РОЛЬ ОКИСЛИТЕЛЬНОГО ПОВРЕЖДЕНИЯ ДНК И КЛЮЧЕВЫХ ФЕРМЕНТОВ РЕПАРАЦИИ ДНК В АПОПТОЗЕ АЛЕЙРОНОВОГО СЛОЯ ЗЕРНА
ПШЕНИЦЫ
Смайлов Б.Б., Алтыбаева Н.А., Бисенбаев А.К.
ДГП «Научно-исследовательский институт проблем биологии и биотехнологии»
КазНУ им. аль-Фараби, Алматы, Казахстан
Во время прорастания алейроновые слои зерна пшеницы синтезируют и секретируют ряд гидролитических ферментов (включая α - амилазу). Индукция синтеза этих гидролаз зависит от присутствия в ткани гибберелловой кислоты (ГК). Гиббереллин - зависимый синтез этих гидролаз тормозится природным антагонистом этого фитогормона - абсцизовой кислотой (АБК) [1]. На последующих стадиях онтогенеза клетки алейронового слоя зерна элиминируются. Предполагается, что гибель алейроновых клеток программирована, т.е. генетически детерминирована (апоптоз) [2,3].
Ранее нами выявлены и описаны морфо-биохимические признаки ПГК эндосперма и алейронового слоя зерна пшеницы [4, 5]. Установлена важная роль активных форм кислорода (АФК), таких как супероксид (.О), пероксид водорода (Н2О2), и антиоксидантных ферментных систем (супероксиддисмутаза, аскорбатпероксидаза, каталаза и др.) в механизме реализации ПГК алейронового слоя зерна пшеницы [6].
Известно, что основные радикалы, образующиеся в клетках - это радикалы кислорода (супероксид, пероксид водорода и гидроксильный радикал), монооксид азота, радикалы ненасыщенных жирных кислот, радикалы, образующиеся в процессе энергетического окислительного метаболизма [7]. В последнее время все больше свидетельств накапливается в пользу следующей парадигмы, что в основе апоптоза клеток может, лежат повреждение наследственного вещества (ДНК) свободными радикалами кислорода.
Показано, что один из основных факторов, ведущих к повреждениям ДНК и мутациям – это окислительный стресс [8]. Кислородсодержащие радикалы (супероксид, пероксид водорода, радикал гидроксида) которые образуются при окислительном стрессе, индуцируют разнообразные повреждения ДНК (oxoG, 8–оксиаденин, формамидопиримидин, тиминовые гликоли и т.п.). Устраняются такие повреждения с помощью нескольких путей репарации. Одним из ключевых и самым универсальным путем репарации повреждении отдельных нуклеотидов является эксцизионная репарация оснований, которая инициируется совместным действием ДНК – N – гликозилаз и АР – эндонуклеаз [9 ].
Можно предположить, что ГК зависимая генерация радикалов кислорода может привести к разнообразным повреждениям ДНК характерным для окислительного стресса (oxoG, 8–оксиаденин, формамидопиримидин, тиминовые гликоли и т.п).
Целью представленной работы являлось изучение особенности экспрессии, физико- химических характеристик ДНК - N – гликозилаз алейронового слоя зерна пшеницы специфичных к окислительным повреждениям ДНК.
АП эндонуклеазы так же как и ДНК– N – гликозилазы/АП лиазы вызывают одноцепочечные разрывы вблизи поврежденного основания двухцепочечной ДНК.
Одноцепочечные разрывы в составе суперспирализованной ДНК превращает ее в открытую циклическую или линейную форму, которую можно выявить с помощью электрофореза в агарозном геле. Данный подход был использован для выявления активности АР - эндонуклеаз и ДНК – N – гликозилаз на обработанных KMnO4 и формиловой кислотой суперспирализованной ДНК (плазмида Bluescript - Alk).
