doi.org/１０.１５０４１/tdcgakuho.１２２.３９９
連絡先：〒１０１‐００６１ 東京都千代田区神田三崎町２−９−１８ 東京歯科大学口腔顎顔面外科学講座 渡邊 章
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いて幅広く発現している。また，ベトナム人の患者 とその父親に，RYKの１３３５G＞A（Y４５２C）ミスセ ンス変異を認めた。発現ベクターに変異遺伝子を組 み込み NIH３T３細胞にお い て ア ガ ー 上 で の col- ony formation assay を行い，野生型のRYKと比べ 約５０％の活性を示すのみであった３，４）。RYKは，受 容体型のチロシンキナーゼでノックアウトマウスの ８８％以上は二次口蓋の破裂，上顎と下顎骨の発育傷 害，平坦な顔面，短い鼻など特徴的な頭蓋顔面を呈 していた。
SNPs を用 い た 相 関 解 析（casecontrol study）
は，DLX3，TGF−B3，PAX9，CLPTM1内 に 新 規 の SNPs が２７個 確 認 で き た。ま た，TGF−B3（１４q ２４）のみが，相関解析で有意差を認めた。TGF−B3 は細胞の増殖，移動，分化，上皮細胞から間葉組織 への形質転換という生物活性を持っている。特に口 蓋形成に重要であり，口蓋部の正中上皮細胞で発現 し，正中上皮縫合が形成され，消失後に速やかに発 現が止まることが報告されている。このノックアウ トマウスから口蓋裂が生じ，多くの研究者がTGF−
B3と口唇裂・口蓋裂の関係について報告してきた。
IRF6の TDT は，フィリピン，およびコウカシ アン集団での陽性の報告があるが，本プロジェクト では日本人，ベトナム人では全て陰性の結果であっ た。
以上の結果により単一遺伝子病として考えた場合 であれば，RYK，PAX9が疾患発症に関与している 可能性がある。また，多因子遺伝子病として考えた 場合であれば，TGF−B3が何らかの関与が示唆さ れた５）。しかし，口唇裂・口蓋裂の発症を明確に解 明することはできなかった。諸外国で口唇裂・口蓋 裂の発症の関連遺伝子として報告されているものが 日本人では陰性の結果が出ることから，日本人口唇 裂・口蓋裂特有の関連遺伝子の存在が考えられる。
これまで他人種で陽性となった関連遺伝子のすべて をサンガーシークエンサーで解析するには，時間と 経費がかかり，すぐには成果が見込まれず現実的で はなかった。
口唇裂・口蓋裂のゲノムワイド関連解析
（genomewide association study : GWAS）
集団頻度が比較的高い SNPs が主に関与するとさ れ，こ の SNPs を 用 い た ゲ ノ ム ワ イ ド 関 連 解 析
（genomewide association study : GWAS）が急 速に進んだことで，口唇裂・口蓋裂を含めたありふ れた疾患（common disease）の遺伝的要因の同定 が可能となり，１００を超える感受性遺伝子座が口唇 裂・口蓋裂の発生に関与することが明らかになって いる６）。GWAS とはゲノム全体を対象として網羅的 に関連解析を行う手法であり，患者群と対照群の間 図１ 口唇裂・口蓋裂の発症原因モデル
４００ 渡邊，他：口唇裂・口蓋裂の遺伝子研究
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で多型マーカーの保有頻度の差異を統計的に見つけ ることを目的としている。そこで，唇顎口蓋裂患者 検 体１３７人，対 照 者 検 体４９０人 の SNP タ イ ピ ン グ データの比較を行った。minor allele frequency，
HardyWeinberg 平衡 test，SNP call rate などを 用いてタイピング不良 SNP の除去を行った。品質 管理フィルターを設定する事で，全９０９，５０８SNPs のうち MAF＞５％，HWE P 値＞０．００１，SNP call rate＞９５％の 条 件 を 満 た す SNPs は２９９，２２４SNPs となった。有意差を認めた SNP において Genotyp- ing Console 上でプロット図の確認を行い，目で確 認して正確な Genotyping が行われている SNPs を 選別した。その結果，１q３２．２，６q２２．３３，１２q１４．１ の領域に疾患への関与を疑う SNPs の存在を認め た。しかし，十分に有意といえる SNPs の同定には 至らなかった。これまで他人種での GWAS で報告 されている様に期待された結果は 得 ら れ な か っ た７）。１つの理由には検体総数の不足が考えられる が，他人種で Van der Woude 症候群や口唇裂・口 蓋 裂 の 原 因 遺 伝 子 と し て 報 告 さ れ て い る IRF６
