4장. 발효공정과 장치

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2021-10-12 KNU Microbial Biotechnology Laboratory 1

4장. 발효공정과 장치

경북대학교 미생물공학연구실

KNUmbl

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발효공학 4장 : 발효공정과 장치

4-1. 미생물의 배양형식

1. 배양 형식

가. 배지의 특성에 따라

1) 액체배양 : 표면배양(surface culture), 심부배양(submerged culture) 2) 고체배양 : 밀기울 등의 고체 배지 사용

가) 정치배양 : 공기의 자연환기 또는 표면에 강제통풍

나) 내부 통기배양(강제통풍배양, 퇴적배양) : 금속 망 또는 다공판을 통해 통풍 나. 기질의 공급 방법에 따라

1) 회분배양 (batch culture) : 제한된 기질로 1회 배양

2) 유가배양 (fed-batch culture) : 기질을 수시로 공급하면서 배양

3) 연속배양 (continuous culture : 기질의 공급 및 배양액 회수가 연속적 진행 –steady state(정상상태): 기질 및 산물 농도, 균체량, 균체 증식 단계 등 동일

기질 배양액 기질 배양액

배양 산물생산 단단형(single stage) 다단형(multistage) 회분배양

적응과정

정상과정 균체 기질 배양시간

연속배양

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2. 연속배양 kinetics

1) t시간 배양 후의 전체 세포량

세포의 증식 속도 (세포량의 증가속도) : 초기 세포의 양에 비례 dx / dt = µx

(dx / dt : 세포량의 증가속도, µ : 비증식속도, x : 세포량---g/l or 개/l) dx / x = µdt t에 대하여 적분 t : 0---t, x_t : x₀---x_t

(x₀: 초기 cell mass, x_t : t 시간 후의 cell mass)

2) mass doubling time(td)= generation time(h)

ln x_t / x₀ = µt 에서 x_t가 x₀의 2배가 될 때 소요된 시간 td = ln 2x₀ / x₀ = ln2 /µ = 0.693 /µ

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3) 비증식속도 µ (specific growth rate) ln x_t / x₀ = µt

x_t, x₀ : 실험적으로 구하여 t에 대한 ln x_t / x₀ 를 semilog graph에 plot

4) D: 희석율 (dilution rate, h^-) D = F/V = 1/RT

F: flow rate (l/h), V: reactor volume (l), RT: retention time (h) = V/F

5) 희석율과 µ와의 관계

배양조 내의 세포 증가속도 = 0

배양조 내 dx / dt = growth - output = 0 µx - Dx = 0

µ = D 비증식속도는 D에 의해 조절

t ln x

t

/ x

0

slope = μ

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4-2. 발효공정

1. 발효공정 개요 -94페이지, 그림4-5

장치 살균 --- 종모 배양 --- 발효 --- 생산물 회수, 제품화 (원료주입-살균-접종-증식) (원료주입-살균-접종-증식 및 발효)

* 종모 (starter) : 발효를 위한 미생물 균주를 배양한 것

-술의 경우 주모(밑술, 술밑), 식초 경우 종초, 발효유제품 경우 유산균 균체

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2. 발효경과의 유형 : primary, secondary metabolites와 약간 관련 Type I : 증식관련형 --에너지대사 기질의 1차대사경로--분해경로

A --- B --- C ---- --- P

-trophophase(영양증식기)와 idiophase(특이생산기) 구별 무 (균의 1차대사와 관련)

-균체생산, 에탄올 발효, gluconic acid 발효 등

Type II : 중간형 –에너지대사-기질로부터 1차대사와는 다른 경로로 생성 A --- B --- C --- --- 1차대사

│

X --- Y --- --- P(산물) : 2차대사산물--합성경로 -영양증식기와 특이생산기 약하게 구별

-증식관련형 대사물질 중 대사조절 -유기산, 아미노산, 핵산관련물질 Type III : 증식비관련형 --균의 증식이 끝난 후 산물의 생성

-균의 1차대사와 산물의 생성이 완전히 따로 진행 -주로 합성경로의 중간산물로부터 생산

-항생물질, 비타민, glucoamylase 등

* 불명확 : 젖산 - I와 II의 중간

어떤 항생물질 - II와 III의 중간

균체 산물

t 양

균체

산물 t 양

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4-3. 발효조 (배양조, fermentor, bioreactor )

