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이학석사 학위논문
Prohormone VGF 발현의 전사조절 연구
A study on the transcriptional regulation of prohormone VGF expression
울 산 대 학 교 대 학 원 의 학 과
신 민 경
[UCI]I804:48009-200000008216 [UCI]I804:48009-200000008216
Prohormone VGF 발현의 전사조절 연구
지 도 교 수 김 승 환
이 논문을 이학석사 학위 논문으로 제출함
2018 년 02 월
울 산 대 학 교 대 학 원 의 학 과
신 민 경
신민경의 이학석사학위 논문을 인준함
심사위원 김 혜 원 ( 인 ) 심사위원 김 영 훈 ( 인 ) 심사위원 김 승 환 ( 인 )
울 산 대 학 교 대 학 원
2018 년 02 월
국문요약
VGF 는 rat PC12 pheochromocytoma cell 에서 nerve growth factor (NGF)에 의해 유도되는 transcript 로서 처음 알려졌으며, VGF8a, NGF33.1, a2등 다양한 이름으 로 불려졌다. VGF 는 신경계 전반의 뉴론과 뇌하수체, 부신수질 등의 신경내분 비 조직, 그리고 위장관 및 췌장의 내분비 세포 등에서 광범위하게 발현되고 있으며, 에너지소비, 지질 저장, 포도당 항상성 등의 조절에 관여하고 있다. 한 편 최근 VGF 가 cAMP 의존적 경로를 통해 골형성을 증가시킨다는 결과가 공 동연구팀에 의해 제시되었다. 이러한 VGF 의 골형성 활성은 K562 세포가 phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) 처리에 의해 megakaryocyte로 분화되는 과
정에서의 conditioned medium 중에서 확인되었다. 또한 이후 연구를 통해 K562
세포의 분화 초기부터 중기 사이에 VGF transcript 양이 점진적으로 증가함을 알 수 있었다. 따라서 본 연구에서는 PMA 처리시 거핵세포로 분화 가능한
K562 세포에서 VGF 의 전사를 조절하는 기전을 연구함으로써 VGF 의 발현
제어에 이용하고자 하였다.
먼저 human VGF promoter 의 -775 에서 +241 nucleotide 에 해당하는 부분을
Genomatix program을 통해 분석하여, VGF 유전자의 전사를 조절할 수 있는 다
양한 전사인자 후보를 선별하였다. 이들 후보 전사인자 중 실제 VGF 전사에 관여하는 인자를 구별하기 위해 hVGF promoter (-775/+241) 부분을 포함하는 luciferase reporter 를 제작하고 K562 세포에 후보 전사인자들과 함께 reporter gene 을 transfection 하여 과발현 시켰다. Luciferase assay 결과, 여러 후보 인자 중 ELF-1, p65에 의해 hVGF promoter의 활성이 증가하였다. K562 세포 내 ELF- 1 을 과발현시킴으로 VGF mRNA 발현양 자체도 증가한 반면, p65 의 과발현은
VGF mRNA 양을 조절하지 못하는 것을 qRT-PCR 로 확인했다. 이후, hVGF
promoter의 serial deletion mutant promoter들과 point mutant promoter를 제작하여 ELF-1을 사용한 luciferase assay 수행을 통해 ELF-1에 의한 hVGF의 전사 활성 조절은 hVGF promoter 의 -82 와 -62 사이의 Ets binding site 를 통한 것임을 알 수 있었다. 이러한 결과들은 K562 세포의 거핵세포로의 분화과정 중 VGF 발현 에 ELF-1 이 관여할 수 있으며, 이를 이용하여 VGF 발현을 제어할 수 있는 가능성을 제시한다.
