朝朝朝鮮鮮鮮大大大學學學校校校大大大學學學院院院

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(2)

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20 0 00 0 08 8 8年年年 2 2 2月月月博

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朝朝鮮鮮鮮大大大學學學校校校大大大學學學院院院

醫醫

醫學學學科科科

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朝朝朝鮮鮮鮮大大大學學學校校校大大大學學學院院院

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目目

目次次次圖

圖

圖目目目次次次 ․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․ 222 A

A

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Ⅰ

Ⅰ...序序序論論論․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․ 666

Ⅱ

Ⅱ...硏硏硏究究究對對對象象象 및및및 方方方法法法 ․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․ 888

Ⅲ

Ⅲ...結結結果果果․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․ 111333

Ⅳ

Ⅳ...考考考察察察및및및 結結結論論論․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․111666

Ⅴ

Ⅴ...要要要約約約 ․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․ 222111 參

參

參考考考文文文獻獻獻․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․․ 333444

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圖圖

圖目目目次次次 표

표

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표

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(9)

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Kim JinHwa

Adviser:Prof.BaeHakYoenM.D.,Ph.D.

DepartmentofMedicine

GraduateSchoolofChosunUniversity B

B

Baaaccckkkgggrrrooouuunnnddd:::SyntheticshortinterferingRNAs(siRNAs)havebeenused

successfullytosilencegeneexpressioninavarietyofbiologicalsystemsaswellas vector-basedsiRNA expressionsystems.Inthisexperiment,Ievaluatethepotential ofRNAiasatherapyfordiabetesbydepressionofG6Pase.

M M

Meeettthhhooodddsss:::siRNAsofG6Pasewasconstructed tosiRNA-expressing plasmid DNA (siRNA-pDNA). siRNA-pDNA was injected to alloxan-diabetic mice through tail vein and monitored blood glucose level.The levels ofG6Pase mRNA in liverof miceweremeasuredbyrealtimePCR andG6Paseactivitiesweremeasured.

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Reeesssuuullltttsss :::Postprandialblood glucose levelwas notchanged between controland G6PasesiRNA-pDNA treated alloxan-diabeticmice.The6hrfasting blood glucose levelsofcontrolandG6PasesiRNA-pDNA injectedalloxan-diabeticmicewere210

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±23 mg/dL blood and 119±11 mg/dL blood respectively.The 12hr fasting blood glucose levels ofcontroland G6Pase siRNA-pDNA injected alloxan-diabetic mice were 175±16 mg/dL blood and 95±10 mg/dL blood respectively.G6Pase mRNA levels and enzyme activites were decreased in liver of G6Pase siRNA-pDNA injectedmicecomparedtopDNA injectedcontrolmice.

C C

Cooonnncccllluuusssiiiooonnn:::G6PasesiRNA-pDNA treatmentleadtolowering fastingbloodglucose levels in diabetic mice.This represents that siRNA-pDNA injection sucessfully inducedgenesilencinginmice.

K K

Keeeyyywwwooorrrdddsss:::sssiiiRRRNNNAAA,,,gggllluuucccooossseee666ppphhhooosssppphhhaaatttaaassseee,,,fffaaassstttiiinnnggg bbbllloooooodddgggllluuucccooossseee

(11)

Ⅰ

Ⅰ...서서서론론론

당뇨병은 지속적 고혈당 상태로 대사조절이 적절히 이루어지지 않을 경우 망막병증, 신장병증,신경병증등의 미세혈관 합병증과 죽상경화증 등의 대혈관 합병증을 초래하는 만성 질환이다¹⁾.인류의 대표적인 문명병인 당뇨병은 전 세계적으로 발생률이 증가되 고 있는 추세로 2010년에는 약 120% 증가될 것으로 예측되며 국내에서도 생활양식의 서구화와 신체 활동량 감소,영양 및 의료 수준의 향상에 따른 평균 수명의 연장으로 당뇨병의 유병률이 증가되고 있다²⁾.

당뇨병의 병태생리를 어느 한가지로 단순하게 설명할 수는 없으며 기저상태 및 자극 시 인슐린 분비의 이상,간의 포도당 생성 증가 및 말초조직에서의 인슐린 감수성의 저 하가 중요 요소이다³⁾.

제 1형 당뇨병과 제 2형 당뇨병 모두에서 간의 포도당신합성은 공복혈당의 증가에 있 어서 많은 부분을 기여하는 것으로 알려져 있고⁴⁾,간에서 포도당이 합성되는 과정은 두 가지 다른 경로를 통하여 이루어진다.첫 번째는 공복 기간이 짧을 때 일어나는 글 리코겐 분해이며 두 번째는 공복 기간이 길어질 때 일어나는 포도당신합성 (gluconeogenesis)으로 유산(lactate), 피루브산(pyruvate), 글리세롤(glycerol), 알라닌 (alanine)등과 같은 전구체에서 denovo당 합성이 일어난다.간세포의 포도당신합성 에서 최종단계의 효소로 혈중 포도당 농도조절에 중요한 역할을 하는 효소는 glucose 6phosphatase(G6Pase)과 phosphoenolpyruvate(PEPCK)이며 이들은 당질코르티코이드 와 글루카곤에 의해 유도되며 인슐린에 의해 억제된다.당뇨병 환자에서 이러한 효소들 은 인슐린에 의한 조절 실패로 인하여 만성적으로 상승되어 있으며 그 결과 비정상적 인 혈당 상승이 유발된다⁵⁾.

여러 질병이 유전자 발현변이와 관련이 있음이 밝혀지고 있어 질병의 치료 및 예방을 위해 표적이 되는 유전자를 확인하는 것은 중요한 의미를 지닌다⁶⁾.

