Mitochondrial DNA Cytochrome b 유전자에 기초한 한국산 금강모치의 분자계통학적 연구

Mitochondrial DNA Cytochrome b 유전자에 기초한 한국산 금강모치의 분자계통학적 연구

이승록¹*·김진재²

1국립공원관리공단 치악산국립공원사무소, ²국립공원관리공단

Molecular Phylogeny Study of Rhynchocypris kumgangensis in Korea Based on the Mitochondrial DNA Cytochrom b Gene

Seung-Rok Lee

¹

* and Jin-Jae Kim

²

1Chiaksan National Park Office, National Park Service, Wonju 26304, Korea

2National Park Service, Seoul 04212, Korea

요 약 :한국고유종인금강모치집단의계통분류학적위치를알아보기위해미토콘드리아 Cytochrome b유전자서 열(1,141bp)을 분석하였다. 그 결과, 총 27개의 haplotype이 확인되었다. 유전다양성은한계와홍천집단이 0.9333±0.1217 로 가장 높았고무주, 가평, 양구 집단이 0.0000±0.0000로 가장 낮았다. 유전적분화지수(FST)는 금강(0.926~1.000)이 가장 높았다. AMOVA분석을통하여 Cluster 1(양구, 몰운, 봉산), Cluster 2(한계, 홍천, 평창), Cluster 3(영주, 가평, 원주), Cluster 4(봉화, 방동) 및 Cluster 5(무주)의 5개 집단으로 구분되었다. 한강집단(Cluster 1~4)과 금강집단 (Cluster 5) 사이의 염기서열 차이는 27~73bp(2.4~6.4%)이었고 유전적 거리는 0.029~0.036으로 확인되었다. NJ (Neighbor joining) 분석에 의해 금강집단(Cluster 5)은 높은 수치의 신뢰도(94BP)를 나타내면서 한강집단(Cluster 1~4)과 명확히 구분되었다. 수계별 집단간염기서열 분석 결과는 금강모치의 금강집단(무주)이 종수준으로 분화한 것을보여주었다.

주요어 :국립공원, 금강모치, 분자계통학, 금강, Cytochrome b

Abstract :The Phylogenetic status of populations of Rhynchocypris kumgangensis, is one of the Korean endemic species, has been analyzed using mitochondrial DNA cytochrom b sequences (1,141bp). As a result, twenty-seven haplotypes in total were defined. The value of haplotype diversity of Hangye (HG) and Hongcheon (HC) populations was 0.9333±0.1217, which was the highest, while that of Muju (MJ), Gapyeong (GP) and Yanggu (YG) was 0.000±0.000, which was the lowest. As for the F_ST values, the value of Kum River (0.926~1.000) was the highest. Based on the result of AMOVA analysis, the populations were divided into five cluster: Cluster 1 (Yanggu; YG, Molun; ML, Bongsan; BS), Cluster 2 (Hangye; HG, Hongcheon; HC, Pyeongchang; PC), Cluster 3 (Yeongju; YJ, Gapyeong; GP, Wonju; WJ), Cluster 4 (Bonghwa; BH, Bangdong; BD) and Cluster 5 (Muju; MJ). The difference of DNA polymorphisms between Han River population (Cluster 1~4) and Kum River population (Cluster 5) was 27 to 73bp (2.4~6.4%) and the identified pairwise genetic distance was 0.029 to 0.036. According to the NJ (Neighbor joining) analysis, Kum River populations were clearly distinguished from Han River populations in that the former showed a high level (94BP) of reliability. The result of sequence pairwise comparisons indicates that as for the phylogenetic status, Kum River groups (Muju; MJ) of Rhynchocypris kumgangensis were differentiated to a specific level of species.