* 발효조 기본형식

-대부분이 호기성 배양 -공기공급, 배양액 순환 및 동력절감 문제 착안

-공기분산방법 - 교반, 펌프, 고압공기, 기상 이용(미생물 피막 위에 공기 순환) 비교) 혐기성 배양 경우 밀폐(산소차단), 공기제거(편성 혐기성)

1. 표준형 발효조 : 통기교반형 발효조(STF, stirred tank fermentor 1) 충돌판(baffle): 용액의 회전 방지-용액 혼합 유도

2) 교반기(agitator=impeller): 혼합, 공기세분, 분산-paddle, propeller, turbine형 3) 공기취입장치(sparger): 공기 액내 분산 주입 - 교반기 바로 밑에 부착

4) 기타: 미생물 접종구, 온도조절, pH 전극, 산과 알칼리 첨가구, 시료채취구

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2. Waldhof형: 통기회전원판을 통해 공기 주입 -액의 순환 및 거품의 파괴 유도 -기포의 기계적 처리로 동력비 절감, 산소의 이용 효율 증가

3. Acetator와 cavitator: 독일의 Frings가 고안 – 공기의 자연적 흡입 유도 1) Acetator 형 : 통기교반조의 변형

- aerator 회전으로 액과 공기 흡입 및 혼합 방출

: 축으로부터 공기 흡입 + 터빈으로부터 액 흡입 –혼합 방출

2) Cavitator 형: Waldhof의 변형 - 소형날개 고속회전으로 cavitation 유도 Cavitator 형

Waldhof 형

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4. 기포탑형 (air lift fermentor): 공기의 공급으로 기포와 배양액이 위로 상승 -공기 및 배양액의 순환 용이 -SCP생산에 유리

5. 탑발효조(단탑형, tower fermentor): 배지 및 공기가 상승하며 발효 계속 -기질 소비율 향상 - 산물생성기와 증식기가 다른 경우 유리

기포탑형

탑발효조

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4-4. 산소공급

대부분 발효 과정 : 호기적 즉 미생물 증식 및 발효에 산소 요구 영양분 + 산소 --- 균체 + 산물

6.67CH₂O + 2.1O₂ --- C_3.92H_6.5O_1.94 + 2.75CO₂ + 3.42H₂O 7.14CH₂ + 6.135O₂ --- C_3.92H_6.5O_1.94 + 3.22CO₂ + 3.89H₂O

(미생물균체)

1. 미생물의 호흡속도 : Q_O2 = 호흡에 의한 산소의 소비속도

O₂의 낮은 용해도 (10 ppm), 배양액과 접촉면에서만 공기 용해 - 산소가 증식 제한인자로 작용

- 호기적 배양 경우 미생물 호흡속도 = 미생물 증식속도

- 세균, 효모: 점성 무, 방선균, 곰팡이: 점성(발효조건 따라 변화)

* Q_O2 : 용존산소(DO) DO 증가에 따라 증가, 일정 범위 이상의 DO에서는 일정 - 그 DO 농도를 임계산소 분압 (critical DO)

QO2

DO

DO＞임계산소분압 - 동력비↑

DO＜임계산소분압 - 증식속도↓

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* 용존 산소와 미생물의 호흡속도 관계식 : Q_O2 = Q_m· C_L / (K_o + C_L)

Monod 식 : 제한 기질과 미생물 증식속도 관계 식 - 산소가 제한 기질로 작용 μ = μ_m·S / (K_s + S)에서 (효소의 경우 v = V_max·S / [K_m + S])

u - Q_O2 비호흡속도 (specific O₂ uptake rate)로 하면 u_m - Q_m (최대 Q_O2)

S - C_L (액체의 DO 농도)

K_s - K_o (O₂에 대한 Michaelis-Menten 상수)- 최대 호흡량 1/2 호흡 시 액체 DO 농도 2. 산소 이동 : 산소 물에 용해 – 용액 중 확산 (교반) - 세포 흡착 (액상-세포)

step1 step2 step3

○│---│◎

air bubble O₂ DO O₂ in cell

기상-기상은 무시, 기상 - 액상이 가장 결정적 (산소의 용해)