(12)

1998년 Andrew Fire와 Craig Mello이 에서 안티센스 RNA를 연구하던 중 두 사슬 RNA(doublestranded RNA;dsRNA)가 상응하는 염기서열(homologousbase sequence)이 있는 mRNA를 파괴하는 RNA 간섭현상을 발견하였다⁷⁾.그후 특정 상동염 기서열 RNA(interferenceRNA:RNAi)를 이용하여 mRNA를 선택적으로 분해시켜 유전 자의 발현을 저해하는 knock-down 현상이 동물세포 및 사람세포에서 나타나는 것이 확인되었으며^8.⁹⁾RNA 간섭현상를 이용한 knock-down 유도기술은 생명과학분야의 연 구에서 매우 유력한 도구가 되어 표적 유전자 확인에 중요한 역할을 할 수 있을것으로 생각된다.Alicia등¹⁰⁾은 간세포의 PEPCK를 RNA 간섭현상을 통하여 knock-down 함 으로서 간세포의 포도당 신합성의 억제를 보고하였고,Liu등¹¹⁾은 RNA 간섭현상을 이 용하여 염류코르티코이드 수용체를 knock-down 함으로써 간세포내의 G6Pase의 발현 을 억제시켜 간세포의 포도당 신합성 억제를 관찰하였다.Cho등¹²⁾은 RNA 간섭현상을 통 하 여 G6Pase와 PEPCK의 전 사 요 소 인 FOXO1의 조 절 인 자 인 protein-tyrosine-phosphatase(PTP) M EG2를 knock-down 시 킴 으 로 서 포 도 당 신 합 성 이 억 제 됨 을 보 고 하 였 다 .

이에 본 연구는 alloxan 당뇨쥐에서 RNA 간섭현상을 이용하여 G6Pase 유전자의 knock-down을 유도하여 간의 포도당신합성에서 G6Pase의 중요성 및 당뇨병 치료에서 G6Pase의 표지 유전자로서의 가능성을 평가하였다.

(13)

Ⅱ

Ⅱ...방방방법법법

1 1

1...실실실험험험동동동물물물의의의 사사사육육육 및및및 당당당뇨뇨뇨병병병 유유유도도도

실험동물 ICR 종 생쥐를 한국 실험동물센터에서 구입하여 사용하였으며 실험동물은 12시간 명암주기,온도 20±2℃ 상대습도 60±5% 의 환경에서 사육하였다. 당뇨병 유 발은 생쥐(체중 25±2g,8주령,수컷)에 alloxan(80mg/kg BW)를 근육 주사하여 1주 일 후 식후 혈당량이 600mg/dL 이상인 생쥐를 alloxan당뇨생쥐로 실험에 이용하였 다.

2 2

2...GGG666PPPaaassseee---sssiiiRRRNNNAAA 플플플라라라스스스미미미드드드 벡벡벡터터터(((GGG666PPPaaassseee---pppDDDNNNAAA)))조조조성성성

생쥐 G6Pase siRNA의 염기서열은 foreward strand, 5′ -GAAUGUGUGUACUGCAAGCdTdT-3′와 reverse strand, 5′ -GCUUGCAGUACACACAUUCdTdT-3′를 DNA 합성회사(Bioneer.Korea)에 의뢰하 여 합성하였다.합성된 G6PasesiRNA 발현 DNA forewardstrand와 reversestrand를 1:1 비율로 혼합하여 95°C에서 10 분 동안, 실온에서 2시간동안 반응시켜 G6Pase-siRNA 발현 DNA를 제조하였다.G6Pase-siRNA 발현 plasmid는 시험관에 10× LigationBuffer1㎕,ddH2O 4.5㎕,pSUPER 3㎕,InsertDNA(G6Pase-siRNA 발 현 DNA)1㎕ 및 T4DNA ligase0.5㎕를 혼합하여 16℃에서 12시간 동안 반응시켰다.

반응이 끝난 plasmid vector는 competentcell에 형질전환 시켜서 배양한 후 plasmid DNA isolation kit(TaKaRa, Japan)을 이용하여 분리시킨 후 G6Pase-siRNA expression plasmid DNA(G6Pase-pDNA)로,pSUPER DNA(pDNA)를 대조군으로 이 용하였다.

(14)

3 3

3... GGG666PPPaaassseee---pppDDDNNNAAA 투투투여여여 및및및 혈혈혈당당당 측측측정정정

실험군은 당뇨생쥐(혈당량이 600mg/dL 이상)를 대조군(10마리),pDNA 투여군(10 마리),G6Pase-pDNA 투여군(10마리)으로 나누어 실시하였다.실험은 실험동물을 12 시간 절식시킨 후 대조군에는 생리식염수 1㎖를, pDNA 투여군에는 pDNA 10 ng/10gBW,G6Pase-pDNA 투여군에는 G6Pase-pDNA 10ng/10gBW을 생리식염수 1㎖에 용해시켜 꼬리 정맥으로 1회 주사하였다. 혈당은 실험 시작 전과 1,3,6,8, 14및 21일 경과 후 각각 꼬리를 절단하고 혈액을 채취하여 측정하였다.혈당의 측정 은 glucoseoxidase법에 근거한 간이 혈당측정기(GlucotrendII,Roche,Swiss)를 이 용하였다.

4 4

4...생생생쥐쥐쥐 간간간 RRRNNNAAA 추추추출출출

시료 투여 3주 후 생쥐 간에서 G6Pase 유전자 발현을 알기 위하여 RT-PCR 과 real-timePCR 법의 시행을 위한 RNA 를 추출 분리하였다.

생쥐를 ether로 마취하여 도살한 후 간을 절제하여, 간조직 0.1gm에 TRI Regant(Qiagen GmbH,Hilden,Germany)를 첨가해 균질화 하고,균질액 0.2㎖을 취하 여 chloroform 0.2㎖을 첨가하고 잘 혼합하였다.혼합된 시료를 실온에서 15분간 방치 한 후 4℃에서 12,000×g로 15분간 원심분리하여 상층액을 수집하였다.수집액 0.1㎖ 에 isopropanol 0.5㎖을 첨가하여 혼합한 후, 실온에서 5-10분간 방치하고, 4℃에서 12,000×g로 15분간 원심분리하여 상층액을 제거하였다.침전물에 75% ethanol1㎖ 을 첨가하여 잘 혼합한 후 5분간 원심분리하여 상층액을 제거하고 침전물을 건조시켜서 0.1% DEPC 용액 50㎕을 첨가하여 55-60℃에서 용해시켜 RT-PCR 과 realtimePCR 를 위한 RNA 시료로 사용하였다.