Key words :Korea National Park, Rhynchocypris kumgangensis, Molecular Phylogeny, Kum River, Cytochrome b

*Corresponding author E-mail: lsl7007@knps.or.kr

서 론

유라시아와 북아메리카에 서식하는 황어아과 어류는 68속 이 알려져 있다(Nelson 2006). 국내 황어아과 어류는 Mori (1936), Uchida(1939), 정(1977), 전(1980) 및 김 등(1985)에 의해 정리되었고 김(1997), 윤(2002) 및 김 등(2005)은 4속 9종으로 분류하였다.

잉어과(Cyprinidae) 황어아과(Leuciscinae) 금강모치 Rhyn- chocypris kumgangensis는 한국고유종이다(환경부 2011; 이 2012). Uchida(1939)가 Moroco sp.로 기재한 후 정(1977)은 Moroco keumkang으로 명명하였고 김(1980)은 Moroco kum- gangensis로 신종발표하였다. 이 후 김 등(1985)은 Moroco keumkang이라 하였고 김(1997)은 Rhynchocypris kumgangensis 로전환하여학자마다학명사용에 있어다른 견해를보여왔 다. 외부형태는동일속의어류와 다르게등지느러미기부에 흑색 반점과 체측에 2줄의 황색 세로띠가 있다(최와 김 1972; 최, 1989; 이 2015). 선행연구자들에 의해 북한강과 남한강의 상류계곡 서식지가 확인되었고 최와 김(1972)에 의해 덕유산국립공원 구천동계곡의 금강집단이 보고된 후 신규서식지는 발견되지 않았다. 금강모치를 대상으로한 연 구는 강(1986), 송(2000), 백 등(2002), 이 등(2008), Yun et al.(2012)에 의해 선행되었지만 금강집단에 대한 연구는 서 와 양(1989)으로 한정되어 있어 수계별 집단간 차이를 종합 적으로 비교하기 어렵다. 또한 금강집단을 대상으로 유전자 염기서열을 분석한 연구는 전무하다.

따라서, 본 연구는 12개 지점에 서식하는 금강모치 집단 의 mitochondrial DNA cytochrom b 유전자 염기서열을 비 교하여 금강모치 집단간의 분류학적 위치를 논의하고자 한다.

재료 및 방법

금강모치 표본은 2012년 4월부터 2013년 11월까지 12개 지점에서 투망, 족대 및 유인어망을 이용하여 채집하였다 (Table 1). 분석을 위해 등면 근육을 채취하였고 Genomic

DNA 추출은 DNeasy Blood & Tissue Kit(QIAGEN Co., USA)를 이용하였다. 2쌍의 primer set(npsf3 : forward 5'- ACC GAA ACC TGT GAT TTG AAG A-3', reverse 5'- ACC ACA AAT CCG AGC AAA TCT-3', npsf5: forward 5'-ACA CGA AAC CGG ATC AAA CA-3', reverse 5'-AAA TCT CCT TCT TTT GGG CG-3')을 증폭에 사용하였다.

Cyt b 영역은 G-Taq PCRPrimix Kit(COSMO geneteck, Korea)를 이용하여 74개체를 증폭하였고 PCR 반응 조성액 은 Primix 10µl, Genomic DNA 1µl, Primer 10 pmol forward 1µl, Primer 10 pmol reverse 1µl, D/W 7µl를 혼합하여 총 20µl를 반응시켰다.

PCR 조건은 95^oC에서 10분간 변성, 95^oC에서 30초, 53^oC 에서 30초, 72^oC에서 1분으로 35 cycle, 72^oC에서 10분간 확 장시켰다. 반응물은 1% agarose gel에 전기영동하였고 PCR purification Kit(COSMO geneteck, Korea)를 이용하여 정제 하였다. 염기서열은 ClustalX1.8(Thompson et al. 1997)을 사 용해서 align하였다. Haplotype과 Nucleotide diversity분석에 는 ARLEQUIN 3.01(Excoffier et al. 2005)을 사용하였다. 집 단간 유전적분화지수와 유전적 차이를 예측하기 위한 F_ST와 AMOVA분석은 Genepop과 ARLEQUIN 3.01을 이용하였다. 계통관계는 MEGA 5.0(Tamura et al. 2011)에있는 Neighbor joining(NJ)에 기초하여 확립하였다. NJ에서 사용한 모델은 Kimura-2 Parameter였으며, 계통도 내 branch node 신뢰도를 확인하기 위해 1,000 bootstraping을 수행하였다.

