1장. 유용미생물의 검색 및 보존
경북대학교 미생물공학연구실
KNUmbl
발효공학 1장 : 유용미생물의 검색 및 보존
1-1. 유용미생물의 검색
* 발효 미생물에 의한 발효
이전 : 혼합배양-다양한 미생물 종이 혼합된 상태에서 발효 현재 : 대부분이 순수배양에 의해 진행
-우수한 균주의 획득이 최우선
* 유용미생물 : 산업화의 경제성, 편이성
1) 값싼 기질의 이용 : 미생물의 다양한 탄소원 이용 특성
2) 내열성 강 : 높은 온도에 내성 강 -오염의 위험 감소 및 배지의 냉각비 절감 3) 발효설비 및 공정에 적합
4) 생리적 성질의 안정성, 육종의 용이성 5) 원료에 대한 산물의 수율 및 생산성 고
6) 배양액으로부터 정제 및 제품화 용이 - 부산물 생성 약
* Screening(검색, 탐색) : 유용미생물, 우수미생물을 선택적으로 구별하여 선별 1) 천연의 시료로부터 분리
2) 균주 보존기관으로부터 분양 받아 검색
3) 균주 개량을 통한 육종 : 돌연변이, 형질전환, 세포융합, 유전자조작
발효공학 1장 : 유용미생물의 검색 및 보존
주요발효미생물
■ 발효의 이용
1) 발효식품 : 발효식품학
2) 발효산물 : 미생물 대사산물의 생산 및 이용 - 발효공학 3) 미생물 기능 : 환경오염, 원유 탈황, 금속 정제 등
■ 발효산물의 생산 1) 유기산발효
- 젖산 :
Lactobacillus delbrueckii subsp. delbrueckii
,L. delbrueckii subsp.
bulgaricus, L. plantarum
등-
Aspergillus niger
[구연산],Rhizopus stolonifer
[푸마르산]2) 아미노산발효 :
Corynebacterium glutamicum, Brevibacterium flavum
3) 정미성 뉴클레오타이드 :Corynebacterium ammoniagenes
4) 생리활성물질 :
Ashbya gossypii
[비타민B2] 등 5) 항생물질 :Penicillium
sp.,Streptomyces
sp.6) 효소 :
Aspergillus
sp.,Muco pusillus
,Bacillus subtilus
등 7) 미생물균체 :Candida utilis, Chlorella
sp.7) 알코올 :
Saccharomyces cerevisiae
,Zymomonas mobilis
등발효공학 1장 : 유용미생물의 검색 및 보존
1. 분리원 : 생태적 분포 고려 가. 일반적 조건
1) 토양(10 8-9 cell/g) : 세균, 방선균 -많은 미생물 난배양성
–
단 몇% 배양가능 -깊은 곳에는 산소 부족으로 생균 수 감소2) 담수 및 해수 : 10 2-7 cell/g 3) 기타 : 식품,
동물, 식물 등
Depth (cm) 3-8 35-40 135-145
Bacteria 9,750,000 570,000 1,400
Actinomycetes 2,800,000 49,000 0
Algae 25,000 500 0
Fungi 119,000 14,000 3,000
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나. 특수한 미생물 : 특정능력 뛰어난 균주 -극한미생물 (extremophiles)
-새로운 효소, 물질 생산능, 증식속도, 기질특이성, 내열, 내산, 내알칼리 등 -특수환경 : 고산, 혹한, 해수, 심해, 사막, 온천 등
: 극지미생물 - 북극 다산기지, 남극 세종기지
–
내한성,
항빙결성 단백질 연구: 호염성 미생물 : 간장, 된장 (18-20% NaCl) : 호열성 미생물 : 온천
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Ice structuring proteins (ISPs)
***극지미생물 연구 : ..\극지미생물 .ppt
Antifreeze proteins (AFPs) or ice structuring proteins (ISPs) refer to a class of
polypeptides produced by certain vertebrates, plants, fungi and bacteria that permit their survival in subzero environments. AFPs bind to small ice crystals to inhibit
growth and recrystallization of ice that would otherwise be fatal.
