ҚАЗАҚСТАН РЕСПУБЛИКАСЫ БІЛІМ ЖӘНЕ ҒЫЛЫМ МИНИСТРЛІГІ Л.Н. ГУМИЛЕВ АТЫНДАҒЫ ЕУРАЗИЯ ҰЛТТЫҚ УНИВЕРСИТЕТІ
Студенттер мен жас ғалымдардың
«Ғылым және білім - 2014»
атты IX Халықаралық ғылыми конференциясының БАЯНДАМАЛАР ЖИНАҒЫ
СБОРНИК МАТЕРИАЛОВ
IX Международной научной конференции студентов и молодых ученых
«Наука и образование - 2014»
PROCEEDINGS
of the IX International Scientific Conference for students and young scholars
«Science and education - 2014»
2014 жыл 11 сәуір
Астана
УДК 001(063) ББК 72
Ғ 96
Ғ 96
«Ғылым және білім – 2014» атты студенттер мен жас ғалымдардың ІХ Халықаралық ғылыми конференциясы = ІХ Международная научная конференция студентов и молодых ученых «Наука и образование - 2014» = The IX International Scientific Conference for students and young scholars «Science and education - 2014».
– Астана: http://www.enu.kz/ru/nauka/nauka-i-obrazovanie/, 2014. – 5830 стр.
(қазақша, орысша, ағылшынша).
ISBN 978-9965-31-610-4
Жинаққа студенттердің, магистранттардың, докторанттардың және жас ғалымдардың жаратылыстану-техникалық және гуманитарлық ғылымдардың өзекті мәселелері бойынша баяндамалары енгізілген.
The proceedings are the papers of students, undergraduates, doctoral students and young researchers on topical issues of natural and technical sciences and humanities.
В сборник вошли доклады студентов, магистрантов, докторантов и молодых ученых по актуальным вопросам естественно-технических и гуманитарных наук.
УДК 001(063) ББК 72
ISBN 978-9965-31-610-4 © Л.Н. Гумилев атындағы Еуразия ұлттық
университеті, 2014
3581 УДК 581.2:632.4:633.1
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ГРИБКОВЫХ ПАТОГЕНОВ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ РЕАКЦИЙ ПОЛИМЕРИЗАЦИИ ЦЕПИ В РЕЖИМЕ R-TIME
Мыльникова Евгения [email protected]
Студентка 4 курса Аграрно-биологического факультета Костанайского государственного университета имени А.Байтурснова
Научный руководитель – И. Бейшова
На территории Республики Казахстан, как и во многих других странах мира, септориоз относится к особо опасным болезням зерновых культур. Вызывается данное заболевание грибами Septoria tritici и Septoria nodorum. Это заболевание является одним из самых опасных. В начальной стадии на листьях можно заметить стянутые жилки,- затем края листовых пластинок становятся скрученными, листья постепенно высыхают и опадают, приводя к гибели растения. Больше других культур курчавости листьев подвержен метельчатый флокс. Бороться с этим заболеванием невозможно, пораженные растения следует сразу же уничтожать. При этом заболевании на листьях появляются светло- оранжевые пятна, распространяющиеся по всей поверхности листовой пластинки. С развитием септориоза листья постепенно погибают. Септориоз - широко распространенное и вредоносное заболевание зерновых культур. В последние 30 лет он занял прочное место в списке экономически важных болезней. Погодно-климатические условия Казахстана благоприятствуют развитию и распространению септориоза, снижая рентабельность зернового производства. Согласно Постановлению Правительства Республики Казахстан от 10 декабря 2002 годя ғ 1295 «Об утверждении перечней карантинных объектов и особо опасных вредных организмов» (с изменениями и дополнениями от 23. 11. 2005 г.), в
«Перечень особо опасных вредителей и болезней сельскохозяйственных растений» был включен септориоз зерновых культур.
Ежегодный ущерб, наносимый вредителями и болезнями с.-х. культурам, по данным организации по продовольствию и сельскому хозяйству ООН (ФАО), составляет примерно 20-25% потенциального мирового урожая продовольственных культур. Поэтому роль защиты растений в увеличении производства и сохранении сельскохозяйственных продуктов огромна [1].
Принятая в Республике Казахстан система мониторинга и защиты растений от особо опасных болезней использует несовершенную методику полевых обследований с визуальным диагностированием и не охватывает даже половину посевных площадей, что приводит к ошибочным диагнозам и снижению рентабельности зернового производства. Существует ряд биотических и абиотических заболеваний с идентичными признаками проявления.