결 과 1. 유전 다양성

Cytochrome b 유전자는 다양한 어류의 계통연구에 이용 되어 왔다(Wang et al. 2004; 김 2005; 김 등 2006; Yu et al.

2010, 채 등 2014). 본 연구대상 어류인 금강모치 12개 집단 의 Cyt b 유전자 1,141bp에서 총 27개의 haplotype이 확인 되었고 수계별로는 북한강 12개, 남한강 16개 및 금강의 1 개 haplotype으로 구분되었다(Table 2). Haplotype diversity 는 북한강수계인 한계(HG)와 홍천(HC)집단이 0.9333±0.1217

Table 1. Sampling locations of Rhynchocypris kumkangensis from Korea.

Location River System

GP. Jeokmok-ri, Buk-myon, Gapyeong-gun, Gyeonggi-do BukHan R.

YG. Chiljeon-ri, Bangsan-myon, Yanggu-gun, Gangwon-do BukHan R.

BD. Bangdong-ri, Kirin-myon, Inje-gun, Gangwon-do BukHan R..

HG. Hangye-ri, Buk-myon, Inje-gun, Gangwon-do BukHan R.

HC. Saenggok-ri, Seoseok-myon, Hongcheon-gun, Gangwon-do BukHan R.

PC. Dongsan-ri, Jinbu-myon, Pyeongchang-gun, Gangwon-do NamHan R.

BS. Bongsan-ri, Imgyeo-myon, Jeongseon-gun, Gangwon-do NamHan R.

ML. Molun-ri, Hwaam-myon, Jeongseon-gun, Gangwon-do NamHan R.

WJ. Seongnam-ri, Sinrim-myon, Wonju-si, Gangwon-do NamHan R.

YJ. Marak-ri, Dansan-myon, Yeongju-si, Gyeongbuk-do NamHan R.

BH. Uguchi-ri, Chunyang-myon, Bonghwa-gun, Gyeongbuk-do NamHan R.

MJ. Samgong-ri, Solcheon-myon, Muju-gun, Jeollabuk-do Kum R.

Table 2. Distribution ofCyt b haplotype, number of haplotypes, Haplotype diversity (h) and Nucleotide diversity (π) at 12 populations inRhynchocypris kumgangensis. IndividualHaplotypes Number of haplotypesHaplotype diversity(h)Nucleotide diversity(π)H 1H 2H 3H 4H 5H 6H 7H 8H 9H 10H 11H 12H 13H 14H 15H 16H 17H 18H 19H 20H 21H 22H 23H 24H 25H 26H 27 Buk Han Riv.

GP6610.0000±0.00000.00000±0.00000 YG6610.0000±0.00000.00000±0.00000 BD65120.3333±0.21520.001753±0.001319 HG61121150.9333±0.12170.003915±0.002590 HC62111150.9333±0.12170.006193±0.003914 Nam Han Riv.

PC5211140.9000±0.16100.004032±0.002780 BS6121240.8667±0.12910.003097±0.002113 ML6211240.8667±0.12910.002688±.001873 WJ65120.3333±0.21520.000292±0.000385 YJ54120.4000±0.23730.001402±0.001156 BH65120.3333±0.21520.000292±.000385 Kum Riv.MJ101010.0000±0.00000.00000±0.00000 Total7461251123111111117121125141110 See the Table 1. Table 3.FSTvalues of the mtDNACyt b among 12 populations (*;p<0.01). Buk Han Riv.Nam Han Riv.Kum Riv. GPYGBDHGHCPCBSMLWJYJBHMJ Buk Han Riv.

GP YG1.000＊ BD0.917＊ 0.929＊ HG0.594＊ 0.295＊ 0.766＊ HC0.442＊0.2430.642＊ 0.002 Nam Han Riv.