Присутствие ГК в дозе 1мкМ в инкубационной среде существенно увеличил активность Ca2+-зависимой АП - эндонуклеазы. При этом наблюдалась слабая активация Mg2+ зависимой АП – эндонуклеазы. Присутствие ионов Mg2+ и Ca2+ приводило к ГК зависимому увеличению активности АП - эндонуклеазы. При этом ЭДТА и ЭГТА в дозах 10мМ полностью тормозил активность этих ферментов. Установлен гормональный характер регуляции активности этих ферментов. Показано, что под действием ГК в
клетках алейронового слоя зерна пшеницы происходит существенное активация Ca2+
зависимой АП – эндонуклеазы специфичной к апуриновым и апиримидиновым сайтам плазмиды. Действие абсцизовой кислоты на активность этих ферментов имела противоположный характер. Внесение в среду инкубации АБК (5мкМ) значительно снижало ГК зависимую активацию АП – эндонуклеаз.
Эти данные указывают на то, что ГК проявляет активирующий эффект на стимуляцию активности Ca2+ и Ca2+/Mg2+ зависимых форм АП-эндонуклеазы, не оказывая существенного влияния на активность Mg2+ зависимой формы этого фермента. Можно думать, что ГК - зависимая активация кальций - зависимой АП-эндонуклеазы необходимо для репарации поврежденных оснований вызванных радикалами кислорода.
Как отмечалось выше, один из основных факторов, ведущих к повреждениям ДНК и мутациям - это окислительный стресс [7]. Кислородсодержащие радикалы (супероксидные и гидроксильные). которые образуются при окислительном стрессе, индуцируют разнообразные повреждения ДНК (oxoG, 8-оксоаденин, формамидопиримидины. тиминовые гликоли и т.п.). Устраняются такие повреждения с помощью нескольких путей репарации. Одним из ключевых и самым универсальным путем репарации повреждений отдельных нуклеотидов является эксцизионная репарация оснований (ЭРО), которая инициируется совместным действием ДНК - N-гликозилаз и АП - эндонуклеаз. ДНК - гликозилазы катализируют N-гликозилазную реакцию. В результате реакции возникает АП - сайт, которая на следующем этапе ЭРО служит субстратом для одной из АП - эндонуклеаз клетки. АП - эндонуклеазы также выщепляют З' - концевые ненасыщенные альдегиды, образованные ДНК-гликозилазами.
Можно предположить, что наблюдаемая выше ГК зависимая активация АП - эндонуклеаз является следствием N-гликозилазной реакции ДНК - N – гликозилаз.
Зависит ли активность ДНК - N – гликозилаз от присутствия ГК и АБК в инкубационной среде? Какие в формы ДНК - N – гликозилаз активируются? Для выяснения этого вопроса нами была проведена анализ влияния фитогормонов(ГК и АБК) на активность ДНК - N – гликозилаз.
Проведенные нами эксперименты показали, что при инкубации изолированного алейронового слоя в присутствии ГК в дозе 1мкМ в течение 48 часов, приводило к существенному увеличению активности только Ca2+ зависимой формы ДНК - N – гликозилаз, не оказывая существенного влияния на активность Ca2+/Mg2+ и Mg2+
зависимых форм этого фермента. При этом, внесение в инкубационную среду природного антагониста ГК – АБК в дозе 5 мкМ, полностью тормозило активацию ГК индуцируемой формы (Ca2+ зависимой формы ДНК - N – гликозилаз) фермента.
Присутствие хелатора двухвалентных катионов – ЭДТА, заметно ингибировало активность ГК индуцированной АП – эндонуклеазы. Присутствие специфического хелатора ионов кальция - ЭГТА в дозе 10 мМ полностью блокировала ГК индуцированную активность АП – эндонуклеазы.
Таким образом, эти результаты показывают, что в присутствии ГК максимальную активность проявляют Са2+ зависимые ДНК - N – гликозилазы алейронового слоя зерна пшеницы.
