Мир науки и молодежи: новые пути развития» (Караганда, 2016); 5-я Ежегодная Международная научно-практическая конференция «Актуальные вопросы медицины» (Баку, 2016 г.); на заседании кафедры хирургических болезней №2; на научно-экспертной комиссии по хирургическим дисциплинам в КГМУ.
Обзор литературы
В связи с избыточностью информации по данной тематике, мы решили ограничиться обзором работ только по наночастицам как носителям антибиотиков «Доставка наночастиц И антибиотиков», в данном разделе 54 доклада, анализ наиболее важных работ по теме данной диссертации представлено ниже. 49] указано, что для 68 антибактериальных агентов были предприняты попытки разработать транспортные системы на основе полимерных наночастиц. Авторы предполагают, что в основе иммуностимулирующего действия аминогликозидов, вводимых клеточным носителям, лежит отсроченное появление антибиотиков в крови, тогда как высокие концентрации антибиотиков в крови в первые сутки приводят к нарушению формирования полноценного иммунный ответ [24, с.10].
Например, отмечена клиническая эффективность реинфузии аутогенной клеточной массы из крови после инкубации с антибиотиком (ампициллином) при лечении неосложненной пневмонии у детей, при этом у 68% детей антибактериальная терапия ограничивалась однократной реинфузией клеточной массы, в 31,2% случаев реинфузию клеточной массы пришлось повторить через 48 часов. Рабочая доза аутолейкоцитов составляла не менее 10 х 1012, а кратность введения разовой дозы препарата - 1 раз в 24-48 часов в зависимости от состояния больного. Костюченко с соавторами [97, с.17] предлагают внутриартериальное введение аутологичных активированных иммунокомпетентных клеток больным с труднодоступными для хирургической обработки очагами инфекции.
Интересный метод был предложен А. А. Останиным и Е. Р. Черных: мононуклеарные клетки выделяют из лейкоцитарной взвеси и культивируют с ронколейкином в течение 24-48 часов с последующей реинфузией активированных клеток больному [98].
Материал исследования
Создание лейкоцитарной транспортной системы для антибиотика
Встряхиванием шприца цитосуспензию смешивали с антибиотиком, после инкубации в термостате при температуре 36-37°С в течение получаса, доводя объем крови до 2 мл 0,9% раствором NaCl, вводили внутривенно . С помощью сотрудников НЛА Лаборатории экспериментальной фармакологии Назарбаев Университета были сделаны микрофотографии клеточной лейкоцитарной взвеси, полученной нами при инкубации с цефтриаксоном, конъюгированным с родамином 6G-меченым флуоресцентным зондом PMPC25-PDPA70 (рис. 1).
Создание эритроцитарной транспортной системы для антибиотика
В диализные мешки вводили эритроцитарные фармакоциты с цефтриаксоном или лейкоцитарную взвесь с цефтриаксоном (расчетная концентрация 10 мг/мл) в объеме 1 мл, контрольные диализные мешки содержали цефтриаксон 10 мг в объеме 1 мл. В дальнейшем у лабораторных кроликов в опытных группах I, II и III через 30 минут часа в динамике брали венозную кровь и определяли концентрацию антибиотиков в плазме крови. Депротеинизация: аликвоту 200 мкл образца (плазмы или сыворотки) помещают в пробирку Эпендорфа на 1,5 мл и добавляют 600 мкл ацетонитрила, проводят вортексирование с последующим центрифугированием в течение 7 минут при скорости 14000 об/мин, при температуре 24°С, затем надосадочную жидкость извлекают.
Концентрацию антибиотика также определяли в области воспаленной мышцы (стенка абсцесса) и гноя через 24 часа после введения антибиотика (рис. 10). В случае использования лейкоцитарной массы диссоциация цефтриаксона происходит несколько медленнее, так что в течение первого часа из клеток высвобождается около 14%, затем в течение трех часов диффузия продолжается примерно на том же уровне, а через сутки более . что половина препарата освобождается от связывания с клетками (66,7%). На рис. 13 представлена фармакокинетическая кривая, отражающая изменение уровня концентрации антибиотика цефтриаксона в сыворотке крови интактных кроликов в течение 24 ч после однократного внутривенного введения свободного препарата (раствора антибиотика).
Дальнейшее снижение уровня концентрации цефтриаксона после введения свободного препарата продолжается максимально быстро в течение первых 6 ч после введения, затем медленнее до 12 ч; нам не удалось определить значимый уровень концентрации в сыворотке крови через 24 часа после внутривенного введения в условиях нашего эксперимента. На диаграмме отчетливо видно, что концентрация препарата снижалась до 0 при внутривенном пути введения в течение 12 часов, при использовании эритроцитарного транспорта - в течение 16 часов, а в группе животных, где применялся лейкоцитарный транспорт, этот процесс протекал дольше. . чем 24 часа. При сравнении периода полувыведения антибиотика с разными формами транспорта выявлено, что этот показатель был максимальным в I группе при транспорте лейкоцитов (Ме = 230,1 мин), а минимальным — в III группе при введении свободного препарата (Ме = 117,8 мин), тогда как во II группе (транспортная система эритроцитов) этот показатель занимал промежуточное положение и достигал 122,6 мин.