Freeze avoidant: These species are able to prevent their body fluids from freezing altogether. Generally, the AFP function may be overcome at extremely cold
temperatures, leading to rapid ice growth and death.
Freeze tolerant: These species are able to survive body fluid freezing. Some freeze tolerant species are thought to use AFPs as cryoprotectants to prevent the damages of freezing but not freezing altogether.
* AFP의 종류
1) Fish AFPs : Type I AFPs are found in winter flounder and shorthorn sculpin. Type II AFPs are found in sea raven, smelt and herring. Type III AFPs are found in Antarctic eelpout. Type IV AFPs are found in longhorn sculpins.
2) Insect AFPs : Type V AFPs are the hyperactive (i.e. greater thermal hysteresis value) AFPs found in insects.
3) Plant AFPs : Plant AFPs are rather different from the other AFPs in the following aspects: They have much weaker thermal hysteresis activity when compared to other AFPs. Their physiological function is likely in inhibiting the recrystallization of ice rather than in the preventing ice formation.
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2. 미생물의 분리
1) 집식배양(집적배양, enrichment culture) : 목적미생물의 존재율을 증가시키는 배양
* 시료에는 각종의 미생물이 공존 (미생물군, microflora 형성)
-목적 미생물의 최적 생육조건, 다른 미생물이 못 자라는 조건 등의 이용
* 특정조건의 이용
-온도 : 고온균, 저온균 -pH : 내산성, 내알칼리성 -산소 : 호기성, 혐기성 -빛과 CO2 : 광합성균 -항생제 : 항생제 내성
-Analog(ue)(대사 유사물질) : analog 내성 미생물 : 대사물질과 구조가 비슷하나 대사는 불가한 물질
대사물질 대신 흡수되어 대사물질의 흡수 방해 또는 대사 방해 -탄소원 : 특정의 탄소원 분해 미생물
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2) 분리법
: (집식배양)--현탁--순수분리--평판도말배양--시험관에 배양하여 보관 가) 현탁: 멸균 증류수 또는 0.85-0.9% 식염수 이용--때에 따라 유화제 첨가 나) 희석: 희석배양(순차희석, 3단희석)
다) 순수분리 : 평판배양, 소적배양법, micromanipulator 이용
***소적배양(drop culture)
***Micromanipulator: ..\micromanipulator.ppt 라) 평판도말배양 : 순수분리 반복
마) 시험관 배양--사면배양, 천자배양 바) 역가 측정
3) 선택배지(selective medium): 특정 미생물만의 생육을 위해 고안된 배지 --특정 영양성분, 다른 미생물의 생육억제물질 첨가
가) 각종의 미생물에 대한 특정의 영양성분을 함유하는 배지 개발 : 특정의 탄소원 이용-특히 독성물질 분해 균의 경우
나) 생육억제물질 첨가
: sodium propionate (0.3mg%--곰팡이 생육 억제) cycloheximide(곰팡이, 효모 생육억제)
담즙산(bile acid) : 장내세균 이외의 세균 억제
항생제 : penicillin (그람 양성균 억제), Sm과 Tc (일반세균 억제)
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1-2. 균주의 동정과 명명
1. 미생물의 동정(identification): 분리 균주가 분류체계 어디에 속하는 가 결정 -- 특성을 기지의 균종과 비교 -- 속과 종을 결정, 때에 따라 속까지만 결정 1) 세균 : Bergey's Manual of Systematic Bacteriology I-IV
(Krieg & Holt, 1984-1989)
-- 2nd ed : Vol. I (2001), Vol. II (2005)
2) 효모 : The yeasts, A taxonomic study 4판 (Kurtzman & Fell, 1998) 3) 곰팡이: The Fungi I-IV (Ainsworth, 1973)
Ainsworth and Bisby's Dictionary of the fungi 8판 (Ainsworth, 1994)
2. 미생물의 명명 : 학명(scientific name)의 사용 *俗名(common name) -- 이명법(binominal nomenclature) 사용: 속명과 종명
(이태릭체 단수 표시 또는 밑줄)
예)
Saccharomyces cerevisiae,
Saccharomyces cerevisiae1) 효모, 곰팡이 : 국제 식물명명 규약(International rule of botanical nomenclature)
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미생물명의 표기1) 속명(genus)---- 첫 글자는 대문자--- 균의 공통적 특징 - 새로운 속 : gen. nov.로 표시
2) 종명(species)- 모두 소문자- 균의 성상, 기원, 내력, 지명, 인명 예)
Escherichia coli, Saccharomyces cerevisiae
- 종을 모를 때 속 뒤 sp. or spp. (보통체 소문자) 붙임 예)
Saccharomyces
sp. orSaccharomyces
spp.- 신종: sp. nov.; n. sp.; nov. sp. (보통체 소문자) 속명 뒤 표시 예)
Saccharomyces heuidongcus
sp. nov.- 아종: 종명 뒤 subsp.(보통체 소문자) 아종명 표시 예)
L. delbrueckii
subsp.Bulgaricus
변종은 인정 안 함 : var. – 혈청형과 생물형 인정 - 혈청형 : serovar.- 생물형 : biovar.
