ВЫЯВЛЕНИЕ МУТАЦИЙ В ГЕНЕ BRCA1 У БОЛЬНЫХ РАКОМ МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ МЕТОДОМ СЕКВЕНИРОВАНИЯ
А.П. Кравченко, студентка 4 курса ЕНУ им. Л.Н Гумилева, г.Астана
Научный руководитель: к. м. н А. Р. Акильжанова [email protected]
Несмотря на существование множества эффективных способов распознавания патологии молочной железы, возникает необходимость более раннего исследования на основе всех технологий диагностического процесса [1]. Наследуемые мутации в генах BRCA1 и BRCA2 существенно повышают риск развития рака у их носителей и обусловливают так называемые семейные формы рака молочной железы и яичника, когда в одной родословной обнаруживаются множественные случаи рака данной локализации [2]. Приблизительно 10% всех случаев рака молочной железы связаны с наследуемыми мутациями в генах BRCA1 и BRCA2 [3].
В мире интенсивно изучается спектр мутаций в генах BRCA-семейства, который сильно разнится между отдельными популяциями. Знание спектров мутаций, характерных для страны или региона, позволяет с помощью ДНК-диагностики выявлять группы риска развития заболевания [4]. В России сведения о мутациях BRCA-генов сравнительно скудны, однако немногочисленные публикации позволяют рассматривать мутацию в гене BRCA1 5382insC как преобладающую в Российской популяции [1,2]. В Казахстане ДНК- диагностика находится на стадии развития и совершенствования. В данной работе описываются методы ДНК-диагностики и результаты поиска мутаций в гене BRCA1 у женщин Казахстана больных раком молочной железы.
Целью работы является освоение методики выявления мутаций в гене BRCA 1 у больных раком молочной железы методом секвенирования для дальнейшего внедрения современных методов комплексной оценки генетических факторов в клиническую практику Казахстана.
Научная новизна и практическая ценность. В настоящее время в Казахстане не проводится диагностика предрасположенности к раку молочной железы. Практическая ценность работы заключается в необходимости выявления предрасположенности к раку молочной железы, как и других заболеваний, на ранней стадии развития, а обнаружение взаимосвязи между риском рака груди и генами BRCA1 и BRCA2 приведет к новым методам снижения риска, выявления и лечения рака груди у таких больных.
Материалы исследования: Исследования по выявлению мутаций в гене BRCA1 методом секвенирования были проведены на 10 образцах ДНК женщин с раком молочной железы, выделенных из лейкоцитов крови и 5 образцах ДНК здоровых людей для контрольной группы, выделенных из букальных клеток. Кровь и букальные клетки были получены у пациентов Онкологического Центра г.Астаны с их информированного согласия.
Методы исследования:
выделение ДНК из лейкоцитов крови и букальных клеток
электрофоретический и спектрофотометрический анализ
амплификация отдельных фрагментов гена BRCA1(ПЦР)
очистка ПЦР-продуктов путем осаждения ДНК спирт-ацетатной смесью
сиквенс-ПЦР, секвенирование фрагментов ДНК
Результаты и обсуждение: Изображение геля показывает высокую концентрацию ДНК в 10 исследуемых пробах крови (Рис.1). Это говорит о том, что выделение ДНК из крови было проведено методически правильно, и образцы готовы для постановки ПЦР.
Электрофоретический анализ ДНК на 10 проб крови.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Рисунок 1
Концентрацию 5 образцов ДНК из букальных клеток для контрольной группы измеряли с помощью прибора Nano Drop1000 (рис.2), так как концентрация ДНК, выделенной из букальных клеток, низкая и с помощью электрофоретического анализа наличие или отсутствие ДНК в супернатанте зафиксировать трудно.
Спектрофотометрический анализ
Рисунок 2
В данном исследовании изучали 2 и 20 экзоны гена BRCA1, так как в данных генах часто встречаются мутации «founder mutation», во втором экзоне 185delAG мутация, в двадцатом экзоне 5382insC.