Совокупность полученных нами результатов позволяют предполагать, что стимулирующее действие ГК на ПГК алейронового слоя зерна пшеницы может включать активацию АП – эндонуклеаз и ДНК - N – гликозилаз. При этом ГК индуцируемые формы АП – эндонуклеаз отличаются по чувствительности к ионам Ca2+, Mg2+. ГК в данной модельной системе активирует Ca2+ и Ca2+ / Mg2+ зависимые формы АП - эндонуклеаз, тогда как из ДНК - N – гликозилаз только Ca2+ - зависимая форма.
Эти результаты могут указывать на ключевую роль ферментов репарации ДНК в гормонально регулируемой ПГК алейронового слоя зерна пшеницы. ГК усиливает ПГК алейронового слоя, это действие ГК сопровождается фрагментацией ДНК на олигонуклеосомные фрагменты. Деградация хроматина до олигонуклеосомных
фрагментов происходить на поздних стадиях апоптоза и является одним из основных критериев апоптической гибели клеток. Вероятно, до наступления ПГК внутриклеточная концентрация АФК увеличивается в результате ГК зависимого торможения активности ферментов метаболизма АФК. Снижение активности ферментов метаболизма АФК в ГК обработанных клетках заметно усиливает процесс накопления АФК и соответственно, увеличивается накопления окислительного повреждения оснований ДНК. Возможно, вызванные радикалами кислорода модификации оснований ДНК индуцирует активность ДНК - гликозилаз и АП - эндонуклеаз. Однако, одноцепочечные разрывы вызванные за счет активации этих ферментов, приводит к образованию 3’ – ОН и 5’ – Р свободных концов, которые свою очередь являются субстратами эндо- и экзонуклеаз. Как отмечалось выше, ГК в данной модельной системе индуцирует активацию эндонуклеаз эндогенно локализованных в ядре клетки. Можно предположить, что сопряженная активация ферментов репарации ДНК (накопление одноцепочечных разрывов) и активация ГК зависимой эндодезоксирибонуклеазы является причиной деградации ДНК на олигонуклеосомные фрагменты.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Бисенбаев А.К., Таиров М.М., Берсимбаев Р.И.. Участие синтеза белка и стимулирующего действия гибберелловой кислоты на секрецию амилазы из изолированного алейронового слоя зерна пшеницы // Биохимия. - 1992. - Т.57. №12. - С.1834-1840.
2. Bethke P. C., Schuurink R and Jones R. L. Hormonal signaling in cereal aleurone // J.
Exp. Bot. -1997. - Vol. 48. P. 13337-13356.
3. Fath A., Bethke P., Lonsdale J., Meza-Romero R., Jones R. Programmed cell death in cereal aleurone // Plant Mol. Biology. - 2000. - Vol.44. - P.255-256.
4. Bissenbaev A.K., Keniev A.M., Bersimbaev R. I. Endogenous deoxyribonucleases involved in nuclear DNA degradation of wheat aleurone cells // Journal of Cell and Molecular biology. - 2004. - Vol. 3. - P. 77-81.
5. Бисенбаев А.К., Кениев А.М., Тазабекова Ж.Ж., Берсимбаев Р.И.
Онтогенетический программированная гибель клеток эндосперма созревающего зерна пшеницы// Вестник КазНУ им. аль-Фараби, серия биологическая. – 2003. - №3(21). - C. 40- 45.
6. Bissenbaev A.K., Altybaeva N.A., Kolbaeva G.A. Role of reactive oxygene species and antioxidant enzymes in hormone – regulating programmed cell death of wheat aleurone layer //
Journal of Cell and Molecular Biology. - 2007. - Vol. 5. - P. 38-43.
7. Jab T.I. Reactive oxygen intermediates as mediators of programmed cell death in plant and animals// Biochem. Pharm. - 1999. - Vol. 57. - P. 231-245.
8. Wang J.V. DNA damage and apoptosis // Cell death and differentiation. – 2001. - Vol.8. - P.1047-1049.
9. Gros L., Saparbaev M.K. and Laval J. Enzymology of the repair of free radicals-induced DNA damage // Oncogene. - 2002. - Vol.21. - P. 8905-8925.