PC0.493＊ 0.437＊ 0.748＊-0.054 -0.061 BS0.7410.1850.813 0.053 0.108 0.152 ML0.744＊0.0800.823＊ 0.071 0.060 0.1370.057 WJ0.923＊0.973＊ 0.904＊ 0.576＊ 0.400＊ 0.470＊ 0.724＊ 0.724＊ YJ0.741＊ 0.836＊ 0.853＊ 0.409＊ 0.260＊ 0.289＊ 0.552＊ 0.503＊ 0.693＊ BH0.977＊ 0.968＊ 0.923＊ 0.520＊ 0.484＊0.572＊0.5170.709＊0.955＊ 0.881＊ Kum Riv.MJ1.000＊ 1.000＊ 0.979＊ 0.953＊ 0.926＊ 0.957＊ 0.964＊0.968＊ 0.996＊0.985＊ 0.997＊ See the Table 1.

로 가장 높았고 가평(GP), 양구(YG) 및 무주(MJ)집단이

0.0000±0.0000으로 낮게 나타났다. 모천으로 회귀과정에서

유전적교류가일어나유전적다양성이증가하는연어과어 류와다르게 내륙의 고립된특정지역에 서식하는 담수어종

은 유전적다양성이 낮은 경향을보인다(장 등 2006; Yu et

al. 2010). 본 연구에서도 12개 집단 중 가평(GP), 양구(YG) 및 무주(MJ)집단에서 유사한 결과가 확인되었는데 대상종이 산악지형에 고립되어 분포하는 생태적 특성에 따른 결과로 사료된다.

2. 유전적 차이

유전적분화지수(F_ST)는 1.0에 가까울수록높은분화지수를 의미한다(이 등 2014). 수계간 F_ST는 북한강과 금강, 남한강 과 금강이 0.926~1.000과 0.957~0.997로 높았다(Table 3). 김 등(2006)은 우리나라는 다양한 계곡과 하천이 산맥으로 단 절되어있는독특한지리적특성을보이는데이러한지형에 오랜기간 격리되어 서식하는 어류는 종내에서도 유전적차 이가 나타난다고 하였다. 금강모치의 금강집단은 무주구천 동 계곡에만 제한적으로 서식하여 한강수계와 상이한 유전 적 차이를 보이는 것으로 사료된다.

F_ST를 근거로 주성분분석(PCA)을 실시한 결과, 12개 집단 은 5개의 Cluster로 명확히 구분되었다. 서로 인접한 지역에 서식하는 봉산(BS)과 몰운(ML)집단은 강한 Cluster 1을 형 성하였고 지리적으로 북한강과 남한강으로 구분되는 홍천

(HC), 평창(PC)집단과 가평(GP), 원주(WJ)집단도 유전적으

로는 가까워 Cluster 3과 Cluster 4로 구분되었다(Figure 1).

하지만 한강수계와 함께 서한아지역에 포함되는 금강수계 무주(MJ)집단은 독립된 Cluster 5를 나타내었다. 이러한 결 과는 서로동일한아지역에서식하는어류 집단은유전적으

로 서로 가깝다고 주장하는 김 등(2006), 송과 방(2009) 및

이 등(2014)의 연구결과와차이를보였다.

3. 계통관계 분석

금강모치의 12개 집단에 대한 P-distance와 염기서열 차이

를 나타낸 결과는 Table 4와 같다. 지리적으로인접한 북한

강과남한강의 염기서열 차이는 2~48bp로 확인되었고서식

지가완전히 분리되어 있는 남한강과 금강집단의염기서열 차이는 27~38bp, 북한강과 금강집단의 염기서열 차이는 40~73bp로 높게 확인되었다(Table 4).