Электрофоретический анализ на наличие ампликонов в 10 образцах ДНК 20 экзона гена BRCA1 после ПЦР (1,5 % агарозный гель, напряжение 120 V,время 25 мин)
Рисунок 3 М – маркер молекулярного веса от 2000 до 100 п.н К+ положительный контроль
К- отрицательный контроль
После очистки сиквенс-ПЦР-продуктов расшифровку нуклеотидной последовательности интересующих нас экзонов исследуемого гена проводили в секвенаторе 3730xI DNA Analyzer, на котором заранее задается программа секвенирования. Время секвенирования 40 минут, после чего данные анализируются с помощью пакета программ Seq Analysis 5.3.1 Applied Biosystems.
Обнаруженные мутации во 2 и 20 экзонах BRCA1 исследуемой и контрольной группах.
М 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 К+ К-
BRCA1 Мутации Замена
аминокислоты Больные раком молочной железы (10 человек)
Контрольная группа (5 человек) Кол-во % Кол-во %
2 экзон 95g>T Glu32Val 9 90 5 100
170t>К Leu57Met 1 10 0 0
110a>C Asp37Thr 1 10 0 0
117g>A Lys39Arg 1 10 0 0
88g>A Ala30Asp 1 10 0 0
91c>G Leu31Val 1 10 0 0
20 экзон 5397a>G - 1 10
Номенклатура мутаций согласно обозначению в GenBank референсной последовательности гена BRCA1, номер U14680(BRCA1).
В результате наших исследований мы обнаружили 9 гомозиготных полиморфизмов ДНК, все они представлены заменой оснований (95g>T, 5397a>G, 170t>K и т.д), функциональные исследования данных полиморфизмов не проводились и в базе данных Breast Cancer Information Core (BIC) не значимы.
Идентификация мутаций важна не столько для заболевших раком пробандов, сколько для их родственников, у которых еще не возникли или не диагностированы опухоли.
Внимательное отношение к состоянию молочной железы у родственниц пробандов с мутациями позволяет намного раньше выявить и удалить опухоль, что нередко спасает им жизнь [6].
Выводы
1) Проведен информационный анализ известных генетических маркеров BRCA1 (точечных нуклеотидных полиморфизмов) предрасположенности к раку молочной железы.
2) Освоены методики выделения ДНК из крови и букальных клеток, генотипирования мутаций на основе ДНК секвенирования.
3) Изучено 10 женщин больных раком молочной железы на наличие мутаций «founder mutation» во втором экзоне 185delAG мутация и в двадцатом экзоне 5382insC мутация, данные мутации обнаружены не были.
Список литературы:
1. Карпухин А.В., Поспехова Н.И., Любченко Л.Н., Логинова А.Н., Хомич Е.В., Будилов А.В., Сергеев А.С., Захарьев В.М., Гарькавцева Р.Ф., Гинтер Е.К. Частоты однонуклеотидных полиморфизмов и мутаций в гене BRCA1 при наследственно обусловленном раке молочной железы и яичников// Доклады Академии наук. - 2002. - Т.
383. N 12. - С.706-709
2. Online Mendelian Inheritance in Man. 113705*. Breast Cancer, Type 1; BRCA1
3. Bell G.I., Karam J.H., Rutter W.J. Polymorphic DNA region adjacent to the 5' end of the human insulin gene // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 1981. - V.78. - P.5759-5763.
4. Gayther S.A., Harrington P., Russell P., Kharkevich G., Garkavtseva R.F., Ponder B.A.
Frequently occurring germ-line mutations of the BRCA1 gene in ovarian cancer families from Russia // Am. J. Hum. Genet. - 1997. - V. 60. N 5. - P.1239-1242.
5. Piccart M.J., Awada A., Hamilton A. Integration of new therapies into management of metastatic breast cancer// ASCO 1999 Educational book.Atlanta.1999.P.526539.
6. Reddy V.B., Thimmappaya B., Dhar R., Subramanian K.N., Zain B.S., Pan J., Ghosh P.K., Celma M.L., Weissman S.M. The genome of simian virus 40. (1978) Science, 200(4341), 494- 502.