중요 단어
VGF; bone formation; K562 cell; megakaryocyte; E74-like factor 1 (ELF-1); nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells (NF-κB)
목 차
국문요약··· i
목 차···iii
List of Figures···iv
List of Tables ···v
서 론···1
재료 및 연구방법···4
재료···4
세포배양···4
Construct 제작···4
Promoter 분석···5
Luciferase reporter assay···5
cDNA 합성 및Quantitative real time PCR ···6
통계 분석···6
결 과···9
K562 cell 내에서 VGF expression을 조절하는 Transcription Factor선별. ···9
Ets binding site를 통한 ELF-1의 hVGF 전사 활성 조절. ··· 13
p65에 의한 hVGF promoter (-775/+241) 활성 조절. ··· 16
고 찰··· 19
참고문헌··· 21
영문요약··· 28
List of Figures
Figure 1. Effects of putative transcription factors on the activity of hVGF promoter ( (-775/+241) in myelogenous leukemia cell line K562. ··· 11
Figure 2. ELF-1 transactivated human VGF promoter via Ets binding site (-82/-62).··· 15 Figure 3. Effects of p65 on the transcription of hVGF. ··· 17
List of Tables
Table 1. Primers used in cloning of promoter constructs...7 Table 2. Primers used in qPCR ...8
서 론
VGF는 rat pheochromocytoma cell 인 PC12 cells에서 nerve growth factor (NGF) 처리 시 신경세포로 분화하면서 빠르게 증가하는 transcript로 처음 알려졌으며, VGF8a,
NGF33.1, a2 등의 다양한 이름으로 불려졌다 (1-4). VGF 이름의 V는 최초 발견
과정에서 PC12 cell에서 NGF에 의해 induction되는 VGF clone이 선별되었던 cDNA library plate 중 V plate에서 유래가 되었으며 VEGF와는 다른 종류이다 (1). VGF는 특히 시상하부, 해마 등 신경세포와 부신 수질, 이자와 같은 내분비세포에서 주 로 Pro-VGF의 형태로 발현된다 (5-9). Precursor인 pro-VGF는 insulin과 같은 호르 몬 처럼 secretory granule을 형성하고 (6, 9-11), prohormone convertase 1/3 (PC 1/3)와 PC2의해 가수분해 되어 VGF80, VGF 20, VGF10, VGF6, TLQP-62, TLQP-21, LQEE- 30, LQEE-19, NERP-1, NERP-2 등 많은 종류의 secreted peptides를 만든다 (7, 9, 11- 13).
VGF peptide의 알려진 기능으로는 크게 에너지 밸런스, 체내 수분밸런스, 통증,
기억과 우울증 조절에 관련한다고 알려져 있다. VGF peptide 중 비교적 연구가 많 이 진행된 C-terminal VGF peptide TLQP-21을 생쥐에 chronic intracerebroventricular
(ICV) injection 했을 때, 에너지 소비와 체온이 증가했다. 더욱이, 고지방식이를
섭취한 생쥐에 동일 peptide를 주었을 때 고지방식이로 인해 발생하는 hormone 변화와 체중증가가 억제 되었다 (14). 이처럼 TLQP-21의 에너지밸런스 관련한 역 할은 이미 많은 연구가 이루어졌고, glucose homeostasis 관련 역할은 최근에 연구 가 많이 이루어 졌다 (14-17). TLQP-21은 glucose-stimulated insulin secretion (GSIS) 를 향상시키고 cyclic AMP-mediated pathway를 통해 ß-cell survival을 증진시킨다는 보고가 있으며 (13), VGF 발현 억제시 insulin granule release 감소로 이어지는 연구 결과가 있다 (13, 18-20). 그 뿐만 아니라, non-endocrine cells에서 VGF 과발현시 granule형성이 증가하였고, 반면에 catecholaminergic chromaffin cell에서 VGF 기능 을 제거하자 granule size가 감소되었다 (18). 다른 여느 granin protien 처럼 cleavage되고 특히 낮은 pH 와 증가된 Ca2+환경에서 aggregation되는 granin으로서 의 공통적인 특징을 보인다 (18, 21). 또다른 VGF peptide의 알려진 기능으로, 수 분섭취를 제한한 rat의 증가된 바소프레신 (항이뇨 호르몬) 레벨이 NERP-1과
NERP-2 ICV injection시 감소되었고 체내 수분량 조절에 관여 한다고 보고된바 있 다 (22). 알츠하이머병 (Alzheimer's disease) 환자나 파킨슨병 (Parkinson's disease) 환자의 cortex내 VGF-derived peptide 레벨이 감소되어 있었고, TLQP-62를 rat에
ICV injection시 시냅스 활성, 신경발생, 인지능력이 향상되었다(23-25). 그리고 해
마에 microinjection시 항우울적 행동 효과를 보였다 (26-28). 게다가, TLQP-62
intrathecal infusion 한 rat의 경우 추위에 과민 반응하는것이 관찰되었으며 (29), TLQP-19와 TLQP-30이 척추 소교 세포에서 p38 MAP kinase phosphorylaiton를 증가 시킴으로서 VGF-derived peptide가 통각과민기능에 관여 한다고 보고된바 있다 (30).
생체 내에서의 VGF역할을 좀 더 이해하기 위해 VGF KO 생쥐를 제작한 선행 연구가 이루어 졌다 (11). VGF KO 생쥐는 대사과다, 지방분해 증가, islet 크기감 소 및 insulin과 glucose level이 감소 하였다 (16, 31, 32). 또한, 다양한 질병동물모 델 (diet-induced obesity, ob/ob, MC4R-/-)에서 VGF KO 생쥐의 비만, 당뇨, 고인슐린 혈증 형성이 개선 되었고, 몸무게와 지방무게의 상당한 감소가 공통적으로 보였 다(31-33). 한편, 최근 교내 공동연구팀에서 VGF와 관련한 흥미로운 연구 결과를 제시하였다. K562세포에서 분화된 거핵세포 배양액에 의해 조골세포의 생존능과 증식능이 증가하는 것을 확인 했고 (unpublished data), LC-MS/MS 및 MASCOT
database searching을 통해 세포 배양액 내로 분비된 단백 중 VGF를 조골세포 생
존능 및 증식능에 가장 큰 영향을 주는 유력한 후보로서 제시하였다. 이 후 추가 연구를 통해 VGF 유래 펩타이드 중 AQEE-30이 조골세포 증식능과 골형성능이 가장 강함을 관찰하였다 (unpublished data).