계통관계를 추정하기 위해 동일속(Rhynchocypris)의 ingroup 27개와 outgroup 1개의 유전적 거리에 따른 NJ(Neighbor- Joining) tree를비교분석한결과에서도 outgroup은 ingroup에 속하지 않고완전히 분리되었고한강집단과 금강집단은단 계통군을 형성하지 않고뚜렷하게구분되었다(Figure 2). 또 한 북한강과 남한강집단은 유전적으로 유사한 Clade 1으로 grouping되었고, 금강집단(haplotype27)은 높은 수치의 신뢰 도(94BP)를 나타내면서 한강수계 집단들과 명확하게 분리되 었다(Figure 2).

고 찰

담수어류의 유전자분석을 통해 집단간 계통분류학적 차이 를 규명한 연구는 다양한 종을 대상으로 진행되어왔고 선행 연구에서는 종수준에 차이를 규명하기 위해 집단간 유전적 거리를 비교하였다. 서와 채(2000)는 잔가시고기 Pungitius kaibarae와 가시고기 Pungitius sinensis가 0.213~0.230의 유 전적 거리를 보여 종수준으로 분류된다고 하였고 송과 방 (2009)은 쉬리 Coreoleuciscus splendidus 집단이 0.63~0.71의 유전적 거리를 보이면서 서한아집단과 남한아집단으로 구분 된다고 하였다. 변 등(2009)은 남한의 둑중개 Cottus집단이

배봉천집단과 0.222~0.304의유전적거리로 분지된다고하

였다.

본 연구에서 금강모치의 한강집단과 금강집단은 0.029~

Figure 1. Principal Component Analysis (PCA) showing the genetic relationships among 12 populations. See the Table 1.

Table 4. Pairwise genetic distances (lower-left) and nucleotide differences (upper-right) of haplotypes of Rhynchocypris kumgangensis. 123456789101112131415161718192021222324252627 Buk Han Riv.

Hap_1615212323242729293234333635393941414344444345474873 Hap_20.0059151818182123232628273029333335353738383739424268 Hap_30.0100.012610991214141719182120242426262829292830333359 Hap_40.0150.0170.0052236881113121514181820202223232224262753 Hap_50.0060.0010.0120.018125771012111415171719192122222123252652 Hap_60.0050.0040.0120.0170.004135581091213151717171920201921232450 Hap_70.0010.0040.0090.0140.0050.00435581091213151417171920201921232450 Hap_80.0060.0040.0120.0180.0050.0040.00522578912121214141617171618202147 Hap_90.0050.0040.0120.0170.0040.0040.0040.0041356710101212121415151416181945 Hap_100.0060.0040.0110.0160.0050.0040.0050.0050.00135671010912121415151416181945 Hap_110.0090.0110.0060.0110.0120.0110.0080.0120.0110.010254777991112121113151642 Hap_120.0030.0060.0110.0160.0070.0060.0020.0070.0060.0070.010525557791010911131440 Nam Han Riv.

