염생식물 Atriplex gmelinii의 생리 활성 성분을 검색합니다. 키워드: Atriplex gmelinii; 항산화 활성 항산화 활성;.
재료 및 방법
시료
시약 및 기기
- 추출, 분획 및 분리
- 활성 실험 시약
- 기기
- 세포배양
세포 배양에는 CO2 인큐베이터(Forma Scientific(일본))를 사용했습니다. 자유 라디칼로부터의 세포내 ROS 생산은 DCFH-DA 분석을 사용하여 측정되었습니다.
추출 및 분리
- 추출 및 분획
- 화합물의 분리
항산화 활성 실험
- DPPH radical 소거 활성
- Peroxynitrite 소거 활성
- 환원력(ferric reducing antioxidant power, FRAP) 측정
- 세포내 활성 산소종(Reactive Oxygen Species, ROS) 측정
- HT-1080 세포 생존율 측정
- 세포내 활성 산소종 (ROS) 측정
- Genomic DNA 추출 및 Genomic DNA의 산화 생성물 측정
Peroxynitrite(ONOO-) 소거 활성은 dihydrorhodamine 123(DHR 123)의 산화 정도를 측정하여 표현되었습니다(그림 2). 세포가 많을수록 MTT 포르마잔이 더 많이 생성되며 이를 세포 생존율을 측정하는 데 사용했습니다.
항염증 활성 실험
- RAW 264.7 세포 생존율 측정
- Nitric oxide (NO) 억제 활성 측정
- 염증 발현 인자 억제 활성 측정
HT-1080 세포에서 배지를 제거하고 PBS 완충액으로 세척한 후 Trizol 시약(Ambion, USA)을 사용하여 RNA를 추출하고 클로로포름을 첨가하여 페놀성 성분을 제거하였다. 상등액과 동량의 이소프로판올을 첨가하여 RNA를 침전시킨 후, 알코올로 세척하고 건조시켰다. 건조된 RNA에 DEPC water 30 μL를 첨가한 후 분광광도계를 이용하여 260 nm/280 nm에서 흡광도를 측정하여 RNA 농도를 정량하였다.
cDNA는 성분 혼합물(Invitrogen, USA)을 첨가하여 동량의 분리된 RNA(2 μg)로부터 합성되었습니다. PCR 산물을 이용한 전기영동 밴드의 세기도 Quantity One 프로그램(Bioneer, Korea)으로 측정하여 그래프로 나타내었다.
항암 활성 실험
- 인체 유래 암세포에 대한 세포 증식 억제활성측정
- 기질 금속단백질분해효소(Matrix metalloproteinase) 저해 활성 실험 - 26
- mRNA 추출과 RT-PCR (reverse transcription-polymerase chain
- Western blot을 통한 MMP 발현 측정
이 상청액의 단백질 함량은 Bradford 단백질 정량 방법을 사용하여 결정되어 동일한 양의 단백질을 함유하는 조건화된 배지를 얻었고 1.5 mg/ml 젤라틴을 함유하는 10% 나트륨 도데실 설페이트-폴리아크릴아미드 겔(비환원 겔)을 사용하여 분석했습니다( Sigma Aldrich, USA.) 다음 조건에서 전기영동을 수행하였다: Duksan Korea). 상등액과 동량의 이소프로판올을 첨가하여 RNA를 침전시킨 후, 알코올로 세척하고 건조시켰다. 단백질 수준에서 MMP-2/MMP-9 발현을 측정하기 위해 웨스턴 블롯 실험을 수행하였다.
전기영동 후 겔을 니트로셀룰로오스 전사막(Whatman®, UK)으로 옮기고 5% 탈지유로 1분간 블로킹한 후 24시간 세척 후 상온에서 1시간 동안 2차 항체 반응으로 검출하여 막 위에 올려놓았다. 및 UV(Davinch-Chemi imagerTM, CAS-400SM, Davinch-K) 적용 Western Blotting 검출 시약 키트(GE Healthcare, UK). , Korea)에서 단백질 발현 정도를 관찰하였다.
통계처리
결과 및 고찰
염생식물 Atriplex gmelinii에서 분리된 물질의 구조결정
In vitro 항산화 활성
- DPPH radical 소거 활성
- Peroxynitrite 소거 활성
- 환원력(ferric reducing antioxidant power, FRAP) 측정
인간 기원의 암세포에 대한 세포 증식 억제 효과. 추출물과 4층의 용매 분획물은 세포 증식을 억제하는 효과를 나타냈다. 인간 대장암 세포인 HT-29 세포에 대한 추출물 및 4층 용매 분획물의 세포 증식 억제 정도를 MTT 분석법으로 측정하였다.