따라서 본 연구에서는 K562 세포에서 VGF 의 전사를 조절하는 기전을 연구함 으로써 VGF의 발현 제어에 이용하고자 하였다. K562 세포는 chronic myelogenous leukemia 환자에게서 유래 됐으며, pluripotent hematopoietic progenitor cell로 적혈구, 과립구, 단핵구, 거핵세포 등으로 분화가 가능하며 (34), phorbol 12-myristate 13-
acetate (PMA) 처리시 거핵세포로 분화된다고 알려져 있다 (35, 36). 현재까지 VGF
expression을 in vitro상에서 upregulation하는 mechanism으로 앞서 언급된 NGF 뿐 만 아니라 human neuroblastoma cell line인 SH-SY5Y 세포 내에서 retinoic acid (RA), 1,25-dihydroxyvitamin D3(vitamin D) (37), clioquinol (38), neuronal PAS domain protein 3
(NPAS3) (39)가 있고, 반대로 neuron-restrictive silencer factor (NRSF) (40), thyroid hormone T3 (3, 41).에 의해 in vivo에서 downregulation한다고 보고된 바 있다 대 표적인 전사인자로는 cAMP response element binding protein (CREB)이 잘 알려져 있 고 (42, 43) 이외에 PC12 세포에서 neuro-specific C complex 인 bHLH (MASH1), p300, CREB, CCAAT binding factor에 의해 (44), 그리고 SH-SY5Y세포에서 c-Fos,
c-Jun 등이 VGF 발현을 조절한다고 알려져 있지만 K562 세포 내에서 VGF 조
절은 연구가 되어 있지 않다. 따라서 이번 연구를 통해 K562 세포 내에서 VGF 발현을 전사수준에서 조절하는 새로운 기전을 연구하고자 했다.
재료 및 연구방법
재료
세포 배양에 사용한 RPMI1640 (31800-014)와 fetal bovine serum (FBS) (16000-044) 은 Gibco (Grand island, NY, USA), 에서 구입하였고, 100X antibiotics (penicillin / streptomycin)은 Hyclone (South Logan, Utah, USA) 에서 구입하였다. Promoter construct 제작 시 사용한 제한효소 KpnI, XhoI은 Bioneer (Seoul, Korea)에서 구입하 였고, T4 ligase (M0202S)는 NEB (Beverly, MA, USA), Prime STAR HS DNA polymerase (R044A) 는 Takara (shuzo, Japan)에서 각각 구입하였다. Transfection 시 사용한 lipofectamine2000 (11668-019)은 Invitrogen (Grand island, NY, USA)에서 구입하였고, Opti-MEM (22600-043)은 Gibco (Grand island, NY)에서 구입하였다. Luciferase reporter assay시 사용한 luciferin (E-1602)은 Promega (Madison, WI, USA)에서 구입하 였다. NF-κB activator로 사용한 TNFα (410-MT-010)는 R&D systems (Minneapolis, USA)에서 구입하였다. RNA preparation시 사용한 trizol (2302700)은 5prime (Gaithersburg, USA)에서 구입하였고, reverse transcription을 통해 cDNA 합성 시에 사용한 M-MLV reverse transcriptase (M170A), oligodT (C110A), RNAsin (N251B), dNTP (U151B), M-MLV RT 5X buffer (M531A) 는 Promega (Madison, WI) 에서 구입하였다.
Quantitative real time PCR시에 사용한 LightCycler 480 DNA SYBR Green I Master는 Roche (Switzerland) 에서 구입하였다.
세포배양
K562 cell (human chronic myelogenous leukemia)은 10%(v/v) FBS와 0.2X antibiotics (penicillin/streptomycin) 포함한 Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 배지를 사용했고, 37℃, 5% CO2 에서 배양했다.
