자발뇌내출혈(ICH) 후에 발생하는 출혈주위부종은 신경학적 악화의 주요 원인입니다. 출혈 초기에 발생하는 세포독성 부종의 원인으로는 트롬빈, 플라스미노겐, 페리틴, 철분, 혈액 내 활성산소 등이 있습니다. 감소하였고 혈관으로부터 성상세포 말단발의 분리가 심해졌다.
이는 출혈 주변의 부종 발생에서 아쿠아포린 4의 역할을 확인시켜 주었습니다.
서론
연구의 배경
- 뇌출혈 관련 부종의 일반적인 개념
- 뇌출혈 관련 부종의 임상적 중요성
뇌출혈 주변의 부종을 잘 조절하면 장기적인 임상경과가 좋다는 것은 이미 알려져 있다. ROS) 제거제 투여(올러유러핀, 셀레늄, 비타민 C, E, N-아세틸시스테인(NAC))[3-5], 면역 조절(스핑고신-1-포스페이트 수용체 1, S1PR1)[6], 출혈을 감소시키는 치료 관련 염증(NLRP3 inflammasome 억제제)[7]이 임상적으로 사용되었지만 그 메커니즘은 제한적으로 연구되었습니다.
최근 연구의 동향
연구의 목적
무결성을 유지하는 세포 상호 작용과 메커니즘을 연구하는 것이 필요합니다. 본 연구에서 우리는 출혈 주변의 부종 발생에 있어 성상교세포의 aquaporin4의 역할을 확인했습니다.
- 뇌출혈 마우스 모델 제작
- 뇌출혈 모델 자기공명영상 촬영 및 부종 영역 분석
- 면역형광염색
- 활성 산소종 (Reactive Oxygen Species, ROS) 분석
- 행동 실험 및 분석
뇌출혈이 발생한 뇌조직을 크라이오마이크로톰(cryomicrotome)을 이용하여 60μm 두께로 절단하였다. Diamidino-2-phenylindole dihydroclide) 1 ug/ml를 실온에서 5분간 배양한 후 Prolong antifade gold 용액(Thermo)을 통해 마운팅하였다. 구조를 보여주기 위해 Z-stack을 수행하여 결과와 ZEN 이미징 소프트웨어를 얻었습니다.
조직이 투명해진 후, 굴절률을 1.45로 조정한 마운팅 용액에 24시간 이상 담가서 가변 평면 레이저 형광현미경으로 영상화하기 위한 굴절률을 조정하였다. 이미지 획득 후 ZEN 소프트웨어(Zeizz)를 통해 분석하였다. 이후 DAPI를 이용하여 핵염색을 실시하였고, Prolong gold anti-fade 용액(Thermo)을 통해 장착한 후 공초점현미경을 통해 결과를 얻었다.
뇌출혈 모델을 제작한 후, 대조군과 실험군을 통해 행동실험을 진행하여 약물의 효과를 분석하였다. 모형 제작 후, 마우스를 아크릴판 사이에 30도 각도로 놓고 시간별로 5mm 간격으로 나눈 후, 아크릴판 사이에서 몸이 완전히 회전하는 방향을 측정하여 분석하였다. . 총 측정 횟수는 동물당 10회로 표준화하였고, 출혈 방향과 반대 방향으로 몸을 돌려 코너 탈출 횟수를 확인하였다.
연구결과
출혈 주변 부종의 발생 패턴과 세포학적 발생 기전
- 마우스 뇌출혈 모델에서의 혈종 주변 부종의 자연사
- 출혈 주변 부종 발생에 있어 ROS scavenger 효과
- 출혈 주변 부종에서의 동적 누수 (Dynamic leakage) 평가
- BBB 완결성 분석을 통한 세포학적 기전 확인
마우스 뇌출혈 모델(자기공명영상) ICH, 뇌내출혈에서 출혈을 둘러싼 부종의 변화. 출혈을 둘러싼 부종에 대한 ROS 제거제의 효과. 뇌출혈 마우스 모델 ROS 제거제(NAC, N-아세틸시스테인)는 생존율을 향상시키고(A) 출혈 주변의 부종을 감소시킵니다(자기공명영상)(B).