(15)

5 5

5...cccDDDNNNAAA 합합합성성성 및및및 중중중합합합효효효소소소연연연쇄쇄쇄반반반응응응

역전사 반응은 random hexamer를 primer로 하여 역전사 효소 RAV-2(TaKaRa Japan)을 이용하여 실시하였다.즉 추출된 RNA 10㎕에 primer2㎕ 를 넣어 95℃에서 5분 동안 방치한 후 다시 얼음에서 5분 동안 보관한 후,diethylpyrocarbonate(DEPC) 로 처리된 증류수 20㎕,5×PCR buffer 10㎕,0.1M dTT 5㎕,10mM dNTP 2㎕, RNAsin 1㎕,reversetranscriptase1㎕를 넣고 37℃에서 1시간 반응시켜 cDNA를 합 성하였다.

PCR은 DEPC 처리된 증류수 30.5㎕,10×PCR buffer5㎕,25mM MgCl26㎕,10mM dNTPs 1㎕,forward primer 1㎕,reverse primer 1㎕,cDNA template 5㎕,Taq polymerase(5U/㎕)0.5㎕를 혼합하였다.PCR 조건은 변성(denaturation)95℃에서 45 초,재생(annealing)50℃에서 45초,그리고 합성(polymerization)72℃에서 1분을 설정 하여 32cycles을 거친 다음 72℃에서 10분 동안 반응시켜서 -4℃에 보관하였다.PCR 로 증폭된 산물을 확인하기 위하여 10㎕의 PCR 산물을 2㎕의 gelloading buffer (0.25% bromophenolbluetracking dyein 25% Ficoll)와 혼합하여 1.5% agarosegel, TAE buffer (0.04M tris-acetate, 0.001M EDTA), mini-gel electrophoresis unit (MUPID-2)을 사용하여 80V로 30분간 전개하였다.전기영동 후 agarose gel을 0.1%

ethidiumebromide용액으로 염색하고 UV-transilluminator에서 나타난 DNA band를 사진 촬영하여 대조군과 실험군의 band밀도를 imageanalyzer(1D ver.2.1,pharmacia biotech,USA)로 측정하여 비교하였다(Table1).

6 6

6...RRReeeaaallltttiiimmmeeeRRRTTT---PPPCCCRRR

G6Pase 와 GAPDH(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)의 primer제작은 컴퓨터 프로그램(DNASTA:Version 5.00, Madison,USA)을 이용하여 PCR 산물이 두개 이상의 exon을 포함되도록 제작하였고,PCR 산물의 염기서열이 genBanK의 데이

(16)

터 베이스와 100% 상동성이 나타나는 것을 확인하였다. 제작된 primer에 cybergreen(Cybergreen Premix Sol : Bioneer. Co. Korea)을 표지하여 exicycler(Bioneer.Co.Korea)로 48℃ 로 30분, 94℃ 5분간 방치한 후 60℃ 1분,94℃ 30초로 40cycles를 반응시켰다.

반응이 끝난 후 표준 G6PaseDNA의 량에 따른 평균 cycle역치 (averagesofcycle ofthreshold;Ct)값을 계산하여 표준곡선을 만든 후 이를 이용하여 mRNA 량을 정량 하였다.

7 7

7...효효효소소소활활활성성성도도도측측측정정정

간조직을 0.2gm 절제하여 미리 냉각된 Tris-HCl완충액(Tris-HCl0.05M,sucrose 0.25M,EDTA 0.005M,2-mercaptoethanol0.005M,glucose0.01M,pH 7.4)0.8㎖ 를 첨가하여 균질화 시킨 후 12000rpm로 15분간 원심분리 시킨 후 상층액을 모아서 효 소 활성 측정을 위한 시료로 사용하였다.Glucokinase(GK)활성도는 Alegre등¹³⁾방법 에 따라서 NADP+ 와 glucose-6-phosphate dehydrogenase를 이용한 spectrophotometric방법으로 측정하였고,G6Pase활성도는 glucose6phosphate와 효 소액을 혼합하여 유리되는 phosphate량을 측정하는 방법인 DavidsonAL 등¹⁴⁾의 방법 에 따라서 측정하였다. Fructose 1,6-bisphosphatase(FBPase)활성도는 fructose-6-phophate 와 NADP+ 환원반응을 이용하여 측정하는 El-Maghrabi등¹⁵⁾의 방법,phosphofructokinase활성도는 생성된 fructose-1,6-phophate와 NADH 산화반응 을 이용하여 측정하는 KempRG¹⁶⁾의 방법에 의해서 측정하였다.

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8 8

8...실실실험험험결결결과과과의의의 분분분석석석

모든 측정결과는 평균±표준편차로 표시하였고,실험결과는 SPSS version 13.0을 이용 하여 Duncan'smultiplerangetest에 의해서 유의성을 검정하여 p<0.05를 유의한 것으 로 판정하였다.

(18)

Ⅲ

Ⅲ...결결결과과과 1

1

1...GGGllluuucccooossseee666ppphhhooosssppphhhaaatttaaassseee--- pppDDDNNNAAA를를를 주주주입입입한한한 aaalllllloooxxxaaannn 당당당뇨뇨뇨쥐쥐쥐에에에서서서 식식식후후후의의의 혈혈혈당당당변변변 화

화 화

식이제한을 하지 않은 alloxan 당뇨쥐에서 식후의 혈당 변화는 3일,7일,14일,21일, 28일 혈당을 측정한 결과 모두 500mg/dL이상으로 시작일과 비교하여 유의한 감소가 관찰되지 않았다(Fig.1).

2 2

2...GGGllluuucccooossseee666ppphhhooosssppphhhaaatttaaassseee--- pppDDDNNNAAA를를를 주주주입입입한한한 aaalllllloooxxxaaannn 당당당뇨뇨뇨쥐쥐쥐에에에서서서 111222시시시간간간 식식식이이이제제제 한

한

한 후후후 혈혈혈당당당변변변화화화

12시간 식이제한 후 혈당변화는 1마리의 alloxan당뇨쥐를 제외한 4마리의 alloxan당 뇨쥐에서 3일째부터 혈당의 감소가 관찰되기 시작하여 14일 째에는 4마리 모두에서 300mg/dL 미만으로의 혈당 감소가 관찰되었고,공복시 유의한 혈당 감소 효과는 28 일까지 지속되었다(p<0.01,Fig.2).