Construct 제작
Luciferase reporter assay를 진행하기 위해 promoter construct를 제작하였다. Human
genomic DNA를 template로 사용하였고, VGF mRNA가 시작되는 염기를 +1로 기준
하여 (-775/+241) 부분의 각 5’ 및 3’ 말단에 KpnI, XhoI site를 첨가한 뒤, Prime STAR HS DNA polymerase를 사용해 polymerase chain reaction (PCR)로 증폭시켰다.
pGL4.21 vector와 PCR product는 KpnI, XhoI 로 각각 20시간 동안 37℃에서 반응시 켜 cutting하였으며, T4 ligase를 이용하여 vector와 PCR product를 16℃에서
overnight으로 ligation하였다. 그 후, 열 충격을 이용하여 형질전환을 한 뒤, 100
㎍/㎖ ampicillin이 포함된 lysogeny broth (LB) Agar에서 colony를 선별하였고, DNA sequencing 통해 올바르게 PCR product가 vector에 들어갔는지 확인하였다. 같은 방법으로 serial deletion promoter와 point mutant promoter (Ets mutant)를 제작하기 위 해 Table 1에 정리된 cloning primer를 이용하였다.
Promoter 분석
humanVGF promoter (-775/+241) 내 transcription putative binding site는 Genomatix (http://WWW.Genomatix.de/)의 web program을 이용하여 promoter 분석하였다. core >
0.9, matrix > 0.9 이상을 기준으로 대표적인 실험에 이용된 전사인자만 표시했다
(Figure 1A).
Luciferase reporter assay
Promoter activity측정을 위하여 luciferase reporter assay를 하였다. 배지에 K562 cell 을 resuspension하여 3X105 cell/well (90% confluency)로 24well plate에 plating 하였다.
Transfection은 lipofectamine2000 reagent를 well당 2㎕에 Opti-MEM medium으로 총
50㎕로 맞춘 후 5분 동안 상온에서 incubation 한 후 DNA mixture에 넣어 잘 섞어
20분 동안 상온에서 incubation하였다. DNA 조합은 promoter construct (100ng)와 expression vector (200ng)를 Opti-MEM medium 50㎕에 넣었다. Transfection 18시간 후 cell을 모아 PBS washing 1회 후 lysis buffer 150㎕에 cell lysis하였다. Luciferase activity 측정은 cell lysate 10 ㎕와 luciferin solution 50 ㎕을 반응시켜 1초 동안 값 을 Berthold (Oak Ridge, USA)사의 luminometer centro LB 960을 이용하여 측정하였 다.
cDNA synthesis 및Quantitative real time PCR
Total RNA는 harvest한 cell에서 trizol reagent를 이용하여 분리하였고, 분리한 RNA 는 Diethyl pyrocarbonate (DEPC) water에 녹여 -20℃에 보관하였다. cDNA의 합성은 total RNA를 정량하여 1μg을 reverse transcription (RT) 하였다. RT시 oligodT를 primer로 사용하였으며, M-MLV reverse transcriptase를 이용하여 합성하였다.
Quantitative real time PCR (qRT-PCR)은 cDNA와 LightCycler 480 DNA SYBR Green I Master, primer를 혼합하여 총 10 ㎕ volume으로 reaction시켰다. 유전자 발현 정량 분석은 Roche light cycler 480 system (Roche, Switzerland) 기기를 사용하였고, 사용한 primer의 sequence는 Table 2에 표기하였다. Relative gene expression분석은 control gene human RPS29의 Ct값을 기준으로 target gene에 대해 2-ΔΔCT 방법으로 구했다.
통계 분석
각 실험의 측정값은 평균값 ± 표준오차로 표기하였으며, t-test 또는 일원배치 분산분석 이용하여 통계처리 하였다.
Table 1. Primers used in cloning of promoter constructs.