* 산소의 용해속도 : 기포 표면적에 비례, 용액의 DO와 포화 DO차에 비례 dC_L/dt ∝ a(C_S - C_L) (C_L: DO 농도, C_S: 포화 DO 농도, a : 기포 표면적) dC_L/dt = K_L·a(C_S - C_L) = OTR(oxygen transfer rate, mM O₂/l.hr)

K_L : 액경막의 산소이동계수 - 기경막의 산소 이동계수(K_g) 무시

* K_L·a : 산소이동 용량계수 (Volumetric oxygen transfer coefficient)

- 기포에서 용액으로 산소가 용해될 때 두 변수 K_L 과 a를 합쳐서 고려한 것

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4-5. 무균기술

1. 살균

가. 배지 : 증기살균 (배지 성분 변화 위험) – 보통 120℃, 15~20분이 적합 1) 비연속 살균 : 소형 발효조 내에서 살균

– 승온과 냉각에 긴 시간 소요 – 배지 성분 파괴 위험 – 살균조건 매우 중요 2) 연속살균 : 연속살균 장치 (continuous sterilizer)

– 배지를 연속적으로 공급하면서 살균 - 열교환형, 증기취입형 연속살균기 나. 장치 : 증기살균, 가스살균 (ethylene oxide : -10.7℃에서 비등)

연속살균장치

Plate exchanger type Steam injector-flash cooler type 예열 및 예냉

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[살균이론]

살균속도 -dN/dt = kN

[k : 비사멸상수(specific death rate), N : 생세포 수 또는 양]

1/N · dN = -k ·dt t : 0---t, N : N_o---N_t

∫ 1 / N·dN = -∫ k·dt [ln N] = -[kt]

ln N_t - lnN₀ = -kt -kt = ln N_t/N_o

* Determination of k

ln N_t / N_o = -kt (일정 살균과정 중 시간에 대한 N 수 실험적 측정) Nt

N0

Nt

N0

t 0 t

0

slope = -K

t Ln Nt/N0

고온: K 증가 t

N

온도증가

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2. 여과: 공기

가. Depth filter : 주로 공기 처리 -99.99% 제균

충진층: 섬유상 매트릭스(유리섬유, 합성수지) - φ수십μ 이하 1ｍ 이상 설치)

살균효과: 관성 충돌, 접촉(섬유간격), 확산(브라운 운동)

나. MF(microfiltration) : pore : φ0.22, 0.45 μ – 완전 제균 가능 -주로 membrane filter 사용 : cellulose acetate, cellulose nitrate, -압력손실 증가 -먼저 일반적 여과 후 사용(depth filter)

4-6. 무균조작 : 주입기 (밀폐, 무균), 세병기 (NaOH 및 열수), 병 (고온상태 병입) 4-7. 발효공정의 계측

온도 : 온도계

pH : 복합유리전극 – 은, 염화은 전극에 염화칼륨을 전해액으로 사용 DO : DO meter – 용존 산소 전극 사용

공기유량 : flowmeter (유량을 전기적신호로 변환)

유리섬유 압축공기

여과공기

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4-8. 발효공정 제어

* 발효공정제어 : 자동화 - 각 탱크가 computer와 연결 - 원료 공급, 살균, 접종, 발효, 통기 등 자동 조절

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* Rapid sampling system

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* Metabolic flux analysis

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* Omics

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Metabolomics

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1. 국개법 (누룩상자, 국상자) : 발효접시에 수동식 배양 – 표면의 자연 공기 이용 2. 다단표면 통풍식 : 국개법을 개량한 정치배양

- 다단의 국개 표면에 온도와 습도 조절된 공기 공급하면서 배양

3. 회전드럼식 : 배양상자를 회전원통 안에 장치 – 원통의 회전에 의한 혼합 효과 - 내부로 온도 습도 조절된 공기를 공급하면서 배양

국개

4-9. 고체배양 장치

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4. 고체내부 통풍식 : 고체 통기배양 장치

- 다공판 배양조 아래로 온도, 습도 조절된 공기가 공급되어 위로 배지 층 통과

5. 밀폐식 배양장치 : 원료 증자와 미생물 배양을 하나의 장치 안에서 수행 - 선반식, 통기식, 회전드럼식 등