3 3

3...pppDDDNNNAAA를를를 주주주입입입한한한 aaalllllloooxxxaaannn당당당뇨뇨뇨쥐쥐쥐에에에서서서 111222시시시간간간 식식식이이이제제제한한한 후후후 혈혈혈당당당변변변화화화

12시간 식이제한 후 혈당변화는 alloxan 당뇨쥐 모두에서 300mg/dL 미만으로의 혈 당 감소는 관찰되지 않았고 시작일과 비교하여 유의한 감소가 관찰되지 않았다(Fig.

3).

4 4

4...GGGllluuucccooossseee666ppphhhooosssppphhhaaatttaaassseee--- pppDDDNNNAAA를를를 주주주입입입한한한 aaalllllloooxxxaaannn 당당당뇨뇨뇨쥐쥐쥐의의의 간간간에에에서서서 gggllluuucccooossseee666 p

p

phhhooosssppphhhaaatttaaassseee의의의 활활활성성성도도도

Glucose6phosphatase-pDNA를 주입한 군과 pDNA를 주입한 군,대조군에서 간의 glucose6phosphatase활성도를 비교한 결과 glucose6phosphatase- pDNA를 주입

(19)

한 군의 활성도는 8.5U/g,pDNA를 주입한 군의 활성도는 12.9U/g,대조군의 활성도 는 12.4U/g로 glucose6phosphatase- pDNA를 주입한 군의 G6Pase활성도가 유의 하게 감소되었다(p<0.01,Fig.4).

5 5

5... GGGllluuucccooossseee 666 ppphhhooosssppphhhaaatttaaassseee --- pppDDDNNNAAA를를를 주주주입입입한한한 aaalllllloooxxxaaannn 당당당뇨뇨뇨쥐쥐쥐의의의 간간간에에에서서서 g

g

gllluuucccoookkkiiinnnaaassseee의의의 활활활성성성도도도

Glucose6phosphatase-pDNA를 주입한 군과 pDNA를 주입한 군,대조군에서 간의 gluckinase활성도를 비교한 결과 glucose6phosphatase-pDNA를 주입한 군의 활성 도는 49U/g,pDNA를 주입한 군의 활성도는 54U/g,대조군의 활성도는 52U/g로 서 로간의 유의한 차이는 없었다(Fig.5).

6 6

6... GGGllluuucccooossseee 666 ppphhhooosssppphhhaaatttaaassseee --- pppDDDNNNAAA를를를 주주주입입입한한한 aaalllllloooxxxaaannn 당당당뇨뇨뇨쥐쥐쥐의의의 간간간에에에서서서 p

p

phhhooosssppphhhooofffrrruuuccctttoookkkiiinnnaaassseee의의의 활활활성성성도도도

Glucose6phosphatase-pDNA를 주입한 군과 pDNA를 주입한 군,대조군에서 간의 phosphofructokinase활성도를 비교한 결과 glucose6phosphatase- pDNA를 주입한 군의 활성도는 10.8U/g,pDNA를 주입한 군의 활성도는 10U/g,대조군의 활성도는 9.8U/g로 서로간의 유의한 차이는 없었다(Fig.6).

7 7

7...GGGllluuucccooossseee666 ppphhhooosssppphhhaaatttaaassseee--- pppDDDNNNAAA를를를 주주주입입입한한한 aaalllllloooxxxaaannn 당당당뇨뇨뇨쥐쥐쥐의의의 간간간에에에서서서 fffrrruuuccctttooossseee 1

1

1...666---bbbiiisssppphhhooosssppphhhaaatttaaassseee의의의 활활활성성성도도도

Glucose6phosphatase-pDNA를 주입한 군과 pDNA를 주입한 군,대조군에서 간의 fructose1.6-bisphosphatase활성도를 비교한 결과 glucose6phosphatase- pDNA를 주입한 군의 활성도는 8.2U/g,pDNA를 주입한 군의 활성도는 7.5U/g,대조군의 활 성도는 7.8U/g로 서로간의 유의한 차이는 관찰되지 않았다(Fig.7).

(20)

8 8

8...GGGllluuucccooossseee666ppphhhooosssppphhhaaatttaaassseee--- pppDDDNNNAAA를를를 주주주입입입한한한 aaalllllloooxxxaaannn 당당당뇨뇨뇨쥐쥐쥐의의의 간간간에에에서서서 RRRTTT---PPPCCCRRR 로

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로 측측측정정정한한한 gggllluuucccooossseee666ppphhhoooppphhhaaatttaaassseeemmmRRRNNNAAA량량량

Glucose 6 phosphatase - pDNA를 주입한 군과 pDNA를 주입한 군,대조군에서 RT-PCR로 측정한 간의 glucose 6 phophatase mRNA량을 비교한 결과 glucose 6 phosphatase- pDNA를 주입한 군은 0.41G6Pase/GAPDH ratio,pDNA를 주입한 군 은 0.65 G6Pase/GAPDH ratio, 대조군은 0.6 G6Pase/GAPDH ratio로 glucose 6 phosphatase-pDNA를 주입한 군에서 유의한 감소가 관찰되었다(p<0.01,Fig.8).

9 9

9...GGGllluuucccooossseee666ppphhhooosssppphhhaaatttaaassseee--- pppDDDNNNAAA를를를 주주주입입입한한한 aaalllllloooxxxaaannn 당당당뇨뇨뇨쥐쥐쥐의의의 간간간에에에서서서 rrreeeaaallltttiiimmmeee -

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-PPPCCCRRR로로로 측측측정정정한한한 gggllluuucccooossseee666ppphhhoooppphhhaaatttaaassseeemmmRRRNNNAAA량량량

Glucose 6 phosphatase - pDNA를 주입한 군과 pDNA를 주입한 군,대조군에서 realtime - PCR로 측정한 간의 glucose 6 phophatase mRNA량을 비교한 결과 glucose 6 phosphatase - pDNA를 주입한 군에서 유의한 감소가 관찰되었다(p<0.01, Fig.9).

(21)

Ⅳ

Ⅳ...고고고찰찰찰 및및및 결결결론론론

경제성장과 더불어 우리나라의 당뇨병 유병률은 증가되고 있고 이로 인한 사망률 또 한 증가하여 당뇨병은 국민보건상의 중요한 문제로 대두되었다¹⁾.당뇨병은 다양한 원 인에 의해서 초래되는 복합적인 대사질환으로 에너지 대사에 불균형을 초래하여 고혈 당을 유발한다.지속적인 고혈당은 만성합병증 발생과 높은 상관관계를 지니므로 혈당 을 최대한 정상치에 가깝게 유지하기 위한 여러 노력들이 계속되고 있다^2,³⁾.