Соответственно, между группами I и III, а также между группами I и II были обнаружены только статистически значимые различия, тогда как различия между группами II и III не достигали статистически значимого уровня. Минимальный общий клиренс зарегистрирован у животных I группы (лейкоцитарно-транспортная система) (Ме=8,211 мл/мин), а максимальный - в III группе (свободный препарат) (Ме=21,30 мл/мин), промежуточные значения зарегистрированы у II группа (Ме=17,26 мл/мин). Как следует из представленной фигуры 16, флюорохром, заключенный в транспортной системе лейкоцитов, фиксируется в течение 48 часов, локализуется преимущественно в печени и селезенке, а через 24 часа - в почках, в первые 24 часа распределяется в ткани лейкоцитов. также видны легкие и головной мозг.
На это указывал период полувыведения, который был минимальным в III группе (медиана = 29,22 мин), максимальным в I группе (медиана = 167,4 мин), а во II группе этот показатель занимал промежуточное положение (медиана = 59,23 мин). По результатам сравнительного анализа значений клиренса цефтриаксона в таблице 16 было выявлено, что скорость элиминации антибиотиков из организма животных у II (медиана = 15,26 мл/мин) и III (медиана) = 19,32 мл/мин) статистически значимо выше, чем в группе I, где процесс освобождения организма от антибиотиков протекал наиболее медленно. В I группе этот фармакокинетический показатель был в 2,5 раза выше по сравнению с его значениями во II группе и в 3 раза выше, чем в III группе.
И, наконец, общее среднее время поддержания стационарной концентрации цефтриаксона в организме у подопытных животных I группы составило ок. в 3 раза выше среднего и статистически значимо отличается от времени пребывания этого антибиотика в организме животных II и III групп в таблице 18. Продолжительность пребывания цефтриаксона в крови после введения свободного препарата ограничена при условиях нашего наблюдения и составляет менее 12 часов, после введения цефтриаксона в составе эритроцитарной системы - ок. ч., а после введения в составе лейкоцитарной системы - более 24 ч. При инкубации антибиотика цефтриаксона in vitro до 70% введенной дозы связывается с тенями эритроцитов, а в течение 24 ч более 80% ранее связанного препарата диссоциирует во внеклеточное пространство.
При инкубации in vitro антибиотика цефтриаксона 15,6 ± 4,1 % препарата от введенной дозы связывается с лейкоцитарной клеточной массой, в присутствии 0,5 мМ АТФ связывание увеличивается до и в течение 24 ч скорость диссоциации превышает 60 %.
Методика биофармацевтического исследования
Исследование фармакокинетики антибиотика цефтриаксон в составе
В первой группе кроликам вводили внутривенно (в краевую ушную вену) 1 мл цефтриаксона в дозе 500 мг, в составе лейкоцитарно-транспортной системы (предварительно по методике, описанной в разделе 2.2, в аутоклеточную препарат готовили для каждого кролика отдельно); кроликам второй группы вводили внутривенно 1 мл цефтриаксона в дозе 500 мг в составе эритроцитарной транспортной системы (предварительно по методике, описанной в разделе 2.2, готовили препарат тени аутоэритроцитов для каждого кролика в отдельности) ; в третьей группе кроликам внутривенно вводили 1 мл свободного раствора цефтриаксона в дозе 500 мг, разведенного в 1 мл 0,9% NaCl. Подготовка пробы к анализу: 100 мкл супернатанта переносят в чистую пробирку Эпендорфа на 1,5 мл, добавляют 100 мкл ацетонитрила и 800 мкл 2.
Исследование фармакокинетики антибиотика цефтриаксон в составе
В первой группе кроликам внутривенно вводили 1 мл цефтриаксона в дозе 500 мг, в составе системы транспорта лейкоцитов (предварительно по методике, описанной в разделе 2.2, для каждого кролика отдельно готовили препарат с аутоклетками). . ); кроликам второй группы внутривенно вводили 1 мл цефтриаксона в дозе 500 мг, в составе эритроцитарной транспортной системы (предварительно по методике, описанной в разделе 2.2, готовили препарат с тенями аутологичных эритроцитов для каждый кролик отдельно) ; в третьей группе кроликам внутривенно (в краевую вену уха) вводили 1 мл раствора свободного цефтриаксона в дозе 500 мг, разведенного в 1 мл 0,9% NaCl.