（１q３２．２）が浮かび上がってきたことに意味があ ると考えた。
これまで発見された多くの感受性遺伝子座は口唇 裂・口蓋裂の発生への影響力を表す遺伝率が低く，
口唇裂・口蓋裂の発症機序の解明やゲノム診断の実 現には至っていない。発見された GWAS 座位が多 因子疾患の発症にどれくらい影響するかを見積もる ことができる GWAS 遺伝率と双生児遺伝率を比較 した研究では，双生児遺伝率は身長で８０〜９０％，冠 動脈疾患で３０〜６０％，２型糖尿病で２５％とされるの に対し，GWAS 遺伝率は身長で５％，心筋梗塞で ２．８％，２型糖尿病で６％でしかなかった８）。この双 生児遺伝率と GWAS 遺伝率の差は説明できない遺 伝要因（missing heritability）と呼ばれている。原 因は，１）GWAS に用いた SNP はマイナーアリル 頻 度 が５％以 上 の common SNPs で あ り，疾 患 感 受性においてそれほど大きな影響を及ぼしていな かった，２）遺伝子間の相互作用（gene−gene inter- action）および遺伝因子と環境要因の相互作用（gene
−environment interaction）が検討されていなかっ た，３）DNA のメチル化やヒストン修飾などのエ ピゲノムについて検討されていなかったことがあげ
られる９）。特に口唇裂・口蓋裂のような先天性多因 子形質疾患においては，common SNPs ではないレ アバリアントや，遺伝子間の相互作用が疾患発症に 関与すると考えられる。そこで，次世代シークエン サーを用いたゲノム解析を行い，GWAS では明ら かにされなかった新規の遺伝子変異とバリアントの 解明を試みた。
口唇裂・口蓋裂の次世代シークエンサーによる 解析
次世代シークエンサーは DNA を１００〜３００bp 程 の長さに断片化し，断片化された DNA を鋳型配列 に当てはめて並び替え全体の配列を決定すること で，従来のサンガーシークエンス法と比較して，
短時間で目的領域の遺伝子の解析が可能である。
われわれは２０１７年に日本人の唇顎口蓋裂・唇顎裂
（CL/P）患者７８名，口蓋裂（CP）患者１８名とその 両親を対象にしたトリオ解析を，次世代シークエン サ ー を 用 い て 行 っ た。解 析 を 行 っ た 遺 伝 子 は，
GWAS で CL/P または CP の発症に関与するとさ れ たIRF6（１q３２．２），WNT5A（３p１４．３），WNT 9B（１７q２１．３２），TP63（３q２８），MSX1（４p１６），
TFAP2A（６p２４．３），PAX9（１４q１２−q１３），DLX3
（１７q２１．３３），DLX4（１７q２１．３３），MN1（２２q １２．１）の１０遺伝子とした。解析領域は遺伝子をコー ドするエクソン以外に，非コード領域であるイント ロンを含めた。通常，ゲノム解析においてタンパク 質に翻訳されるエクソン領域の配列のみを解読する ことが多いが，非コード領域であるイントロンには 遺伝子の転写量を調整するエンハンサーやプロモー ターとしての機能が存在することから１０遺伝子のイ ントロンを含めた解析を行った。遺伝情報から，マ イナーアレル頻度０．５％以上を除外した。検出され たバリアントはサンガーシークエンス法により確認 を行った。
結果は，１人の CL/P 患者にDLX4のミ ス セ ン ス変異３５９C＞T（P１２０L）を認めた。これはデータ ベース上にない新規の変異であった。DLX 遺伝子 は頭蓋神経堤細胞で発現し最終的に歯，軟骨，頭蓋 顔面骨，および結合組織を形成する間葉組織におい て調節的な役割を果たすとされている。今回発見さ れた CL/P 患者におけるDLX4のミスセンス変異
歯科学報 Vol．１２２，No．４（２０２３） ４０１
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は他の遺伝子の転写を活性化または不活性化するこ とで形態形成の制御遺伝子の機能を持つとされるホ メオドメインに存在しており，Polyphen２，SIFT, PROVEAN を用いたin silico解析の結果にて分子 機能に影響を及ぼす有害な変異であった。また，３ 人 の CL/P 患 者 と２人 の CP 患 者 で，そ れ ぞ れ 非 コード領域の保存配列において新規のバリアントを 認めた。高度に保存された配列は生物の進化におい て維持されてきたことを意味しており，遺伝子発現 量をつかさどるエンハンサーやプロモーターとして の機能を持つとされ，検出された新規のバリアント に関しては更なる検証が必要である。結論としてわ れわれは日本人のみの口唇裂・口蓋裂患者の遺伝子 解析を，次世代シークエンサーを用いて行い，過去 に GWAS では検出できなかった新規の変異とバリ アントを発見することができた１０）。しかし，口唇 裂・口蓋裂の発症原因は明らかになっていない。