사람에서 에너지대사의 조절은 호르몬,외부영양소,여러 장기들 사이의 물질교환 등 복잡한 상호 작용을 통하여 이루어지며 이는 신체의 모든 장기에 일정하고 적절한 에 너지를 공급하기 위해 정교하게 디자인 되어있다¹⁷⁾.탄수화물 대사의 대표적인 경로는 해당작용,TCA 회로,펜토스인산회로,글리코겐 합성,글리코겐분해,포도당신합성등 이다.포도당신합성과 해당경로의 대표적인 조절기전은 대사과정에 생기는 중간체의 공 급상태에 의한 조절,유전자 상태 및 단백질 합성에 의한 효소활성에 의한 조절 그리고 인슐린,글루카곤,카테콜아민 등의 호르몬에 의한 조절이다¹⁸⁾.12시간 정도를 금식할 경우 몸에 저장된 글리코겐이 분해되어 에너지원으로 이용되게 되고 유산과 아미노산 을 이용한 포도당신합성이 이루어지기 시작한다⁵⁾.이후 지방 조직에서 유래한 글리세 롤이 포도당신합성의 기질을 제공하게 되고 이것에 의존하는 에너지 조정상태가 유지 된다.이러한 기전은 혈액 내 인슐린의 감소와 간문맥내의 글루카곤에 의하여 이루어진 다.간과 신장은 충분한 양의 glucose6phophatase(G6Pase)를 가지고 있어 글리코겐 의 분해와 포도당신합성을 통하여 상당량의 포도당을 유리시킬 수 있다¹⁹⁾.근육은 우리 몸의 대부분의 글리코겐을 차지하나 G6Pase가 부족하여 혈액내의 포도당 농도를 유지 시키는 데는 직접적인 기여를 하지 못한다²⁰⁾.즉 간에서 글리코겐의 분해와 포도당신합 성이 일어나 우리 몸 전체의 포도당 요구량을 만족시키는데 필요한 대부분의 포도당을 제공하게 된다.식사를 하게되면 소화관에서 당질의 흡수가 일어나고 이로 인해 문정맥

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으로 인슐린이 분비되어 간세포의 포도당신합성을 즉각적으로 억제한다.인슐린의 간세 포에 대한 작용이 올바르게 이루어지지 않으면 간의 포도당신합성과 소화관에서의 포 도당 흡수에 의해 혈중 포도당 농도가 급격히 상승하게 된다²¹⁾.

제2형 당뇨병의 병태생리를 어느 한가지로 단순하게 설명할 수는 없다.기저상태 및 자극시 인슐린 분비의 이상,간의 포도당 생산 증가 및 말초조직에서의 인슐린 감수성 의 저하가 중요한 요소이고,이 세가지 병인의 상대적 중요성에 대해 많은 논란이 있다

3).제 1형 당뇨병과 제 2형 당뇨병 모두에서 간의 포도당신합성은 공복혈당의 증가 및 식후혈당의 증가에 있어서 많은 부분을 기여하는 것으로 알려져 있다⁴⁾.제2형 당뇨병 의 많은 환자에서 공복시의 혈중 인슐린 농도가 상승되어 있고 인슐린이 간의 포도당 배출의 강력한 억제효과를 가지고 있음을 감안하면 어떤 종류든 간세포의 인슐린저항 성이 존재하는 것을 짐작할 수 있다.실제로 간의 당생산 이상 정도는 공복시 고혈당의 정도와 양의 상관관계를 보이는데 이는 간의 당생산이 공복혈당을 결정하는 중요한 인 자임을 의미한다²²⁾.

글루카곤이 인산화 상태에 따라 해당과정과 포도당 신합성 과정을 조절할 수 있는 효 소인 6-phosphofructo-2-kinase/fructose-2,6-bisphosphatase를 인산화 시키면 이 효소 는 fructose-2,6-bisphosphatase로 작용하여 fructose-2,6-bisphophate를 감소시킨다.

fructose-2,6-bisphophate가 감소하면 phosphofructokinase의 활성이 억제되어 해당반응 이 감소하는 동시에 fructose-1,6-bisphosphatse의 활성이 자극되어 포도당 신합성이 증가한다²³⁾.간의 당대사 조절에 관여하는 몇 개의 효소들의 유전자들은 포도당과 인슐 린 등 에 의 해 조 절 되 는 데 , 해 당 경 로 의 glucokinase(GK), 6-phosphofructo-1-kinase(6PF-1-K),pyruvate kinase(PK) 등은 인슐린에 의 해 각각의 유전자 표현이 증가되어 효소활성도의 증가가 나타나며,포도당신합 성 경 로 의 phosphoenolpyruvate carboxykinase(PEPCK), fructose-1,6-biphosphatase, glucose-6-phosphatase 등은 인슐린의 유전자

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표현 억제에 의한 효소활성 저하로 혈당강하가 나타나는 것으로 되어 있다.Kinase와 phophatase의 역할을 동시에 가지고 기질 상태 등에 따라 그 역할이 반전되는 효소인 6-phosphofructo-2-kinase/fructose-2,6-biphosphatase은 인슐린에 의해 그 효소활성이 증대된다^24,²⁵⁾.

간세포에서 포도당신합성의 최종단계의 효소로 혈중 포도당 농도조절에 중요한 역할 을 하는 효소는 glucose6phosphatase(G6Pase)이다²⁶⁾.인슐린의 세포에 대한 신호전달 경로가 일반적인 경우에 있어서는 많은 부분이 밝혀져 왔으나,특별한 하나하나의 유전 자에 미치는 효과에 대해서는 아직도 많은 연구가 필요하다.G6Pase유전자도 그중의 하나로서 이것은 PEPCK와 유사하게 인슐린 등에 의해 매우 민감하게 억제되며 glucocorticoid,cAMP등에 의해 자극되어진다²⁷⁾.이 효소는 당뇨병에 걸린 쥐에서 증가 되고 기아상태에 의해 자극되며,인슐린 치료나 음식물 섭취등에 의해 억제된다²⁸⁾. Lange등²⁹⁾에 의해 G6Pase의 cDNA가 cloning된 후 이 유전자에 대한 적극적인 연구 가 이루어져 왔다.지금까지 약 3,000여 가지의 질병이 유전자 발현변이와 관계가 있다 고 밝혀지고 있고, 유전자와 질병간의 상관관계는 기능유전체 연구가 진행되면서 더욱 증가하리라 예측된다⁶⁾.그러므로 질병의 치료 및 예방을 위한 신약을 개발하는데 표적 이 되는 유전자를 발굴 하는것은 매우 중요하다.질병과 연관된 생리 현상들은 거의 모 두 여러 유전자 산물이 관여하며 그 관여하는 유전자 중 어떤 유전자가 약물의 가장 우수한 표적이 될 수 있는 지를 조사하는 것은 중요한 의미를 지닌다.