추출물과 4가지 용매 분획물 모두 유의한 세포 증식 억제 활성을 나타냈습니다. 인간 위암 세포에 대한 세포 증식에 대한 추출물 및 4개 분획 용매층의 억제 효과를 MTT 분석법으로 측정하였다. 추출물과 4층의 용매분획물은 비교적 우수한 세포증식 억제활성을 나타냈다.
세포 증식 인간 유래 암세포에 대한 화합물의 억제 효과.
분획층의 세포 수준에서의 항산화 활성
- HT-1080 세포에 대한 독성
- 세포내 활성 산소종(ROS) 소거 활성
- Genomic DNA 산화억제능 측정
- RAW264.7 세포생존율 측정
- NO생성 억제효과
분획층의 세포수준에서의 항암 활성
- 분획층의 인체 유래 암세포에 대한 세포 증식 억제 효과
- HT-1080 세포 증식 억제 효과
- HT-29 세포 증식 억제 효과
- AGS 세포 증식 억제 효과
- 기질 금속단백질분해효소(Matrix metalloproteinase) 저해활성 효과
- Gelatin zymography를 통한 MMP-9과 MMP-2의 발현
- RT-PCR과 Western Blot을 통한 MMP-9과 MMP-2의 mRNA와
화합물의 항산화 활성
- DPPH radical 소거 활성
85% 수성 MeOH 분획층과 염생식물 Atriplex gmelinii의 n-BuOH 분획층에서 분리된 화합물 1과 2를 50, 10 및 5μg/mL의 농도로 희석하고 대조군으로 BHA(부틸화 하이드록시아니솔) 및 BHT( 부틸화하이드록시톨루엔)과 비타민C(L-아스코르브산)를 같은 농도로 희석하여 실험에 사용하였다.
화합물의 항염증 활성
- RAW264.7 세포에 대한 독성
- 화합물의 NO생성 억제 효과
- 화합물의 염증 유발 인자 억제 효과
도미에서 화합물 1과 2의 항염증 활성을 조사하기 위해, 세포 내 독성을 유발하지 않는 농도에서 LPS 자극에 의해 활성화된 RAW264.7 세포를 사용하여 이들 분획물이 NO 생성에 미치는 영향을 측정했습니다. 시베리아 달팽이에서 분리한 화합물 1의 추가적인 항염증 활성을 조사하기 위해 항염증 인자에 대한 RT-PCR을 수행했습니다.
화합물의 항암 활성
- 화합물의 인체 유래 암세포에 대한 세포 증식 억제 효과
- HT-1080 세포 증식 억제 효과
- HT-29 세포 증식 억제 효과
- AGS 세포 증식 억제 효과
- 화합물의 기질 금속단백질분해효소(Matrix metalloproteinase) 저해
화합물의 매트릭스 메탈로프로테이나제 억제 활성. 젤라틴 자이모그래피에 의한 MMP-9 및 MMP-2 발현에 대한 화합물의 효과. 그 결과, PMA를 단독으로 처리한 양성대조군에 비해 화합물 1을 처리한 경우 MMP-9의 발현이 농도 의존적으로 감소하는 것을 확인하였다.
Effects of compounds 1 and 2 of the halophyte Atriplex gmelinii on the enzymatic activity of MMP-9 and MMP-2 determined by gelatin zymography in HT-1080 cells.
결론 및 고찰
추출물 및 용매분획물에 대한 생물학적 활성 검색 결과 분석, 85%. 분리된 두 화합물의 DPPH 라디칼 소거 활성을 측정한 결과, 화합물 1과 2 모두 우수한 라디칼 소거 활성을 나타냈으며, 1의 경우 합성 항산화제로 널리 사용되는 BHA보다 우수한 활성을 나타냈으며, 2 의 경우 BHA와 유사한 소거효과를 나타냈다. 중국 달팽이의 주요 대사산물인 화합물 1의 추가적인 항염증 활성을 알아보기 위해 수행한 항염증 인자에 대한 RT-PCR 발현 실험에서, 화합물 1과 2는 IL을 제외한 4가지 염증 유발 인자의 mRNA 발현을 보여주었다. -1β는 농도 의존적으로 억제되었으며, 가장 유의한 억제 활성을 보인 COX-2의 경우 100 μg/M 시료를 처리한 결과 대조군에 비해 mRNA 발현이 50% 억제되었다.
달팽이 추출물, 수용성 분획물 및 분리 화합물은 항산화, 항염증, 항암 효과를 확인하는 다양한 실험에서 우수한 활성을 보여 S. Snail이 기능성 물질 개발의 잠재적 소재가 될 수 있음을 나타냅니다. 따라서 본 연구 결과는 우리나라 근해에 서식하는 염생식물 자원을 활용한 새로운 기능성 생리활성물질 개발의 지표가 될 것으로 기대된다.
참고문헌
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부록