Фармакокинетическое моделирование
Математическое уравнение для этой экспоненциальной зависимости: Ct = C0 • e_kelt, где Ct — концентрация в плазме в данный момент времени (t), C0 — рассчитанная начальная концентрация в плазме при t = 0, kel — константа скорости элиминации, а e — основание натурального логарифма (рис. 11).
Статистический анализ
Результаты биофармацевтического исследования лейкоцитарной и
Фармакокинетика антибиотика цефтриаксон в составе лейкоцитарной
При сравнении объема распределения цефтриаксона в зависимости от формы транспортной системы установлено, что он был наибольшим в I группе (Ме=10460 мл), тогда как значения этого показателя были сопоставимы во II и II группах. III. (Ме=7340 и 7650 мл). Результаты проведенного ROC-анализа свидетельствуют о том, что наибольшая площадь под кривой зарегистрирована в I группе (Me=16108,3), а наименьшая - в III группе (Me=10464,8). В небольшой фрагмент работы, выполненной совместно с сотрудниками Лаборатории фармакологии НЛА Назарбаев Университета (А. Гуляев, Ш. Сергази), включены иллюстрации распределения зонда Alexa Fluor 680 (Рисунок 16) в лейкоцитарной транспортную систему получали с использованием системы визуализации IVIS Spectrum In Vivo.
Чтобы свести к минимуму тушение флуоресценции шерстью, мышей balb/slee брили и кормили жидким кормом в течение 48 часов перед экспериментом. В хвостовую вену в объеме 0,1 мл вводили Alexa Fluor 680, депонированную в лейкоцитарную систему (1 мл крови предварительно получали из бедренной вены и затем продолжали по описанной выше методике приготовления лейкоцитарной системы). . При введении бесплатного препарата Alexa Fluor 680 фиксируется в сосудах в течение 7 часов, больше всего накапливается в селезенке, меньше в печени и легких, также устанавливается переход в головной мозг.
Фармакокинетика антибиотика цефтриаксон в составе лейкоцитарной
Наибольшая концентрация наблюдалась при лейкоцитарном транспорте антибиотика (медиана = 15,49 мкг/мл), несколько меньшая концентрация создавалась в мышцах после введения эритроцитарной транспортной системы (медиана = 8,916 мкг/мл; p = 0,031), а минимальная концентрация была при свободном внутривенном введении (медиана = 3,830 мкг/мл; р=0,000). Наибольшая концентрация антибиотика наблюдалась при лейкоцитарном транспорте (медиана = 9,795 мкг/мл) и статистически значимо отличалась от таковой в очаге инфекции при эритроцитарном транспорте (медиана = 4,880 мкг/мл; p=0,016) и при внутривенном введении свободного препарат (медиана = 5,159 мкг/мл, p = 0,000). Таким образом, время снижения концентрации цефтриаксона в плазме на 50% от введенного количества препарата было наибольшим в группе I (медиана = 463,8 мин) и статистически значимо отличалось от такового в группе III (медиана = 155,2 мин).
Этот показатель у животных II группы (медиана = 245,1 мин) вновь занимал промежуточное положение и достоверно не отличался от значений в других опытных группах (рис. 20).
Сравнение показателей фармакокинетики цефтриаксона у интактных
В результате были получены статистически достоверные данные, свидетельствующие о том, что введение 0,5 мМ АТФ в среду инкубации антибиотика и клеток увеличивает связывание цефтриаксона клеточной массой, преимущественно лейкоцитами, почти на 80%. Достигнутые свойства транспортной системы эритроцитов: связывание более 60%, диссоциация за день полный, более чем на 80% находится в достаточном соответствии с известными ранее свойствами «фармакоцитов» (теней эритроцитов, содержащих лекарство), описанными Ж.Ш. Опухолетропные стволовые клетки жирового происхождения, несущие интеллектуальные нанотерапевтические средства для адресной доставки и двухмодальной терапии ортотопической глиобластомы // J.
A new strategy to achieve effective drug delivery: using cells as a carrier in combination with nanoparticles // Drug Deliv. Negative staining of phospholipids and their structured modification by surface agents as observed in the electron microscope // J. Preparation and in vitro evaluation of carrier erythrocytes for RES-directed delivery of interferon alpha 2b // Int.
Encapsulation of valproate-loaded hydrogel nanoparticles in intact human erythrocytes: a novel nanocell assembly for drug delivery // J. Erythrocyte loading of low molecular weight chitosan nanoparticles as a potential vascular drug delivery system // Colloid Surf B Biointerfaces. The target transport of antibiotics after their injection into the leukocytal container // 3rd Jerusalem conf.
Polymer nano-assembly as delivery systems and antibacterial toolbox: From PGMA to MSN@PGMA // Chem.