본 연구는 Alloxan당뇨쥐에서 RNAi를 통하여 G6Pase유전자의 knock-down을 유도 하여 간의 포도당신합성에서 G6Pase의 중요성 및 당뇨병 치료에서 RNAi기술의 가능 성을 조사하였다.

과거 RNA는 DNA에 담겨있는 유전정보를 단백질로 변환시키는 과정에서 단순히 전 달자의 역할만 하는 조연으로 인식되어 왔으나,다양한 형태로 존재가 알려지고 있는 smallRNA가 유전자의 발현조절과정에 다양한 형태로 관여해 세포의 기능을 총괄 조

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정하는 지휘자로 밝혀지면서,이제 RNA 연구가 전격적으로 무대전면에 등장하였다.최 근 수년 간 non-coding RNA 연구를 통하여 다양한 종류의 smallRNA가 발견되었는 데 이들 smallRNA들은 같은 종류의 non-coding RNA를 비롯해 mRNA,DNA,그리 고 단백질과의 상호작용에 의해 유전자 별현을 조절하는 것으로 밝혀지고 있다^30,³¹⁾.

진핵세포에서 두 사슬 RNA(doublestranded RNA:dsDNA)는 mRNA 파괴,전사억제 및 전이 억제작용을 나타낼 수 있는데,상응하는 염기서열(homologousbasesequence) 이 있는 mRNA를 파괴하는 것을 RNA 간섭현상(RNA-mediated interference;RNAi) 이라 한다^7,³²⁾.RNA간섭은 대표적인 전사후 유전자 발현억제(posttranscriptionalgene silencing)기전으로 알려져 있다³³⁾. RNA 간섭 현상은 dsRNA를 이용하여 그 RNA에 상응하는 특정 유전자 mRNA을 선택적으로 분해함으로서 유전자 발현을 정지 (silencing)시키는 것이 기본 원리이다^34,³⁵⁾.RNAi현상은 21-23개의 nucleotide를 갖는 dsRNA 조각 (siRNA-smallinterfering RNA)에 의해서 나타나는 것으로 알려져 있다

36,37). RNA 간섭 현상은 1998년도에 Andrew Fire와 CraigMello이 에서 안 티센스 RNA를 연구하던 중에 처음으로 발견되어 보고 되었고⁷⁾,이후 초파리,식물에 서도 확인되었으며,최근에는 동물세포나 인간세포에서도 같은 현상이 일어나는 것으로 보고 되었다^8,⁹⁾.RNAi를 이용하여 mRNA를 분해시켜 특정 유전자의 발현을 저해하는 knock-down 현상이 동물세포 및 사람세포에서 나타나는 것이 확인되었는데^8,⁹⁾,RNAi 를 이용한 knock-down 유도기술은 생명과학분야의 연구에서 매우 유력한 도구가 될 수 있을 뿐만 아니라 유전자 기능 분석 연구,약제의 표지 유전자 발굴 및 신개념의 유 전자 치료제 개발등 생명공학 연구 전반에 걸쳐 응용되고 있다³⁸⁾.

siRNA에 의한 RNAi현상이 동일한 유전자를 다양한 수준에서 발현억제를 유도할 수 있다는 점은 기존의 knock-outsystem에 의한 유전자발현 억제에 비해 보다 유연 하게,그리고 유전자기능에 따라 다양하게 적용될 수 있다는 장점을 가지고 있다³⁷⁾.

본 연구는 G6PasesiRNA expression vector인 G6Pase- pDNA를 주입하여 G6Pase

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유전자 발현억제 후 시간 경과에 따른 혈당 변화를 관찰하고 효소 활성도를 측정하였 다.G6Pase-pDNA를 주입한 alloxan당뇨쥐의 식후 혈당 변화는 모두 500mg/dL이 상으로 시작일과 비교하여 유의한 감소가 관찰되지 않았으나(Fig.1),12시간 식이제한 후 혈당변화는 1마리의 alloxan 당뇨쥐를 제외한 4마리의 alloxan 당뇨쥐에서 3일째부 터 혈당의 감소되기 시작하여 14일 째에는 4마리 모두에서 300mg/dL 미만으로의 혈 당 감소가 관찰되었고,이러한 효과는 28일까지 지속되었다(p<0.01,Fig.2).G6Pase- pDNA를 주입한 alloxan 당뇨쥐와는 달리 pDNA를 주입한 alloxan 당뇨쥐에서는 시작 일과 비교하여 유의한 혈당 감소가 관찰되지 않았는데(Fig.3),이는 G6Pase유전자의 발현억제가 포도당신생성을 감소시킴을 추측하게 하였다. 실제로 glucose 6 phosphatase- pDNA를 주입한 alloxan 당뇨쥐의 간에서 glucose6phosphatase의 활 성도를 pDNA를 주입한 군 및 대조군과 비교한 결과 유의가 감소가 관찰되었다 (p<0.01,Fig.4).이러한 공복혈당의 감소가 간의 해당경로를 통한 글리코겐 분해의 영 향일 가능성을 배제하기 위하여 glucokinase와 phosphofructokinase의 활성도를 측정한 결과 대조군과 유의한 차이가 관찰되지 않았다.또한.간의 포도당 신합성 과정중의 다 른 효소의 억제에 의한 효과인지를 감별하기 위하여 fructose1,6-bisphosphatase의 활 성도를 측정하여 비교한 결과 유의한 차이는 관찰되지 않아 G6Pase의 영향임을 알 수 있었다(Fig.5,6,7).glucose6phosphatase- pDNA를 주입한 alloxan당뇨쥐의 간에서 glucose 6 phophatase mRNA량을 RT-PCR과 realtime-PCR로 측정한 결과 유의한 감소가 관찰되었다(Fig.8,9).