Name Restrction enzyme Sequence
hVGF (-775/+241)
For KpnI 5’- CGG GGT ACC CAG TCA GGG GAC AGA AG-3’
RevXhoI 5’-TAC TCC GCT GTT CGT CCT CGA GCG G -3’
hVGF (-648/+241)
For KpnI 5’-CGG GGT ACC GGG ATT ACC AAA ACC GCA A-3 RevXhoI 5’-TAC TCC GCT GTT CGT CCT CGA GCG G -3’
hVGF (-438/+241)
For KpnI 5’-CGG GGT ACC CCC ACT GGT GCC CAG-3’
RevXhoI 5’-TAC TCC GCT GTT CGT CCT CGA GCG G -3’
hVGF (-59/+241)
For KpnI 5’-CGG GGT ACC TTG ACG TCA ATG GGG C-3 RevXhoI 5’-TAC TCC GCT GTT CGT CCT CGA GCG G -3’
hVGF (-775/+241)
ETS mt1
For 5’-TCG TCG GGC GTC CTT AAT CCT CCG G-3’
Rev 5’-CCG GAG GAT TAA GGA CGC CGC CCG ACG ATT-3’
hVGF (-775/+241)
ETS mt2
For 5’-GCG GCC GCC CGC TTA ACC ATG AAT-3’
Rev 5’-CAT TCA TGG TTA AGC GGG CGG CCG C-3’
Table 2. Primers used in qPCR
Name Sequence
hRPS29 For : 5' - TCG CTC TTG TCG TGT CTG TTC AA - 3'
h/m/rCREB
Rev : 5' - AAA CCG ATA TCC TTC GCG TAC TG - 3' For : 5' - GGAGTGCCAAGGATTGAAGA- 3' Rev : 5' - CTGTCCACTGCTAGTTTGGTAA- 3'
hVGF For : 5' - TCG GAA ACC GGA AAA AGC A - 3'
Rev : 5' - GGG TAT TTA CAA CAG AGA AAG GAA AGA AG - 3' hELF-1 For : 5' - AGA CTC ACC GGG AGC CTC AT - 3'
Rev : 5' - TGG TCG TGG TGG TTT AGT TTT TC - 3' hp65 For : 5' - ACC TGG AGC AGG CTA TCA GTC A - 3'
hIL-8
hA20
Rev : 5' - TAG TCC CCA CGC TGC TCT TC - 3' For : 5' - GCT CTC TTG GCA GCC TTC CTG A- 3' Rev : 5' - ACA ATA ATT TCT GTG TTG GCG C- 3' For : 5' - CCT TGC TTT GAG TCA GGC TGT- 3' Rev : 5' - TAA GGA GAA GCA CGA AAC ATC GA- 3'
결 과
K562 cell 내에서 VGF expression을 조절하는 Transcription Factor선별.
VGF 발현을 조절하는 전사인자를 찾기 위해 먼저 Genomatix web program (http://www.Genomatix.de/)을 이용하여 human VGF promoter (-775/+241)를 분석하였 다. TF score값이 core > 0.9, matrix > 0.9이상 기준으로, hVGF promoter 내에 CREB, E74 like factor1 (ELF-1), CCAAT/enhancer-binding protein beta (CEBP β), Myc-associated zinc finger protein (MAZ), Neurogenic differentiation 1 (NeuroD), Early growth response protein 1 (EGR-1), paired box protein pax-6 (Pax6), Serum response factor (SRF), Peroxisome proliferator-activated receptor gamma (PPARγ), Hepatocyte nuclear factor 4 alpha (HNF4α), Specificity protein (SP1), Signal transducer and activator of transcription 3 (STAT3)등 다양한 putative transcription factors가 존재 하는 것을 확인했다 (Figure 1A).
Genomatix web program을 통해 얻어낸 전사인자의 후보들을 대상으로 실제
hVGF promoter (-775/+241) 내에서 활성을 조절하는지 전사인자 스크리닝을 K562
cell에서 진행하였다. K562 세포에 lipofectamine2000을 이용하여 각 전사인자와
hVGF promoter (-775/+241), CMV β-gal을 transfection 하였고, 18시간 후 lysis buffer 를 이용하여 lysis 하여 lysate는 luciferase reporter assay와 β-galactosidase assay에 이 용 하였다. Reporter assay 실험 결과 β-galactosidase normalization 전의 경우, hVGF (-775/+241) promoter activity를 증가시킨다고 알려진 CREB에 의해 hVGF (- 775/+241) promoter luciferase activity가 올라간 것이 확인이 되었고, 그 외에 ELF-1, NF-κB subunit인 p65, EGR-1에 의해 hVGF promoter luc activity 가 유의성 있게 증 가했으며, SRF, PPARγ, HNF4α, STAT3에 의해서는 hVGF promoter luc activity가 유의 성 있게 감소하였다. 한편, β-galactosidase normalization 후 여전히 CREB, ELF-1, p65에 의해서 hVGF promoter luc activity가 유의성 있게 증가하고, PPARγ, HNF4α,
STAT3에 의해서 hVGF promoter luc activity가 유의성 있게 감소했지만,
normalization 전 hVGF promoter luc activity가 감소하던 EGR1의 경우
normalization 후 증가 효과가 사라졌으며, Pax6와 SRF는 유의성 있게 증가하는
normalization 전과 다른 효과를 보였다. (Figure 1B).
Figure 1. Effects of putative transcription factors on the activity of hVGF promoter (-775/+241) in myelogenous leukemia cell line K562.
(A) Schematic diagram of putative transcription factor binding sites in human VGF promoter (-775/+241). -775/+241 region of hVGF gene was analyzed by Genomatix program (core > 0.9 and; matrix >0.9) (B) K562 cells were cotransfected with hVGF
promoter (-775/+241), β-galactosidase expression vector and expression vectors for the described transcription factors and lysed after 18 hr transfection. Luciferase activities were measured and are shown as a relative fold compared with empty vector (mock). To normalize for transfection efficiency, data are expressed as relative fold per β-galactosidase activity (B-bottom). The data shown are means ± SE from three independent experiments performed in duplicate. *, p < 0.05, **, p < 0.01 and ***, p < 0.001 by Student's unpaired two-tailed t-test (vs mock).
