ХАРАКТЕРИСТИКА ЦЕЛЛОБИОГИДРОЛАЗ ГРИБА L. EDODES
И КЛОНИРОВАНИЕ ИХ ГЕНОВ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ РЕКОМБИНАНТНЫХ ФЕРМЕНТОВ, ИСПОЛЬЗУЕМЫХ В ПРОИЗВОДСТВЕ БИОЭТАНОЛА.
Тайпакова С.М.1 , Искаков Б.К.2, Бисенбаев А.К.1
1ДГП «Научно-исследовательский институт проблем биологии и биотехнологии» КазНУ им. аль-Фараби, Алматы, Казахстан
2ДГП «Институт молекулярной биологии и биохимии им. М.А. Айтхожина», Алматы, Казахстан
Скачок цен на нефть в 1970-х и осознание того, что мировые запасы нефти ограничены, стимулировали широкий всплеск интереса к поиску альтернативных источников энергии. Многие исследования тех лет ставили перед собой задачу экономически выгодного производства этанола из повсеместно распространенного, биоразложимого и обновляемого сырья. Этанол, по ряду своих свойств, превосходит бензин. В частности, чистый (неразбавленный) этанол сгорает чище и эффективнее, обладает более высоким октановым числом, продуцирует меньшее количество СО2 и загрязняющих атмосферу веществ и, наконец, он менее токсичен для человека, чем бензин (или метанол) [1].
Вполне возможно, что этанол, образуемый из целлюлозы, может стать вполне конкурентоспособной альтернативой бензину, если снизить затраты на производство первого.
Основными способами удешевления этого продукта могут быть замена сырья для его
производства и кардинальное изменение технологии алкогольной ферментации. Замена сырья заключается в том, что вместо зерна злаков для превращения в этанол будет использоваться возобновляемая биомасса целых растений как травянистых, так и деревьев, включая отходы сельского хозяйства и деревообрабатывающей промышленности.
А так же важнейшим фактором удешевления конечного продукта – биоэтанола, является понижения цены ферментов (целлюлаз, ксиланаз, глюкозидаз) необходимых для разложения целлюлозосодержащего сырья до простых сахаров. Ферменты, осуществляющие биодеградацию целлюлозы в природе, продуцируются в основном микроскопическими грибами и бактериями. Ключевыми ферментами целлюлазного комплекса, ответственными за глубокий гидролиз кристаллической целлюлозы, являются целлобиогидролазы (ЦБГ, КФ3.2.1.91), основным продуктом действия которых является целлобиоза [2].
Целлобиогидролазы I и II T. reesei являются наиболее изученными ферментами [3]. О свойствах целлобиогидролаз из других грибных продуцентов (особенно термофильных) известно значительно меньше, несмотря на то, что в базах данных имеется довольно большое количество их аминокислотных последовательностей, транслированных из генов.
Целью работы являлось изучение физико-химических свойств целлюлитических ферментов, а также характеристика и клонирование кДНК генов, кодирующих целлобиогидролазы (CEL7A, CEL6B ) гриба Lentinula edodes.
Проведенные исследования показали, что тип целлюлозного субстрата оказывает влияние как на экзоцеллобиогидролазную так и эндоглюконазную активность. Активность эндоглюконаз и экзоцеллобиогидролаз в культуральной среде индуцируется как авицелом (микрокристаллической целлюлозой), так и карбоксиметилцеллюлозой (СМС). Однако механизм и что является истинным индуктором - целлюлоза или ее производные - предмет дальнейшего изучения. Проведены эксперименты по изучению некоторых физико-химических характеристик целлюлитических ферментов. Показано, что оптимальная каталитическая активность фермента максимально проявляется при рН 7, как в присутствии КМЦ, так и авицел. Показано, что оптимальную целлюлолитическую активность данный фермент проявляет при 50ºС. При этом высокая активность сохранялась при 70ºС, что является положительным фактором для использования этих ферментов в производстве биоэтанола.
Как отмечалось выше, ключевыми ферментами целлюлазного комплекса, ответственными за глубокий гидролиз кристаллической целлюлозы, являются целлобиогидролазы, основным продуктом действия которых является целлобиоза.
В последующих экспериментах мы исследовали регуляцию экспрессии целлобиогидролаз на уровне образования мРНК. Для определения регуляции экспрессии генов cel6B и cel7A целлюлозными субстратами, мицелии гриба Lentinula edodes инкубировали в среде с СМС или авицел. Через 8 суток, из мицелиев гриба Lentinula edodes была выделена тотальная РНК и проведена реакция обратной транскрипции (РОТ) и полимеразная цепная реакция (ПЦР) кДНК специфическими праймерами к определенным участкам генов cel6B и cel7A целлобиогидролаз. Установлено, что тип целлюлозы вызывают дифференциальную экспрессию мРНК целлобиогидролаз CEL6В и CEL7А. Показано, что синтез мРНК CEL7А зависит от присутствия в среде СМС и авицел, тогда как индукция синтеза мРНК CEL6В происходила только в присутствии микрокристаллической целлюлозы. Эти данные свидетельствуют о том, что индукция активности и секреции целлобиогидролаз гриба L. edodes происходит на уровне транскрипции мРНК.