今後の展望
口唇裂・口蓋裂をはじめとする多因子疾患のゲノ ム研究は疾患のリスクをわずかに上昇させる SNPs の集積が関与すると考えられ，特定の SNPs 出現頻 度を疾患コホートと正常コホートで比較するという 考え方が基本であった。これは，多因子疾患は「あ りふれた疾患はありふれたバリアントにより起こる という仮説（commondisease commonvariant 仮
説）」に従うであろうと考えられていたからである８）
（図２）。SNPs を用いた GWAS によって多くの口 唇裂・口蓋裂に関連する感受性バリアントが発見さ れたが，発見されたバリアントのほとんどが非コー ド領域にあり，コード領域のバリアントはわずか ４．９％でしかなかった１１）。さらに GWAS で発見され たバリアントは一般にオッズ比が１．０５〜１．２と非常 に弱い効果を示すにすぎなかった。この結果から，
現在の多因子疾患における遺伝学モデルの仮説は，
遺伝子非コード領域の GWAS バリアントの意義 が，遺伝子調節領域にあり遺伝子発現量をつかさど るもので，非常に弱いが非常に多数あるとする説 と，SNPs を用いた GWAS では発見できなかった 未知のレアバリアントが存在する可能性であるとす る２つの説があげられる。この仮説の検証には次世 代シークエンサーを用いて GWAS で検出された口 唇・口蓋裂の感受性座位の網羅的な解析が必要であ る。レアバリアントの検出には GWAS と同様に大 規模なサンプルサイズが必要であり，日本人正常コ ホートと比較するには日本人を対象とした全ゲノム 情報の作成が課題となる。次世代シークエンサーを 用いた網羅的なゲノム解析により，口唇裂・口蓋裂 を含めた多因子疾患のゲノム研究は疾患・遺伝子座 マッピングが盛んに行われ，疾患発現の機序が解明 されたその先には，遺伝的リスクスコアの予測が可 能となるであろう。一方，これまでの本プロジェク
図２ 疾患発症にかかわるゲノム多様性のアレル頻度と効果の大きさの関係
４０２ 渡邊，他：口唇裂・口蓋裂の遺伝子研究
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トで口唇裂・口蓋裂の発症原因の追究は前進したも のの未だ明らかになっていないのが現状である。今 後の展望として DNA のメチル化，ヒストンのメチ ル化，ヒストンのアセチル化などの epgenome 異 常などの今まで捉えられていない構造異常に興味が わく。ロングリードシークエンサーで DNA メチル 化解析に移行し，DNA の配列だけではなく DNA のメチル化で多因子遺伝子疾患の発症メカニズムを 解明していけないかを検討したい。そして，遠い未 来ではあるが口唇裂・口蓋裂の治療が，患者に負担 のかかる手術だけでなく新たな治療を選択できる医 療へと進むことを夢見ている。
謝 辞
本プロジェクトの推進に当たり，多大なるご尽力をし ていただいた東京歯科大学名誉教授 内山健志先生，東 京歯科大学客員教授 山口 朗先生，長崎大学原爆後障 害医療研究所人類遺伝学 吉浦孝一郎先生に大変感謝申 し上げます。
著者の利益相反：開示すべき利益相反はない。
文 献
１）Mossey PA, Modell B : Epidemiology of oral clefts ２０１２：an international perspective, Front Oral Biol，
１６：１−１８，２０１２．
２）Beaty TH, Ruczinski I, Murray JC, et al. : Evidence for gene-environment interaction in a genome wide study of isolated, non-syndromic cleft palate, Genet Epidemiol，３５：４６９−４７８，２０１１．
３）Watanabe A, Akita S, Tin N.T.D, et al. : A Mutation in RYK is a Genetic Factor for Nonsyndromic Cleft
lip and Palate, The Cleft Palate-Craniofacial Jour- nal，４３：３１０−３１６，２００６．