Hap_130.0070.0020.0130.0190.0030.0050.0060.0060.0050.0060.0120.00813356578899111238 Hap_140.0040.0030.0110.0160.0040.0010.0040.0040.0030.0040.0100.0050.0043345578899111238 Hap_150.0050.0040.0100.0150.0040.0040.0040.0040.0040.0030.0090.0060.0050.003224467789101138 Hap_160.0060.0040.0120.0180.0050.0030.0050.0050.0040.0050.0120.0070.0060.0020.004222455668936 Hap_170.0060.0010.0120.0180.0020.0040.0050.0050.0040.0050.0120.0070.0030.0040.0040.00511344557835 Hap_180.0060.0010.0120.0180.0020.0040.0050.0050.0040.0050.0120.0070.0030.0040.0040.0050.0021233446734 Hap_190.0030.0030.0110.0160.0040.0040.0020.0050.0040.0050.0100.0040.0040.0040.0040.0050.0040.004233446734 Hap_200.0060.0040.0120.0180.0050.0040.0050.0050.0030.0040.0120.0070.0060.0040.0040.0050.0050.0050.00511424532 Hap_210.0060.0010.0120.0180.0020.0040.0050.0050.0040.0050.0120.0070.0030.0040.0040.0050.0020.0020.0040.0051313431 Hap_220.0020.0050.0100.0150.0060.0050.0010.0060.0050.0060.0070.0030.0070.0040.0050.0060.0060.0060.0030.0060.006313431 Hap_230.0030.0060.0110.0160.0070.0060.0020.0070.0060.0070.0080.0040.0080.0050.0060.0070.0070.0070.0040.0070.0070.00112330 Hap_240.0020.0040.0100.0150.0040.0050.0010.0060.0050.0060.0090.0030.0050.0040.0050.0060.0040.0040.0010.0060.0040.0020.0032330 Hap_250.0050.0050.0120.0170.0060.0070.0040.0080.0070.0080.0110.0040.0070.0060.0070.0080.0060.0060.0040.0080.0060.0050.0060.004128 Hap_260.0070.0050.0130.0190.0060.0040.0060.0060.0050.0060.0120.0080.0070.0030.0050.0010.0060.0060.0060.0060.0060.0070.0080.0070.00927 Kum Riv.Hap_270.0300.0310.0310.0360.0300.0320.0290.0320.0320.0320.0330.0310.0320.0310.0310.0320.0320.0320.0310.0320.0320.0300.0310.0300.0320.033

0.036의 차이를 보였고 선행연구보다 낮은 유전적 거리를 나타내는 것으로 확인되었다(Table 4). 하지만 일본, 러시아 및 중국의 동북아지역에 서식하는 참붕어 Pseudorasbora parva를 대상으로한 Watanabe et al.(2000)의 연구에서는 본 연구결과보다 낮은 0.01~0.021의 유전적 거리가 확인되었다.

또한 서와 채(2000), 송과 방(2009) 및 변 등(2009)은 AFLP finger printing, RAPD PCR, 18s ribosom DNA 및 16s

rRNA를 대상으로 분석을 실시하여 연구방법과 유전자 증폭

부위에서 본 연구와 차이가 있다. 정확한 비교를 위해서는 다양한 어종을 대상으로한 Cytochrom b 유전자 분석이 필 요할 것으로 사료된다.

Cytochrom b 유전자를 이용한 종내 집단간 유전적 차이 에 대한 연구는 어종을 대상으로 수행되었다. 김 등(2006)은 자가사리 Liobagrus mediadiposalis의 낙동강집단이 금강집 단과 5.5~5.7%, 섬진강집단과 5.1~5.5%의 유전적 차이를 보 여 3개 집단으로 구분된다고 하였고 꺽지 Coreoperca herzi 를 대상으로한 김(2005)의 연구에서는 지역별로 6.9~12.1%

유전적 차이를 보인다고 보고한바 있다. 서와 양(1989)은 금 강모치의 유전학적 차이를 알아보기 위한 동위효소분석에서

한강수계 집단이 금강수계 집단에 비해 변이가 높은 것으로 보고하였다. Cytochrom b 유전자를 이용한 본 연구결과에서 는 북한강과 남한강 집단 사이의 유전적 차이는 0.2~4.2%

(2~48bp), 한강과 금강 집단의 유전적 차이는 2.4~6.4%(27~

73bp)로 확인되어 서와 양(1989)의 결과와 다르게 금강수계

집단의 유전적 차이가 높아 주목되었다.

종합하면, 이(2015)의 연구에서 외부형태적으로 차이를 보 이는 점, 금강집단이 단일 haplotype으로 구분되고 높은 F_ST 지수(0.926~1.000)를 보이는점, 한강집단과 금강집단의 염기 서열 차이(2.4~6.4%), NJ 분석에서 금강집단이 한강집단과 단계통군을 형성하지 않고 분지되는 이상의 분석결과에서 금강수계 집단의 금강모치는 한강수계 집단과 외부형태와 유전적으로 구분되어 종수준으로 분화한 것으로 사료된다.

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(2016년 8월 8일접수; 2016년 9월 23일채택)