Традиционные методы комплексной диагностики, включающие выделение видов в чистую культуру, подбор сред и условий культивирования, получение моноспоровых изолятов и микроскопия, длительны, трудоемки и недостаточно эффективны.
Иммуноферментный метод анализа занимает несколько часов, однако разработанные на его основе методики видоспецифического, пресимптоматического и количественного определения S. tritici и S. nodorum в листьях и семенах пшеницы недостаточно чувствительны и не всегда обеспечивают четкую идентификацию этих видов.
Внедрение экспресс-методов диагностики септориоза на основе полимеразной цепной реакции (ПЦР) в модификации Real-Time позволит быстро и точно диагностировать развитие болезни.
Метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) по сравнению с иммуноферментным методом более чувствителен и специфичен, а его модификация в формате Real Time с
3582
использованием гибридизационного зонда с флуоресцентной меткой позволяет быстро анализировать результаты, не проводя электрофореза. Принципиальной особенностью ПЦР в реальном времени также является мониторинг и количественный анализ накопления продуктов полимеразной цепной реакции, автоматическая регистрация и интерпретация полученных результатов. Благодаря экономии производственных площадей, уменьшению количества персонала и востребованости количественного определения ДНК/РНК этот метод в последние годы успешно применяется в крупнейших диагностических и научно- исследовательских центрах развитых стран мира.
Подобного рода исследования актуальны и проводятся во всем мире, так, например, в Соединенных Штатах Америки проводились исследования по идентификации и картированию микросателлитных локусов из базы данных EST Septoria tritici, возбудителя Mycosphaerella graminicola [2], группа ученых исследовала специфичность и чувствительность ПЦР диагностики Septoria musiva, S. populicola и S. Populi [3], в Китае совместно с США проводились исследования по проектирования ПЦР праймеров для диагностики фитопатогенных грибов [4].
Принятая в настоящее время система мониторинга и защиты растений от особо опасных болезней использует преимущественно методики полевых обследований с визуальным диагностированием признаков развития болезней, в т. ч. и септориоза. Первые признаки поражения грибами рода Septoria на листьях растений проявляются через значительное время, пока возбудитель находится в инкубационном периоде, и диагностировать наличие его во внешне здоровом растении визуально невозможно [5].
Цель курсовой работы является определение и диагностика септориозов зерновых культур на основе полимеразой цепной реакции (ПЦР) в режиме R-time.
Для достижения поставленной цели необходимо решить следующие задачи:
Отбор штаммов возбудителей септориоза и изучение их основных биологических свойств;
Отработка и отбор оптимальных методов выделения ДНК Septoria;
Получение высокоочищенной ДНК грибов Septoria;
Диагностика септориоза методом ПЦР в режиме R-time.
Дифференциация изолятов Septoria по культурально-морфологическим признакам. Описание культурально-морфологических признаков изолятов проводили на 20- й (S. nodorum) и 30-й (S. tritici) день, отмечали размер, характер строения и окраску колоний, а также интенсивность споруляции гриба. У большинства изолятов S. nodorum развивались колонии с хорошо развитым, порошистым, шерстистым или бархатистым мицелием и с различным количеством пикнид. Иногда встречались изоляты, колонии которых состоят практически из одних пикнид и очень редкого мицелия. Размер колоний изолятов S. nodorum достигал 80-90 мм в диаметре. Для изолятов S. tritici в начале развития характерно дрожжеподобные колонии розового цвета, почти полностью состоящие из конидий и по внешнему виду очень напоминающие колонии бактерий; позднее колонии одних изолятов становятся мицелиальными, другие остаются дрожжеподобными, но могут изменить окраску.
Рост колоний S. tritici происходил значительно медленнее. Через месяц диаметр дрожжеподобных колоний был примерно 5-10 мм; диаметр мицелиальных колоний составлял 25-30 мм.
Основные морфологические типы колоний изолятов S. nodorum и S. tritici представлены в таблицах 1 и 2.
Таблица 1 - Характеристика колоний изолятов S. Nodorum Тип колонии Морфологический
тип
Характеристика морфологического типа
3583
Светлый (I) a Розовая, гранулированная, мицелий редкий воздушный, пикнид много.
b Черные, гофрированные Дрожжеподобный (I) c Черные, гофрированные, с розовой каймой Темный (II) a Черные, центр дрожжеподобный, черный;
край мицелиальный, черный
b Центр дрожжеподобный, розовый; край мицелиальный черный
c Серые; центр дрожжеподобный, розовый Смешанный
(II)
d Центр мицелиальный; край дрожжеподобный, гофрированный, черный.
- Бурая в середине, светлая по периферии, шерстистая, пикнид много.