ETS binding site 6을 통한 ELF-1의 hVGF 전사 활성 조절.
앞서 hVGF promoter (-775/+241) 활성을 조절한 전사인자 ELF-1이 K562 세포에
서 VGF mRNA level을 증가시키는지 확인하기 위해 K562세포 내에서 ELF-1을 과
발현 시켜 얻어낸 total RNA 이용하여 qRT-PCR 분석을 진행 하였다. 그 결과, K562 세포 내에서 ELF-1의 과발현 되는 것을 확인했고 (Figure 2A-right), ELF-1에 의해 hVGF mRNA level 이 유의성 있게 증가하였다 (Figure 2A-left). hVGF mRNA 발현에 있어서 ELF-1이 영향을 주는 것을 확인 할 수 있다 (Figure 2A). ELF-1은 Ets family에 속하며 ETS core motif 5' - GGAA - 3' 가지므로 (45-48), hVGF promoter (- 775/+241) 상의 ELF-1의 활성조절 부위를 찾기 위해 ETS core motif를 포함한 Ets binding site를 표시 하였다 (Figure 2B-top). 7개의 ETS binding site를 기준으로 hVGF (-648/+241), (-438/+241), (-59/+241) 3개의 deletion promoter를 추가 제작하여 reporter assay를 진행 하였다. 그 결과 hVGF promoter (-775/+241), (-648/+241)에서 ELF-1에 의해 유의성 있게 증가한 hVGF promoter activity가 (-59/+241)에서 effect 가 사라지 는 것을 확인 할 수 있었다. 따라서 hVGF promoter (-438/-59)에 존재하는 ETS를 통해서 ELF-1이 promoter 활성 조절하는 것으로 생각되었다 (Figure 2B-bottom).
hVGF promoter -438과 -59사이에는 ETS binding site가 2군데 (-106/-86) 와 (-82/-62) 가 있다. ETS mutant promoter 5 (ETS5 mt)는 앞쪽(-106/-86) (+) strand sequence TTCC 에서 TTAA로 point mutation했고, ETS mutant promoter 6 (ETS6 mt)의 경우 뒤쪽(-82/- 62) (+) strand sequence TTCC에서 TTAA로 point mutation 시켰다 (Figure 2C-top).
ELF-1의 hVGF promoter 내에 존재하는 binding site를 찾기 위해 point mutant promoters을 대상으로 reporter assay를 진행하였다. 그 결과, wild type (WT)과 ETS5 mt promoter에서 ELF-1에 의해 유의성 있게 증가하던 hVGF promoter activity effect
가 ETS6 mt에서 사라지는 것을 확인 할 수 있었다 (Figure 2C-bottom). 이러한
data를 바탕으로 ELF-1은 hVGF promoter (-82/-62)에 존재하는 ETS binding site를 통 해 VGF 전사 조절을 하는 것을 알 수 있었다.
Figure 2. Increase of hVGF transcript level by ELF-1-mediated transactivation through ETS binding site (-82/-62) of hVGF promoter.
(A) K562 cells were transfected with transcription factor CREB or ELF-1 (2㎍), incubated for 24 hrs, and then lysed for RNA preparation. Quantification of hVGF transcripts was performed by qRT-PCR. The data shown are means ± SE from three to eight independent experiments. (B) Schematic diagram of hVGF deletion promoters (top) and the effects of ELF-1 on the transactivation of deletion promoters (bottom). (C) Schematic diagram of hVGF Ets mutant promoters (top) and the effects of ELF-1 on the transactivation of Ets mutant promoters (bottom). The data of reporter assays are means ± SE from three independent experiments performed in duplicate. *, p< 0.05, and **, p< 0.01 by Student's unpaired two-tailed ttest. WT, wild type promoter; Ets mt, Ets mutant promoter.
NF-κB에 의한 hVGF promoter (-775/+241) 활성 조절.
앞서 K562 세포 내에서 p65 과발현시 hVGF promoter (-775/+241) 활성을 조절하는 것을 확인했다 (Figure 1B). 실제 이들의 전사인자들에 의해 hVGF
mRNA 수준에서도 조절하는지 확인하기 위해, K562 세포에서 p65 를 과발현
시켜 qRT-PCR 통해 hVGF mRNA level을 확인하였다. 하지만, p65는 reporter assay 결과와 다르게 K562 세포 내에서 p65 과발현 확인이 되었고, NF-κB target gene이라고 알려진 Interleukin8 (IL-8)과 Tumor necrosis factor, alpha-induced protein 3
(TNFAIP3 or A20)이 p65 과발현시 mRNA 가 증가 하였음에도 불구하고 hVGF
발현을 조절하지 못한 결과를 얻었다 (Figure 3A). 전사인자 과발현을 통해
얻어진 reporter assay 결과가 다른 접근 방법으로 compound 를 이용한 실험에서도
동일 결과가 나오는지 알아보기 위해 추가실험을 진행 하였다. NF-κB activator로 알려진 (49-51) TNFα compound 를 세포에 처리하여 activation 된 p65 에 의해 hVGF promoter (-775/+241) activity 가 조절 받는지 확인하였다. K562 세포에 NF- κB-Luc 또는 hVGF(-775/+241)-Luc (200ng) transfection 하여 18 시간 incubation 후 TNFα 를 농도별로 (0, 0.1, 1, 10, 50 ng/㎖) 6 시간 동안 처리한 후 lysis 하였다.