ROS 제거제(N-아세틸시스테인, NAC)에 의한 출혈 주변 부종 감소의 자기공명영상. 출혈 주변 부종 부위의 동적 흐름: 렉틴 흐름이 관찰됩니다. 출혈성 부종 부위 주변 BBB의 세포 구성 요소의 구조적 변화를 확인하기 위해 내피 세포 접착 접합부(VEcad), 밀착 접합부(claudin5), 혈관 주위 세포(NG2 프로테오글리칸, PDGFR-β, CD31), 기저막 및 성상교세포 피복 분석 했다
출혈 후 출혈 주변의 부종 부위의 혈관 주위 세포를 덮습니다. 출혈 후, 부종 부위의 성상교세포의 발현은 3일 후에 현저하게 증가하였다. 흥미롭게도 출혈 주변 부종 부위는 성상교세포 활성화 부위와 일치했다.
출혈 주변의 부종 부위에서는 성상교세포가 반응성 성상교세포로 전환되는 것이 확인되었으나 ROS에서는 확인되었다. 발현되는 아쿠아포린 4의 발현은 출혈 첫날부터 감소했으며, 7일 이후 점차 감소했다.
고찰
성상세포는 3일 후에 뇌출혈과 ROS 주변의 부종 부위에서 활성화되었습니다. 성상교세포 말단에서도 발현됩니다. 악화된다는 보고가 있으나 이는 초기 부종의 시작과 관련이 있는 것으로 보입니다.
흥미로운 점은 아쿠아포린4 억제제 투여군에서는 출혈 자체의 크기에는 변화가 없었으나, 대조군에 비해 출혈 주변 부종이 증가하고 신체능력 저하가 확인됐다. 이러한 변화를 통해 출혈 주변의 부종 형성에 있어 아쿠아포린 4의 중요성에 대한 결론을 내릴 수 있었습니다. Cheng-Di 등은 뇌출혈에서 아쿠아포린 4의 발현 감소로 인한 혈관신생 부종을 보고했습니다.
본 연구에서는 ROS에 의해 아쿠아포린 4의 발현이 감소되었으며, 출혈 주변의 부종 발생에 중요한 역할을 한다는 것을 확인하였다. 그리고 ROS 제거제를 투여받은 그룹에서는 출혈 주변의 부종이 감소하고 신체 능력이 향상되었습니다. 또한, endfeet에 성상교세포의 부착이 증가하여 BBB 무결성이 향상되는 것을 확인했습니다.
결론
Karuppagounder, S.S., et al., N-acetylcysteine targets 5 toxic lipoxygenase-derived lipids and can synergize with prostaglandin E2 to inhibit ferroptosis and improve outcomes after hemorrhagic stroke in mice. Shi, J., et al., Oleuropein protects blood-brain barrier disruption induced by intracerebral hemorrhage by attenuating oxidative stress. Kocaogullar, Y., et al., Preventive effects of intraperitoneal selenium on cerebral vasospasm in experimental subarachnoid hemorrhage.
Guo, T., et al., Neural injuries caused by hydrostatic pressure associated with mass effect after intracerebral hemorrhage. Ishii, T., et al., Endogenous reactive oxygen species induce astrocyte defects and neuronal dysfunctions in the hippocampus: a new model for aging brain. Bi, C., et al., The oxidative stress-induced increase in membrane expression of the water-permeable channel Aquaporin-4 in astrocytes is regulated by Caveolin-1 phosphorylation.
Pirici, I., et al., Inhibition of Aquaporin-4 improves ischemic stroke outcome and modulates brain paravascular drainage pathways. Chiu, C.D., et al., Hyperglycemia exacerbates intracerebral hemorrhage via downregulation of aquaporin-4: temporal assessment with magnetic resonance imaging. Louveau, A., et al., Understanding the functions and relationships of the glymphatic system and meningeal lymphatics.