결론적으로,RNAi기술을 이용한 G6Pase유전자 발현억제는 alloxan 당뇨쥐에서 간 의 포도당신합성을 감소시켜 공복혈당 상승을 억제함이 관찰되었다.이는 향후 당뇨병 유전자 치료에서 G6Pase가 중요한 표지 유전자로 이용될 수 있는 가능성을 시사한다 하겠다.

그러나 본 연구의 결과는 alloxan 당뇨쥐를 대상으로 하였으므로 당뇨병 환자에게 모

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두 적용하기는 어려울 것으로 사료되며 4주라는 비교적 단기간의 연구여서 장기간의 효과에 대한 더 많은 연구가 필요하리라 생각된다.

(27)

Ⅴ

Ⅴ...요요요약약약 연

연

연구구구배배배경경경:제1형 당뇨병과 제2형 당뇨병 모두에서 간의 포도당신합성은 공복혈당의 증 가 및 식후혈당의 증가에 있어서 많은 부분을 기여하는 것으로 알려져 있다.간세포의 포도당신합성에서 최종단계의 효소로 혈중 포도당 농도조절에 중요한 역할을 하는 효 소는 glucose 6 phosphatase(G6Pase)이다.이에 alloxan 당뇨쥐에서 RNAi를 통하여 G6Pase 유전자의 knock-down을 유도하여 간의 포도당신합성에서 G6Pase의 중요성 및 당뇨병 치료에서 G6Pase의 표지 유전자로서의 가능성을 평가하고자 본 연구를 시 행하였다.

방 방

방법법법:Alloxan 당뇨쥐에 G6PasesiRNA expression vector인 G6Pase- pDNA를 주입 하여 G6Pase유전자 발현억제 후 시간 경과에 따른 혈당 변화를 관찰하고 glucose6 phosphatase의 활 성 도 및 glucokinase, phosphofructokinase, fructose 1,6-bisphosphatase의 활성도를 측정하여 비교하였으며 glucose 6 phosphatase - pDNA를 주입한 alloxan 당뇨쥐의 간에서 glucose 6 phophatase mRNA량을 RT-PCR과 realtime-PCR로 측정하였다.

결 결

결과과과:식후혈당 변화는 관찰되지 않았으나 12시간 식이제한 후 혈당변화는 1마리의 alloxan당뇨쥐를 제외한 4마리의 alloxan당뇨쥐에서 3일째부터 혈당의 감소되기 시작 하여 14일 째에는 4마리 모두에서 300mg/dL 미만으로 혈당 감소가 관찰되었고,이러 한 효과는 28일까지 지속되었다.이는 G6Pase유전자의 발현억제가 포도당신생성을 감 소시킴을 추측할 수 있었다.실제로 glucose6phosphatase- pDNA를 주입한 alloxan 당뇨쥐의 간에서 glucose6phosphatase의 활성도를 pDNA를 주입한 군 및 대조군과 비교한 결과 유의가 감소가 관찰되었다.이러한 공복혈당의 감소가 간의 포도당신합성 과정중의 다른 효소의 억제에 의한 효과인지를 감별하기 위하여 glucokinase, phosphofructokinase,fructose 1,6-bisphosphatase의 활성도를 측정하여 비교한 결과

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유의한 차이는 관찰되지 않아 G6Pase의 영향임을 알 수 있었다. glucose 6 phosphatase - pDNA를 주입한 alloxan 당뇨쥐의 간에서 glucose 6 phophatase mRNA량을 RT-PCR과 realtime-PCR로 측정한 결과 유의한 감소가 관찰되었다.

결 결

결론론론:RNAi기술을 이용한 G6Pase유전자 발현억제는 alloxan 당뇨쥐에서 간의 포도 당신합성을 감소시켜 공복혈당 상승을 억제함이 관찰되었다.이는 향후 당뇨병 유전자 치료에서 G6Pase가 중요한 표지 유전자로 이용될 수 있는 가능성을 시사한다 하겠다.

(29)

T T

Taaabbbllleee111...TTThhheeennnuuucccllleeeoootttiiidddeeessseeeqqquuueeennnccceeesssooofffppprrriiimmmeeerrrfffooorrrRRRTTT---PPPCCCRRR P

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Prrriiimmmeeerrr SSSeeeqqquuueeennnccceee PPPrrroooddduuuccctttsssiiizzzeee G

G

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G666PPPaaassseee For tgttcacttgtgccctgact 310 Rev agcaatcagtgaggaatcag

GAPDH:Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,G6Pase:glucose 6 phosphatase,For:forward,Rev:reverse

(30)

T T

Taaabbbllleee222...TTThhheeennnuuucccllleeeoootttiiidddeeessseeeqqquuueeennnccceeesssooofffppprrriiimmmeeerrrfffooorrrrrreeeaaallltttiiimmmeeePPPCCCRRR

PPPrrriiimmmeeerrr SSSeeeqqquuueeennnccceee PPPrrroooddduuuccctttsssiiizzzeee G

G

GAAAPPPDDDHHH For caagagacgaggggacttcg 177 Rev tcctcgccttctaccagctc

G G

G666PPPaaassseee For cgctggagtcattacaggcgt 157 Rev caggtccacgcccagaactc

GAPDH: Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, G6Pase: glucose 6 phosphatase,For:forward,Rev:reverse

(31)

F F

Fiiiggg 111...BBBlllooooooddd gggllluuucccooossseeellleeevvveeelllooofffGGG666PPPaaassseee---pppDDDNNNAAA tttrrreeeaaattteeeddd aaalllllloooxxxaaannn---dddiiiaaabbbeeetttiiicccmmmiiiccceee(((nnnooo c

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caaalllooorrriii rrreeessstttrrriiiccctttiiiooonnn)))... Blood glucose levels were determined by glucometer.