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1-3. 균주의 보존
* 미생물 균주의 보존 목적 : 사멸방지, 균주의 본래 형질 유지, 보존기간 연장, 접종원 반복사용, 오염방지, 조작용이
1. 균주의 보존법
1) 계대배양법(subculture) : 사면배양, 천자배양하여 냉장 -단기보존이 목적
2) 유동 paraffin 보존법: 고체배양--유동 paraffin 중층 -산소차단, 대사억제, 수분증발 방지 : 곰팡이
3) 증류수 보존법: 멸균증류수에 현탁 및 보존
4) 토양보존: 흙(수분 20%) + 배양액 - 그대로 또는 건조 보관 -세균, 효모, 곰팡이, acetone-butanol균
5) Slica gel 보존법: silica gel 결정 위에 건조시켜 그대로 보존
6) 자기구슬 보존법: 자기 또는 유리 구슬 표면에 묻혀 온화한 조건으로 건조
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7) 동결보존: 동해방지제 첨가하여 -80℃ 보관: 효모, 세균 : 5-20% glycerol, 2.5-10% DMSO
: dry ice(-70℃), 심온냉동고(-80℃), 액체질소(-196℃, 기상경우 -150~-170℃)
8) 동결건조법(lyophilization): 동결건조 후 5-7℃ 보존 : 세균, 효모, 곰팡이 -분산매 첨가: 동결과 건조에 의한 장애 감소 --10-15년 이상 보관가능
고분자(혈청,탈지유)+저분자(당,아미노산)- 탈지유(10%)+MSG(1-2%)+당(1-2%)
* 미생물 건조: 세포수분 제거--생활반응 정지--물, 영양분 첨가 시 대사 시작
* 균주 분양기관에서 보통 사용하는 방법: ATCC 4만주 중 100주 제외
9) L-건조법(liquid drying): 여지 또는 탈지면에 묻혀 높은 진공도에서 건조 -초기 동결장해 세균에 이용
CH3-S-CH3
∥
O DMSO(dimethyl sulfoxide)
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2. 균주 분양 : 표준 균주(type culture, type strain) - 속, 종, KCTC0000로 표시 : 미생물 보존기관: culture collections
: 미생물 보존기관연맹: federation of culture collections 1) 미국
- ATCC (American type culture collections) - 약 4만주 미생물 보관 - NCAUR(National Center for Agricultural Utilization Research)
: 미국 ARS의 NRRL (Northern region research laboratory) –농업/산업미생물 2) 일본
- NBRC (NITE Biological Resource Center) : 이전의 IFO (Institute for fermentation, Osaka)--발효연구소
- WFCC (World Federation of Culture Collections): 이전의 JFCC (Japan federation of culture collections) - 일본 미생물 보존기관 연맹
3) 한국
- KCTC (Korean collection for type cultures 한국표준균주보존기관) : 생명공학연구소(6천주)
- KCCM (Korean culture center of microorganisms, 한국미생물 보존센터) : 연대와 한국종균협회 공동운영
- KACC (Korean Agricultural Culture Collection) 농진청 농업유전자원센터내 한국농업미생물자원센터)
***주요 균주보존기관