Таблица 2 - Характеристика колоний изолятов S. Tritici Тип колонии Морфологический
тип
Характеристика морфологического типа
Светлый (I) a Розовые, поверхность гофрированная b Черные, гофрированные
с Черные, гофрированные, с розовой каймой
Смешанный (II)
а Черные, центр дрожжеподобный,
черный;край мицелиальный, черный
b Центр дрожжеподобный, розовый; край мицелиальный черный
с Серые; центр дрожжеподобный, розовый
d Центр мицелиальный; край
дрожжеподобный, гофрированный, черный e То же; край розовый
Мицелиальный (III)
a Белые или серые
b Черные
Для определения интенсивности споруляции гриба на питательной среде пробочным сверлом с известной площадью сечения взяли участки колонии и перенесли в подходящие емкости (химические стаканы, колбы, пробирки). Наиболее удобным было сверло с диаметром 0,7 см. Так как S. nodorum спорулирует неравномерно по площади колонии, взяли выбойки с центральной, средней и периферийной ее части и смешали в одну пробу. Выбойки залили точно измеренным количеством воды, настаивали примерно в течение 1 часа, затем
3584
тщательно перемешали стеклянной палочкой. С колонии S. tritici брали одну выбойку и сразу после взятия проб определяли споруляцию.
Определение видовой принадлежности гриба рода Septoria. Для установления видовой принадлежности гриба рода Septoria были взяты участки пораженного листа, стебля и колоса (с пикнидами) и поместили на предметное стекло в каплю воды. Уже через несколько минут, просматривая препарат при малом увеличении микроскопа, обнаружили выход пикноспор (рисунок 1).
а б
Рисунок 1 - Выход пикнидиоспор из пикнид: а- S. nodorum, б- S. tritici
У S. nodorum пикноспоры вышли в виде склеенной слизью ленты, которая затем рассыпается на отдельные конидии. Они цилиндрические, прямые или слегка изогнутые, с 1- 3 перегородками, размером 12-35 х 2-4 мкм. У S. tritici конидии вышли из пикнид пучком;
они нитевидные, прямые или слегка изогнутые, с 3-5 неясными перегородками, 35-90 х 1,8 мкм.
Отработка и отбор оптимальных методов выделения ДНК Septoria. Выделение ДНК многих видов растений считается трудной задачей из-за высокой концентрации вторичных метаболитов, таких как полисахариды и полифенолы, а также из-за наличия белков, жиров и ингибиторов в пробах. Для того, чтобы получить высокоочищенные ДНК, не содержащие ингибирующие примеси, необходимо использовать наиболее подходящие методы выделения.
Существует несколько методик для решения этой проблемы, также разработаны коммерческие наборы. Поэтому возникла необходимость выбора оптимального метода выделения ДНК экспериментальным путем.
В наших исследованиях по подбору оптимальной схемы выделения ДНК из культур грибов были использованы следующие методы:
- детергентно-ферментный метод с использованием додецилсульфата с последующей экстракцией фенол/хлороформом;
- с применением детергента Тween – 20 и последующей экстракцией фенолом;
- использование лизирующего буфера, содержащий детергент Nonidet P-40. и с дальнейшей экстракцией фенол/хлороформом;
- модифицированный метод с использованием детергента цетилтриметиламмоний бромида (ЦTAБ).
Первый способ основан на использовании фермента протеиназы К для лизиса белковых структур с дальнейшей фенольной депротеинизацией. Второй способ экстракции ДНК из бактерий предусматривает использование в качестве детергента Тween - 20. Тween хорошо лизирует клеточную мембрану, но слабее действует на ядерную стенку, если учесть, что в бактериальных клетках ядро не имеет оболочки – это оптимальный вариант.
При применении третьего и четвертого методов в качестве детергентов использовали Nonidet P-40. и детергент цетилтриметиламмоний бромида (ЦTAБ).
3585
Метод основанный на использовании в качестве детергента ЦТАБ (цетилтриэтилам- моний бромида), хорошо растворяет мембраны клеток. Кроме того, его применение позволяет разделить ДНК и полисахариды, поскольку они отличаются по растворимости в присутствии ЦТАБ. При высоких концентрациях солей (0,7М NaCl) нуклеиновые кислоты образуют стабильные, но вместе с тем растворимые комплексы со ЦТАБ. При снижении концентрации соли ниже 0,4М NaCl происходит выпадение в осадок комплексов ЦТАБ/нуклеиновая кислота, тогда как большая часть полисахаридов остается в растворе.
Главными критериями при отработке оптимальных методов были концентрация и чистота препарата.