Reporter assay 실험 결과 TNFα control 인 NF-κB luc activity 가 dose dependent 증가했고, 동시에 hVGF (-775/+241) promoter activity 또한 TNFα dose dependent 하게 증가하는 결과를 얻을 수 있었다 (Figure 3B). 다음으로 TNFα 처리시 hVGF promoter (-775/+241) luc activity 증가가 실제 VGF mRNA 또한 조절하는지 알아보기 위해 K562세포를 18시간 serum starvation 후 TNFα를 농도별로 (0, 0.1, 1, 10, 50 ng/㎖) 8 시간 동안 처리한 후 RNA preparation 하여 QPCR 통해 hVGF mRNA level 을 확인 하였다. 먼저 TNFα 에 의해 NF-κB target gene 인 IL-8 과 A20 의 mRNA level 이 dose dependent 증가 하였지만, 예상한 바와 다르게 VGF mRNA level은 dose dependent 감소하였다 (Figure 3C).
Figure 3. Effects of NF-κB on the transcription of hVGF .
(A) K562 cells were transiently transfected with p65 expression vector (2㎍). After 24 hr incubation, hVGF transcript levels were determined by qRT-PCR. The data shown are means
± SE from three independent experiments. (B) K562 cells were transiently transfected with
hVGF (-775/+241) –Luc or NF-κB -Luc. After 18hr transfection, K562 cells were treated with various TNFαconcentration for 6hr. The data are means ± SE from three independent experiments performed in duplicate. (C) K562 cells were serum starved for 18hr.
After starvation, the cells were treated with various TNFα concentration for 8hr and then, hVGF, hIL-8 and hA20 transcript levels were determined by qRT-PCR. *, p< 0.05, **, p<
0.01 and ***, p< 0.001 by Student's unpaired two-tailedttest.
고 찰
K562 세포 내에서 prohormone VGF 발현을 조절하는 새로운 전사인자를 찾기 위해 연구가 진행이 되었다. PC12 세포에서 VGF 발현을 증가시킨다고 알려진 CREB binding site인 cyclic AMP (cAMP) response element (CRE)가 있으며 (52, 53), VGF promoter proximal region 을 포함하는 human VGF promoter -775 에서 +241 nucleotide 에 해당하는 부분을 cloning 하여 VGF promoter 활성을 조절하는 전사인자 스크리닝을 reporter assay 로 진행하였다. β-galactosidase activity
normalization 전, 후 동일한 방향성을 가지며 promoter 활성을 유의성 있게
증가시킨 전사인자로 CREB, ELF-1, p65가 있었고, 감소시킨 전사인자로는 PPARγ, HNF4α, STAT3 가 있었다 (Figure1B). 그 후, 먼저 VGF promoter 활성을
upregulation 한 전사인자들이 실제 K562 세포 내에서 또한 VGF mRNA level
upregulation 에 관여하는지 알아보기 위해 전사인자를 과발현 시켜 qPCR 로 확인
하였다. 이 중 CREB 과 ELF-1 이 VGF mRNA level 을 증가 시키는 것을 알 수 있었다 (Figure 2A). ELF-1은 E26 transformation-specific family (ETS family)에 속하며,
ETS family 는 20 개 이상의 멤버들로 구성되어 있다. 각각의 멤버들은 ETS
domain 을 가지고 있으며 이 domain 은 GGAA/T core motif 를 포함하는 DNA sequence 를 인식한다 (54). hVGF promoter (-775/+241) 사이에 matrix>0.9, core>0.9 기준으로 7개의 ETS binding site가 존재 하는 것을 genomatix program을 통해 알 수 있었고, 이 중 hVGF promoter -82 에서 -62 사이에 있는 ETS binding site 6 을 통해서 VGF mRNA level 을 조절하는 것을 알 수 있었다 (Figure 2B,C). hVGF promoter 내에 많은 ETS binding site 가 존재 했지만 실제 VGF 발현을 조절하는 ETS binding site는 ETS 6 (hVGF -82/-62)이었다. 나머지 ETS binding site들은 ETS core motif (GGAA)를 가지고 있지만 GGAA를 제외한 나머지 주변부 sequence 가 다르고, 다른 전사인자들의 binding site 들도 overlapping 되어있어 ELF-1 이 아닌 다른 전사인자들에 의해 먼저 전사조절에 관여할 것으로 생각이 되어 진다.
