갈색지방 특유의 CRTC3 발현 조절을 통한 비만억제 효과에 관한 연구. UCP1에 의한 에너지 생산은 갈색 지방의 에너지 소비의 대부분을 담당합니다.
실험동물
메타볼릭 케이지
추위 저항성 시험
여러 마리의 쥐를 하나의 케이지에 가두는 경우, 쥐 간의 긴밀한 접촉으로 인해 서로의 체온으로 인해 체온이 상승할 수 있습니다. 체온 저하로 인한 직접적인 체온 저하나 몸에 물을 마시는 것을 방지하기 위해 물을 제공하지 않았으며, 땀을 흘리는 대신 소변으로 인한 체온 저하로 인한 체온 저하를 방지하기 위해 깔짚을 최소한으로 배치했습니다. 추운 환경. 또한 찬바람이 직접적으로 노출될 경우 냉장고 안의 온도보다 마우스의 온도가 바람의 영향을 더 많이 받을 수 있으므로 모든 면이 밀봉된 케이지를 사용하였다.
조직 표본 제작
그런 다음 조직 크기에 적합한 금형을 사용하여 파라핀 블록을 준비합니다.
조직 H&E염색
웨스턴 블롯
일정량의 Na-피로포스페이트, 20 mM β-글리세로포스페이트 및 50 mM NaF)를 첨가한 후 균질화기를 사용하여 균질화하였다. 분리된 단백질을 Nitro Cellulose 멤브레인(NC Membrane, 0.2 μm(AE-6667-N, ATTO))과 Ponceau S(Thermo Fisher, Waltham, Massachushetts, USA, No. BP103-10)를 사용하여 습식 전사법을 이용하여 전사하였다. , 원하는 크기로 자르고, 1X TBS-T 완충액(Tris Buffered Saline with Tween 20)으로 10분간 3회 세척한 후 TBS-T 용액에 녹였습니다. 3% BSA(Bovine Serum Albumin, BOVOGEN Biologicals, Keilor East, Australia, BSAS No. 0.1)로 1시간 동안 차단되었습니다.
지방 조직에서 유래된 일차 세포를 분리하여 마우스에서 보이는 표현형이 세포에서도 유사하게 발현되는지 확인했습니다. 분리 후 24시간이 지나면 배지를 갈아주어 일차지방세포를 제외한 세포를 제거한다.
통계 분석
결과
이전 두 실험에서 갈색 지방의 CRTC3 변화는 비만과 당뇨병에 대한 저항성을 나타냈습니다. 본 실험을 통해 얻은 결과인 CRTC3 발현에 의한 에너지 소모 증가가 갈색지방의 영향임을 확인하기 위해 단기간 저온 노출 시 체온 조절 능력을 확인하였다. 5시간의 저온노출을 기준으로 일반사료섭취군에서 실험군과 대조군의 온도차이는 다음과 같다.
이는 발열에 있어서 위에서 확인한 결과가 지속됨을 보여주었다. 갈색지방 mRNA를 이용한 qRT-PCR에서도 SDHA, PDHA1, UCP1과 COXII, CIDEA, ATP synthase 등 미토콘드리아 관련 유전자가 함께 유의하게 증가하는 것을 확인하였다(도 13).
고찰
정상적인 식이를 먹인 CRTC3 과발현 생쥐의 체중 변화. CRTC3 과발현 마우스의 갈색 지방 차이 비교. CRTC3 과발현 마우스에서 포도당 내성 및 인슐린 저항성 테스트.
CRTC3를 과발현하는 생쥐의 대사 케이지 실험. CRTC3 과발현 마우스의 체중 기반 에너지 소비 분석.
CL-316,243 주사 이전
에너지 대사와 마우스 체중의 상관관계를 분석하기 위해 실험에 사용된 마우스의 체중과 CL-316,243 투여 여부에 따라 OXYMAX CLAMS로 측정한 결과값을 검증하였다.
CL-316,243 주사 이후
마우스의 저체온증에 의한 쇼크에 의한 사망을 방지하기 위해 체온이 30℃ 이하로 떨어지지 않도록 하였다. 대사실험을 마친 마우스의 단백질 발현 정도를 확인하기 위해 지방 시료 커피를 이용하여 웨스턴 블롯을 실시하였다. 대조군과 일반식이급여군의 실험군을 사용하였으며, 로딩 대조군으로는 HSP90을 사용하였다. CRTC3 과발현에 따른 미토콘드리아 및 후보 CRTC3 표적 유전자의 발현 수준을 확인하기 위해 qRT-PCR을 사용하였고 L32를 로딩 대조군으로 사용하였다.
고지방식이) CRTC3 과발현 마우스와 고지방 섭취 마우스의 체중 변화. 실험군 간 고지방식에 의한 비만 유발의 차이를 확인하기 위해 24주령 이후 마우스를 해부하여 간, 백색지방, 갈색지방의 무게를 측정하였다.
Liver
고지방식으로 비만을 유도한 후 두 그룹 간 갈색지방의 색과 크기의 차이가 확인되었습니다. 고지방식) CRTC3 과발현 마우스의 체중당 에너지 소비 변화 분석. 4℃ 비만에 따른 갈색지방조직 활성도 변화가 체온조절에 미치는 영향을 확인하기 위함이다.
대사 실험이 완료된 생쥐의 단백질 발현 수준을 확인하기 위해 대조군과 고지방식 섭취군의 갈색 지방 시료를 이용하여 웨스턴 블롯을 실시하였고, 로딩 대조군으로 HSP90을 사용하였다. 고지 방식) CRTC3 과발현 마우스의 mRNA 발현 수준 비교.
참고 문헌
12] Singh Rajan, Braga Melissa, Pervin Shehla, Regulation of brown adipocyte metabolism by myostatin/follistatin signaling, Frontiers in Cell and Developmental Biology, 2, 2014, page 60. 2008) PRDM16 controls the brown fat/skeletal muscle switch. 2004) Activation of cAMP response element-mediated gene expression by regulated nuclear transport of TORC proteins. Metabolic consequences of the presence or absence of thermogenic capacity of brown adipose tissue in mice (and presumably humans).
Lkb1 controls brown adipose tissue growth and thermogenesis by regulating the intracellular localization of CRTC3. Chronic peroxisome proliferator-activated receptor gamma (PPARgamma) activation of epididymal-derived white adipocyte cultures reveals a population of thermogenically competent, UCP1-containing adipocytes molecularly distinct from classical brown adi.
Abstract