４）渡邊 章，秋田定伯，夏目長門，他：RYK 遺伝子変 異は非症候性の口唇裂・口蓋裂発症における遺伝要 因の一つである，日口蓋裂会誌，３５：９−１７，２０１０．
５）Ichikawa E, Watanabe A, Nakano Y, et al. : PAX９ and TGFB３ are susceptible to nonsyndromic cleft lip with or without cleft palate in the Japanese : Population-based and family-based candidate gene analyses, Journal of Human Genetics，５１：３８−４６，
２００６．
６）McCarthy MI, Abecasis GR, Cardon LR, et al. : Genome-wide association studies for complex traits : consensus, uncertainty and challenges, Nat Rev Genet，９：３５６−３６９，２００８．
７）Hikida M, Tsuda M, Watanabe A, et al. : No evi- dence of association between ８q２４ and susceptibil- ity to nonsyndromic cleft lip with or without palate in Japanese population, The Cleft Palate-Craniofa- cial Journal，４９：７１４−７１７，２０１２．
８）Manolio TA, Collins FS, Cox NJ, et al. : Finding the missing heritability of complex diseases, Nature，
４６１：７４７−７５３，２００９．
９）Eichler EE, Flint Jonathan, Gibson G, et al. : Missing heritability and strategies for finding the underly- ing causes of complex disease, Nat Rev Genet，
１１：４４６−４５０，２０１０．
１０）Shibano M, Watanabe A, Takano N, et al. : Target Capture/Next-Generation Sequencing for Nonsyn- dromic Cleft Lip and Palate in the Japanese Popula- tion, The Cleft Palate-Craniofacial Journal，５７：８０
−８７，２０２０．
１１）Maruano MT, Humbert R, Rynes E, et al. : System- atic localization of common disease−associated variation in regulatory DNA, Science，３３７：１１９０−
１１９５，２０１２．
Report by the Jaw Bone Disease Project
２１：Genetic research of cleft lip and palate by our team
Akira WATANABE１−３），Masayasu SHIBANO４），Shyuji YOSHIDA１−３）
Hiroshi KATO１−３），Masayuki TAKANO１）
１）Department of Oral and Maxillofacial Surgery Tokyo Dental College
２）Oral Health Science Center, Tokyo Dental College
３）Tokyo Dental College Research Branding Project
４）Oral and Maxillofacial Surgery, National Hospital Organization, Takasaki General Medical Center
Key words: Private University Reserch Branding Project, the Jaw Bone disease Project, Cleft lip and palate, gene analayis
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