ETS family 는 세포 분화, 세포 주기 조절, 세포 이동, 세포 증식, 세포 사멸,
혈관 생성 등의 기능 조절에 관련이 있다 (55-57). ETS family 멤버 중 PU.1, Spi-B, Ets-1, MEF, ELF-1들은 hematopoietic system내에서 발현을 한다고 알려 졌으며 (58,
59), 다양한 hematopoietic lineage 의 development 와 maintenance 에 대해 중요한 역할을 한다고 보고되었다 (54).
본문에서 NF-κB 의 subunit 중 p65 가 VGF 발현 조절에 관여하는지 알아보기
위해 hVGF promoter (-775/+241)에서 p65 를 각각 과발현 시켜 확인하였다.
분명하게 promoter activity 가 증가하는 것을 확인할 수 있었지만 mRNA
level에서는 p65에 의해 VGF mRNA가 조절 받지 못했다 (Figure 3A). 이 결과를 한번 더 검증하기 위해 p65 의 과발현이 아닌 NF-κB activator 인 TNFα 를 사용하여 동일 hVGF (-775/+241) promoter 에 대해 reporter assay 를 진행하였다.
과발현 결과 (Figure 1B)와 동일하게 TNFα 처리시 hVGF (-775/+241) promoter activity 를 dosedependent 하게 증가시켰다 (Figure 3B). 이러한 결과는 hVGF promoter 일부분인 (-775/+241) 내에 존재하는 NF-κB binding site 에 의해서는 hVGF promoter activity가 증가하지만, 전체 chromosome 상에서 hVGF promoter (- 775/+241)외에 존재하는 NF-κB binding site 가 inhibition 할 경우 최종적으로 결과는 합이 0 이 되어 이러한 결과가 나온 것으로 생각되어진다. 반대로, TNFα에 의해서는 VGF mRNA level이 dosedependent 감소하는것을 확인 하였다 (Figure 3C). TNFα는 일반적으로 NF- κB signaling pathway 를 활성화 시키는 것으로 잘 알려져 있으며, 이외에도 MAP kinases (JNK, p38), Akt signaling
pathway 를 활성화 시킨다고 알려져 있다 (60-62). 하지만 한 보고서에 따르면,
TNF-a 에 의해 이러한 signaling pathway 가 activation 되지만 RAR 활성 유지에 중요한 cAMP-PKA pathway 가 TNFa 에 의해 감소되어 target gene 조절되는 것이 보고된바 있다 (63). TNFa 에 의한 VGF mRNA level 감소는 retinoic acid (RA)의 조절 받는 VGF가 TNFa 처리시 c-AMP-PKA signaling pathway가 inhibition되었기 때문에 그 결과, VGF mRNA level 이 감소된 것으로 생각된다. 따라서, VGF
expression 을 조절하는데 NF-κB 가 관여하는지 알아보기 위해 NF-κB
inhibitor 를 이용하여 VGF mRNA level 을 조절하는지 확인하는 추가실험이
필요하다.
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영문요약
VGF (unrelated to VEGF) was initially identified as a NGF-induced transcript in rat PC12 pheochromocytoma cell and also known as various names including VGF8a, NGF33.1, and a2. VGF is dominantly expressed in the brainand endocrine tissues and involved in the regulation of glucose homeostasis, lipolysis and energy expenditure.
Meanwhile, it is recently suggested that VGF has a positive effect on bone formation via cAMP dependent pathway. This osteogenic activity of VGF was found in the conditioned media of K562 cells during the PMA-induced differentiation into megakaryocytes.
Previously we also demonstrated that VGF transcript level is gradually increased in the early to mid phase of differentiation of K562 cells. In this study, thus, , we investigated the transcriptional regulation of VGF expression in K562 cells. First, putative transcription factors of VGF promoter were selected by in silico analysis of -775/+241 region of human VGF promoter using Genomatix program. Among many transcription factors tested for transactivation, ELF-1, and p65 were shown to have stimulatory activities for hVGF - 775/+241 promoter. Meanwhile hVGF transcript levels were also increased by ELF-1 overexpression, but not by the overexpression of p65. Then it was demonstrated that ELF-1 transactivates the hVGF promoter through the ETS binding sequence between -82 and -62 nucleotide by using hVGF serial deletion promoters and point mutant promoters.. Taken together, these results suggest that ELF-1 could regulate the expression of VGF during the differentiation of K562 cells into megakaryocytes and be a target for manipulating VGF expression.