После выделения ДНК гриба Septoria вышеперечисленными методами проводили качественный и количественный анализ образца. Спектрофотометрически измеряли отношение между оптическими плотностями при 260 и 280 нм. Максимум поглощения для нуклеиновых кислот регистрируется при длине волны 260 нм. Препарат ДНК считается свободным от примесей при величине отношений Е260/280 равным 1,8 и выше. Если этот показатель ниже указанного, то образец загрязнен белками или фенолом.
Образцы ДНК культур грибов, полученные с использованием детергентов Nonidet P-40 и Тween - 80, оказались невысокого качества. Отношения между оптической плотностью при длинах волн 260 и 280 нм в среднем составляли 1,65-1,7, что говорило о загрязненности ДНК белком и другими примесями. Полученные результаты показали неэффективность этих методов.
Лучшие результаты были получены при обработке мицелиальной суспензии детергентом – цетилтриметиламмоний бромида (ЦТАБ). Экстрагированная ДНК наблюдалась в виде осадка на дне микропробирок. Концентрации ДНК определяли на спектрофотометре. Перед внесением в реакционную смесь ДНК, выделенная из грибковых культур, разбавляли до 10 нг/мкл. Отношение оптической плотности (Е260/Е280) полученных препаратов ДНК имело среднее значение 1,93±0,04 (n=4).
Таким образом, исследования показали, что для наших целей оптимальной является модифицированная методика экстракции геномной ДНК из культуры грибов с использованием в качестве детергента цетилтриметиламмоний бромида (ЦТАБ).
Оценка эффективности выделения ДНК в ПЦР. Для потверждения результатов микроскопии проводили идентификацию изолятов на основе полимеразной цепной реакции в соответствии с протоколом приоизводителя.
Оценку эффективности выделения ДНК из проб биоматериала проводили посредством сопоставления результатов ПЦР с участием ДНК, выделенной разными указанными способами. Параметрами оценки являлись уровень чувствительности и воспроизводимость результатов ПЦР с использованием того или иного способа экстракции ДНК (рисунок 2).
3586
Рисунок 2 – Процесс амплификации в режиме Real-time
Чувствительность ПЦР – это количество исходного растительного компонента в анализируемом биоматериале. Воспроизводимость результатов ПЦР – количество положительных проб из 100 проведенных исследований.
Чувствительность ПЦР с использованием ДНК, выделенной при помощи ионных детергентов с последующей фенольной депротеинизацией несколько ниже, что свидетельствует о неполном удалении ингибиторов. Чувствительность методов, основанных на использовании ЦТАБ в качестве детергента значительно выше и одинакова для всех методов выделения растительной ДНК (рисунок 3,4).
Рисунок 3 – Отчет по результатам анализа ПЦР
3587
Рисунок 4 – Отчет по результатам анализа ПЦР
Таким образом, сравнительный анализ выбранных методов экстракции растительной ДНК из проб биоматериала, показал, что для проведения ПЦР с целью видовой идентификации гриба рода Septoria наиболее пригодны метод с использованием детергента цетилтриметиламмоний бромида (ЦTAБ).
Из полученных высокоочищенных ДНК формируется коллекция образцов ДНК штаммов Septoria.
Список использованных источников
1 И. М. Поляков, Е. М. Шумаков, статья «Защита растений» Большая советская энциклопедия. — М.: Советская энциклопедия. – 1969-1978.
2 Stephen B. Goodwin, Theo A.J. van der Lee, Jessica R. Cavaletto, Bas te Lintel Hekkert, Charles F. Crane, Gert H.J. Kema, Identification and genetic mapping of highly polymorphic microsatellite loci from an EST database of the septoria tritici blotch pathogen Mycosphaerella graminicola /Fungal Genetics and Biology, Volume 44, Issue 5, May 2007, Pages 398-414.
3 Nicolas Feau, Jerry E. Weiland, Glen R. Stanosz, Louis Bernier, Specific and sensitive PCR-based detection of Septoria musiva, S. populicola and S. populi the causes of leaf spot and stem canker on poplars/Mycological Research, Volume 109, Issue 9, September 2005, Pages 1015- 1028.
4 Zhonghua Ma, Themis J. Michailides, Approaches for eliminating PCR inhibitors and designing PCR primers for the detection of phytopathogenic fungi/ Crop Protection, Volume 26, Issue 2, February 2007, Pages 145-161.
5 Fraaije B. A. – Hollomon, D. W. 1997. Novel DNA diagnostic technology in plant disease control using Septoria tritici as a model. In: Project report no. 245, IACR-Long Ashton Research