BRCA1, BRCA2 유전자는 종양억제유전자에 해당하며 종양유전자와 달리 '핫스팟'이 없어 개별 부위보다는 유전자 전체를 확인해야 한다. Sanger 시퀀싱은 일반적으로 BRCA1과 BRCA2의 유전자 검사에 사용되어 왔지만 이는 시간, 노동력, 비용 집약적이라는 단점이 있습니다. 본 연구에서는 Next Generation Sequencing을 이용하여 표적포획법인 'DxSeq BRCA 1/2' 암진단키트를 이용하여 전장 BRCA1, BRCA2를 스크리닝하고 표준검사법인 Sanger sequencing 결과를 분석하였다. , 그리고 국내 시장에 승인된 다른 회사의 앰플리콘. 본 연구의 목적은 BRCA 1/2 유전자 검사 키트를 BRCAaccuTest 방법과 비교하여 성능을 검증하는 것입니다.
종양유전자는 유전적 돌연변이로 인해 암세포의 성장을 직접적으로 촉진하는 유전자이다. 종양 유전자와 달리 대부분의 종양 억제 유전자에는 '핫스팟'이 없습니다. BRCA1, BRCA2는 종양 억제 유전자에 해당하므로 유전적 이상 여부는 특정 부위가 아닌 유전자의 전체 길이를 확인해야만 확인할 수 있다.
일반적으로 Sanger 시퀀싱은 주로 BRCA1 및 BRCA2 유전자를 분석하는 데 사용되었습니다. 최근에는 BRCA1 및 BRCA2 유전자 검사가 차세대 염기서열분석(NGS)을 사용하여 수행되는 경우가 많습니다.
Sample selection
실험
TapeStation(Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA)을 사용하여 50-700bp 섹션의 평균 DNA 크기를 결정했습니다. 상온에서 1분간 incubation한 후 상등액을 제거하는 과정을 2회 반복하였다. 에탄올 잔여물을 제거한 후, 비드를 건조시키고, 뉴클레아제가 없는 물 22 μL와 혼합하고, 실온에서 3분간 배양한 후, 자석 스탠드 위에 3분간 방치한 후 상층액 20 μL를 취하였다.
50μl의 세척 비드를 50μl의 증폭된 라이브러리와 혼합하여 정제를 반복했습니다. 진공농축기를 이용하여 건조하여 혼합물을 제조하였다. 혼성화를 위해 혼성화 혼합물을 65℃에서 10분간 배양하고 실온에서 5분간 배양한 후 혼성화 혼합물 20 μl, 프로브 믹스 4 μl 및 뉴클레아제가 없는 물 3 μl를 혼합하고 95도의 열 순환기에서 배양합니다. ℃에서 2분 동안 가열한 후 얼음 위에 올려 놓습니다. 5분 동안 인큐베이션하여 제조하였다.
혼합 후 30 μL의 혼성화 강화제를 첨가하고 열 순환기를 사용하여 70 °C에서 16시간 동안 배양했습니다. 이를 2회 더 반복하였고, 최종 세척 후 결합 완충액 200 μL를 첨가하고 혼합하여 제조를 완료하였다. 16시간 혼성화 단계가 완료된 직후, 스트랩타비딘 비드가 들어 있는 튜브에 넣고 혼합한 후 실온에서 30분간 배양하였다.
남은 세척 완충액 2를 제거한 후 뉴클레아제가 없는 물 45 μL를 첨가하고 혼합하여 포획된 DNA를 얻었다. 이 FASTQ 파일은 DxSeq NGS 유전자 분석 시스템(Dxome, 대한민국 성남)을 사용하여 데이터 분석을 거쳤습니다. BWA 및 Samtools를 사용하여 참조 시퀀스(GRCh37 어셈블리)에 대해 정렬을 수행했습니다.
정렬이 수행된 후 GATK MarkDuplicate를 사용하여 중복 읽기가 제거되었습니다.
Statistical analysis
DxSeq BRCA1/2 테스트는 Sanger가 이전에 시퀀싱한 총 144개 샘플에 대해 수행되었습니다. Sanger sequencing으로는 확인할 수 없었던 copy number 변이 돌연변이가 1개 추가로 발견되었습니다.
2) 1예는 CNV였으며, amplicon법의 차세대 염기서열분석법으로는 검출이 불가능하였다. 본 연구에서는 표적포획법인 암진단키트 'DxSeq BRCA 1/2'를 이용하여 BRCA1/2의 검사결과를 Sanger sequencing 결과와 비교하였고, 임상적 성능은 타사의 암진단 NGS 키트와 비교하였다. 앰플리콘-방법. 확인되었습니다. 이를 검증하기 위해 본 연구에서는 검증에 사용할 검체를 선정할 때 각 돌연변이의 위치를 고려하여 검체 분포가 BRCA1, BRCA2 유전자의 전체 길이에 걸쳐 분포될 수 있도록 환자의 검체를 선정하였다. (그림 3) .
DxSeq BRCA 1/2'를 사용한 차세대 염기서열분석 결과를 Sanger 염기서열분석과 비교하여 1차 임상 유효성을 평가했습니다. 'DxSeq BRCA 1/2'를 이용하면 기존에 사용했던 Sanger 시퀀싱 결과와 동일한 결과를 보여준다고 할 수 있다. 다른 연구에서는 Sanger 시퀀싱에 대한 차세대 시퀀싱 분석 결과가 나왔습니다.
4가지 다른 사례는 앰플리콘 방법이 관련 변종을 검출하지 못하기 때문에 위음성 결과였습니다. 검출할 수 없는 4개의 돌연변이는 모두 Indel 변이체였으며, 앰플리콘 방법 세트에서는 검출할 수 없었습니다. 다른 연구에 따르면 앰플리콘 방식의 차세대 시퀀싱 방식은 Indel과 SNV에 취약한 것으로 나타났다.
반면, 차세대 시퀀싱 방법은 비교적 정확한 SNV 및 삽입/삭제 감지를 포착할 수 있습니다. Sanger 시퀀싱 테스트는 시퀀싱의 최적 표준으로 간주되지만 테스트 방법의 한계로 인해 복제 수 변화를 감지할 수 없습니다. 한편, NGS를 통해 CNV를 검출하는 방법도 개발되었는데, 이는 크게 paired-end mapping, read-through, read Depth, de novo 게놈 어셈블리 및 결합 방법의 5가지 전략으로 구현됩니다.17,18 그 중, 'DxSeq BRCA1/2'는 읽기 깊이 기반 접근 방식을 사용하여 NGS 시퀀싱 데이터의 적용 범위를 달성합니다.
다른 차세대 시퀀싱 방법에 대한 비교 연구에 따르면, 캡쳐 기반 방법이 앰플리콘 기반 방법보다 더 나은 커버리지를 갖는 것으로 보고되었습니다. 차세대 염기서열분석(NGS) 기술의 최근 발전과 향후 연구 방향.
