단쇄 지방산 처리에 의한 폐 섬유아세포 활성 억제. 섬유화는 상피세포가 지속적인 손상으로 재생에 실패하고 콜라겐과 같은 물질이 축적될 때 발생한다.
서론
TGF-b1은 폐섬유증을 유발하는 대표적인 물질로 TGF-b1(Transforming Growth Factor-b1)이 활성화되면 섬유아세포를 모아 증식시킨다. 이러한 여러 연구 사례를 통해 폐섬유증에서 미토콘드리아 기능 장애와 세균의 특이적 분포로 인해 에너지와 지질 대사의 변화가 일어난다는 것을 알 수 있다.
실험재료 및 방법
시약
다음으로 세포 배지를 Mitotracker red(25 nM)와 Hoechst(5 mg/ml)로 20분간 염색한 후 배지를 phenol red(-) MEM(gibco)으로 교체하고 공초점 레이저를 이용하여 미토콘드리아를 관찰하였다. .현미경. 막 전위에 따라 미토콘드리아를 염색하는 Mitotracker를 사용하여 MRC5 세포의 미토콘드리아 역학을 확인했습니다. 또한 C4를 처리한 군에서는 미토콘드리아 역학이 원래대로 회복됨을 확인하였다.
TGF-b1과 C4를 함께 처리하면 미토콘드리아 역학 회복을 통해 미토콘드리아 기능에 변화가 있을 것으로 예상했다. 먼저, MRC5 세포에서 섬유아세포가 TGF-b1에 의해 활성화되는지 확인하였다. 또한, C4를 병용시 근섬유아세포의 분화를 방지하여 미토콘드리아 역학이 원래대로 회복되었음을 알 수 있다.
그림을 통해 도 4 및 도 5에서 TGF-b1 및 C4를 처리하였을 때 미토콘드리아의 변화를 확인하였으며, 핵심 미토콘드리아 조절인자로 알려진 PGC1a의 발현량을 확인하였다.
세포 배양
이후 세포 배지를 MitoSOX-red(5uM)와 Hoechst(5ug/ml)로 10분간 염색한 후 배지를 phenol red(-) MEM(gibco)으로 교체하고 공초점 레이저 현미경을 이용하여 미토콘드리아 ROS를 관찰하였다. . . TGF-b1 매개 미토콘드리아 신장은 C4 처리에 의해 억제되었다. , 이 현상이 미토콘드리아와 어떤 관련이 있는지, 우리는 미토콘드리아 역학을 확인했습니다. 이것은 TGF-b1을 처리했을 때 미토콘드리아 형태가 길어지고 역학이 붕괴되었지만 TGF-b1과 C4를 처리했을 때 미토콘드리아 역학이 회복되었음을 보여줍니다.
미토콘드리아 ROS와 미토콘드리아 막 전위는 MitoSOX와 JC-1로 측정하였고, 핵은 Hoechst 33258로 염색하였다. 이전 이미지에서 MRC5 세포에서 TGF-b1에 의해 활성화된 섬유아세포의 활성이 C4에 의해 감소됨을 확인하였고, 미토콘드리아 형태는 확장 및 복원되었으며 미토콘드리아 막 전위(ROS)가 증가함에 따라 활동이 증가했습니다. . 이러한 섬유아세포 활성화 및 복구 단계 동안 미토콘드리아 변화를 일으키는 요인을 확인하기 위해 마스터 미토콘드리아 조절기로 알려진 PGC1a의 RNA 및 단백질 수준을 모니터링했습니다.
이전의 결과를 통해 TGF-b1에 의해 활성화된 MRC5 세포에 C4를 처리하였을 때 세포 활성화가 억제됨을 확인하였다.
세포에서 RNA 추출 및 qRT-PCR(quantitative real-time PCR)
세포에서 단백질 정량 및 Western blot
TBS-T에 5% 탈지유를 첨가하여 항체와 단백질의 비특이적 결합을 방지하기 위한 블로킹을 하였고 상온에서 1시간 동안 교반하였다. West Pico Chemiluminescent Substrate(Thermo)를 사용하여 Chemidoc을 사용하여 특정 단백질을 확인했습니다.
미토콘드리아 Dynamics 측정
BCA protein assay 시약(Thermo)을 이용하여 정량한 후 동량의 단백질(20 mg)을 SDS-PAGE로 크기별로 분리하여 nitrocellulose membrane과 PVDF membrane으로 옮겼다.
미토콘드리아 ROS 측정
미토콘드리아 막 전위 측정
Fluorescence microscope analysis
통계처리
결과
TGF-β1 induced myofibroblast differentiation of MRC-5 lung fibroblasts
Short Chain Fatty Acid (SCFA) repressed myofibroblastic transformation under
C4 처리는 TGF-b1에 의해 유도된 섬유아세포 활성화를 억제함 C4 처리가 처리됨에 따라 TGF-b1에 의해 발현되는 섬유증 지수가 감소됨을 확인하였다.
C4 treatment inhibited fibroblast activation induced by TGF-b1 treatment
TGF-b1 매개 미토콘드리아 신장은 MRC5 세포에서 C4 처리에 의해 억제되었고, TGF-b1 유도 섬유아세포 활성화는 C4에 의해 감소되었다.
TGF-b1-mediated mitochondrial elongation was inhibited by C4 treatment
C4 treatment increased mitochondrial membrane potentials and ROS
For 24 and 48 hours, MRC5 cells treated with TGF-b1 and C4 were stained (a) Heochest 333258 and MitoSOX (red), (b) Heochest33258 and JC-1 (red and green) And the stained cells were analyzed then with confocal fluorescence microscope.
TGF-b1 and C4 co-treatment increased PGC1a mRNA level
고찰
먼저, Mitotracker 염색을 통해 미토콘드리아 역학을 살펴보면, TGF-b1 단독 처리 시 미토콘드리아의 길이가 길어지는 렝스닝(lengthening) 현상이 발견되었으며, C4를 함께 처리 시 신장된 미토콘드리아가 원래 상태로 회복되는 것을 확인하였다. PGC1a는 상향 조절되는데, 주로 미토콘드리아 생합성 기능이 증가하거나 지방산 산화가 증가할 때 일어난다. 기능이 이 C4를 함께 치료하면 다시 회복되는 것으로 볼 수 있다. 또한 어떤 물질이 PGC1a와 상호 작용하여 미토콘드리아 생물 발생 또는 지방산 분화에 영향을 미치는지 결정하기 위한 추가 연구가 필요합니다.
참고문헌
Hamanaka, TGF-β promotes metabolic reprogramming in lung fibroblasts via mTORC1-dependent ATF4 activation, AJRCMB Press articles. Oliver, Short-chain fatty acids increase TNF-α-induced inflammation in human lung primary mesenchymal cells through the activation of p38 MAPK, Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol 316: L157-L174, 2019. Wendy Glenisson, Vincent Castronovo, David Waltregny, Histone deacetylase 4 is required for TGFbeta1-induced myofibroblastic differentiation, Biochim Biophys Acta.