G6Pase-pDNA:Glucose6phosphataseplasmidDNA

(32)

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hrrrsss 111000000%%% cccaaalllooorrriii rrreeessstttrrriiiccctttiiiooonnn)))...Blood glucose levels were determined by glucometer.G6Pase-pDNA:Glucose6phosphataseplasmidDNA

(33)

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1000000%%% cccaaalllooorrriiirrreeessstttrrriiiccctttiiiooonnn)))...Blood glucose levels were determine by glucometer.

pDNA:plasmidDNA

(34)

F F

Fiiiggg...444...GGGllluuucccooossseee 666 ppphhhooosssppphhhaaatttaaassseee (((GGG666PPPaaassseee)))aaaccctttiiivvviiitttiiieeesss iiinnn wwwhhhooollleee llliiivvveeerrrhhhooommmooogggeeennnaaattteeesss f

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frrrooommm GGG666PPPaaassseee---pppDDDNNNAAA tttrrreeeaaattteeeddd mmmiiiccceee...G6Paseactivitiesweredetermined at4weeks after G6Pase-pDNA treatment. Values are means ± SEM, = 5.**;P<0.01, G6Pase:glucose 6 phosphatase,pDNA:plasmid DNA,G6Pase-pDNA:Glucose 6 phosphataseplasmidDNA

**

(35)

F F

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G

G666PPPaaassseee---pppDDDNNNAAA tttrrreeeaaattteeeddd mmmiiiccceee...GK activities were determined at 4 weeks after G6Pase-pDNA treatment. Valuesaremeans± SEM, = 5.pDNA:plasmidDNA, G6Pase-pDNA:Glucose6phosphataseplasmidDNA,GK:glucokinase

(36)

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G

G666PPPaaassseee---pppDDDNNNAAA tttrrreeeaaattteeeddd mmmiiiccceee...PFK activities were determined at4 weeks after G6Pase-pDNA treatment. Valuesaremeans± SEM, = 5.pDNA:plasmidDNA, G6Pase-pDNA:Glucose6phosphataseplasmidDNA,PFK:phosphofructokinase

(37)

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h

hooommmooogggeeennnaaattteeesss fffrrrooommm GGG666PPPaaassseee---pppDDDNNNAAA tttrrreeeaaattteeeddd mmmiiiccceee... FBPase activities were determined at4weeksafterG6Pase-pDNA treatment. Valuesaremeans± SEM,

= 5.pDNA:plasmid DNA,G6Pase-pDNA:Glucose6phosphataseplasmid DNA, FBPase: fructose1.6-bisphosphatase

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M 111 222 333

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Fiiiggg...888...RRRTTT---PPPCCCRRR fffiiinnndddiiinnngggsssooofffGGG666PPPaaassseeemmmRRRNNNAAA iiinnnllliiivvveeerrrooofffGGG666PPPaaasssaaaeeesssiiiRRRNNNAAA pppDDDNNNAAA t

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determinedbyRT-PCR.**;P<0.01,GAPDH:Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,G6Pase:glucose6phosphatase,pDNA:plasmidDNA, G6Pase-pDNA:Glucose6phosphataseplasmidDNA

1.Control, 2.pDNA ,3.G6Pase-pDNA

GAPDH

G6Pase

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(39)

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Fiiiggg...999...RRReeeaaallltttiiimmmeee---PPPCCCRRRfffiiinnndddiiinnngggsssooofffGGG666PPPaaassseeemmmRRRNNNAAAiiinnnllliiivvveeerrrooofffGGG666PPPaaassseee---pppDDDNNNAAAtttrrreeeaaattteeeddd m

m

miiiccceee...The G6Pase-pDNA injected with tail vein of mice. 7 days after G6Pase-pDNA injection, the G6Pase mRNA levels in liver of mice were determined by realtime-PCR.**;P<0.01,pDNA:plasmid DNA,G6Pase-pDNA:

Glucose6phosphataseplasmidDNA

Name Condition Contenet ConcentrationF1 CT F1 G6Pase-C control sample 27537 27

pDNA pDNA sample 25842 26

G6Pase-pDNA G6Pase-pDNA sample 20972 21**

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저작물 저작물 저작물

저작물 이용 이용 이용 이용 허락서 허락서 허락서 허락서

학 과 의학과 학 번 20067353 과 정 박사

성 명 한글: 김 진 화 한문 : 金珍澕 영문 : Kim Jin Hwa

주 소 광주광역시 남구 봉선동 삼익2차 203동 802호

연락처 E-MAIL : 96194jin @ hanmail.net

논문제목

한글 : Alloxan 당뇨쥐에서 glucose 6 phosphatase siRNA 주입이 공복혈당 에 미치는 영향

영문 : Effect of Glucose 6 phosphatase siRNA Expression vector on the Fasting Blood Glucose Level in Alloxan-Diabetic Mice

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동의여부 동의여부 동의여부

동의여부 : : : : 동의동의동의( 동의( ( ( 0 0 0 ) 0 ) ) ) 반대반대반대( 반대( ( ( ) ) ) )

2008년 2월 일

저작자: 김 진 화 (서명 또는 인)

조선대학교 조선대학교 조선대학교

조선대학교 총장 총장 총장 총장 귀하 귀하 귀하 귀하

朝朝朝 鮮鮮鮮 大大大 學學學 校校校 大大大 學學學 院院院

20 0 00 0 08 8 8年 年 年 2 2 2月 月 月 博

醫 學 學 學 科 科 科

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目 次次次 圖

Ⅰ...서서서론론론

Ⅱ...방방방법법법

4...생생생쥐쥐쥐 간간간 RRRNNNAAA 추추추출출출

7...효효효소소소활활활성성성도도도측측측정정정

Ⅲ...결결결과과과 1

한 후후후 혈혈혈당당당변변변화화화

Ⅳ...고고고찰찰찰 및및및 결결결론론론

두 적용하기는 어려울 것으로 사료되며 4주라는 비교적 단기간의 연구여서 장기간의 효과에 대한 더 많은 연구가 필요하리라 생각된다.

GAPDH

참 참 참고고고문문문헌헌헌

저작물 저작물 저작물

학 과 의학과 학 번 20067353 과 정 박사

동의여부 동의여부 동의여부

조선대학교 조선대학교 조선대학교

朝朝朝鮮鮮鮮大大大學學學校校校大大大學學學院院院

20 0 00 0 08 8 8年年年 2 2 2月月月博

醫學學學科科科

醫學學學科科科

20 0 00 0 07 7 7年年年 1 1 10 0 0月月月

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