Проведен компьютерный анализ нуклеотидных последовательностей мРНК (кДНК) генов целлобиогидролаз cel7A и cel6В гриба L. edodes. На основании анализа нуклеотидной последовательности мРНК (кДНК) - гена cel7A и cel6В, проведен расчет и осуществлен синтез олигонуклеотидных праймеров для амплификации вышеуказанных генов из L. edodes на матрицах соответствующих мРНК с применением реакции обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции.
Тотальную РНК выделяли из клеток мицелий гриба L. edodes. После преципитации 3М LiCl препарат несколько обогатился высокомолекулярными компонентами, поскольку низкомолекулярная тРНК осталась в надосадочной фракции. Полученный препарат РНК был использован для амплификация кДНК cel 6B и cel7A с помощью РОТ и ПЦР.
Амплифицированные фрагменты вырезали из геля и элюировали. Выделенные таким образом фрагменты обрабатывали рестриктазами NcoI и SmaI, затем повторно подвергали электрофорезу и элюировали фрагмент кДНК cel7A длиной около 1571пн и cel6B – 1335 пн для последующего лигирования в модифицированный вектор на основе p115TMV.
Одновременно вектор p115TMV, также обрабатывали рестриктазами NcoI и SmaI. В результате лигирования вектора и кДНК целлобиогидролаз получили рекомбинантную ДНК. Качество рестрикции проверяли с помощью электрофореза в 1% агарозном геле.
После лигирования очищенных ампликонов cel7A и cel6В в вектор p115TMV, трансформирования в клетки DH5α, высева на селективную среду и появления колоний было отобрано 6 случайных колоний трансформантов, которые были проверены на наличие вставки при помощи специфических праймеров. Все тестируемые колонии при амплификации дали продукт ожидаемой молекулярной массы. Для определения размера вставок плазмиды были подвергнуты расщеплению эндонуклеазами рестрикции NcoI и BamHI .
Таким образом, нами клонированы фрагменты кДНК cel6В длиной 1335пн, кДНК cel7A длиной 1571пн и геномные ДНК cel6В и cel7A длиной около 2000 пн.
В следующих экспериментах, для экспрессии вышеуказанных генов был выбран вектор pET11d (Clontech). Они обладают необходимыми для экспрессии генов качествами:
сильным промотором гена 10 фага Т7, аффинным полигистидиновым маркером, подходящей для вставки емкостью и простотой селекции [4].
Клонированные гены экспрессировались в бактериальных штаммах BL21DE3pLysE Star, BH110 DE3, Rosetta, Origami, Arctic express (DE3)RP содержащей хромосомную копию гена T7 РНК полимеразы и чувствительные к ампицилину, устойчивость к которому имеется у векторов pET-11d cel6B и cel7A. Для переноса генетического материала использовался метод электропорации и ячейки фирмы Eurogentec на аппарате
BioRAD Gene Pulser. Индукцию экспрессии генов проводили при концентрации ИПТГ 0,2 мМ и при +30°C в течении 12 часов в жидкой среде LB c ампицилином (100 мкг/мл).
Для проверки результата индуцирования использовался белковый электрофорез (SDS- PAGE), сравнивались белки бактерий до и после индуцирования. Трансформированные клетки экспрессионных штаммов BL21DE3pLysE Star, BH110 DE3, Rosetta, Origami, Arctic express (DE3)RP инкубированные в присутствии ИПТГ синтезировали белок с молекулярной массой 53,5 кДа и 46,4 кДа, что соответствует молекулярной массе целлобиогидролазы типа 7А и 6В. В отсутствие индуктора накопление белка с сответствующей молекулярной массой не происходило. Что свидетельствует об эффективной экспрессиии данных генов. Наилучщая индукция экспрессии была замечена в экспрессионных клетках Rossetta. Во всех случаях искомые белки наблюдались в осадке, тогда как в клеточном экстракте их небыло.
Для идентификации и классификации рекомбинантных ферментов полосы на гель - электрофореграмме, соответствующие изучаемым белкам, вырезали и обрабатывали трипсином. Далее смесь полученных пептидов анализировали методом MALDI-TOF масс- спектрометрии, в результате чего были получены пептидные «фингерпринты» белков.
Далее в базе данных SwissProt (UniProtKB) с помощью программы BLAST2 был проведен поиск белков, гомологичных изучаемым целлобиогидролазам. Согласно данным BLAST- анализа, одна целлобиогидрола попала, как и ожидалось, в 7А семью гликозид-гидролаз, а другая в 6В.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Lynd, L. R., H. Jin, J. G. Michels, C. E. Wyman, and B. Dale. 2003, posting date.
Bioenergy: background, potential, and policy. Center for Strategic and International Studies, Washington, D.C. [Online.]
2. А.П. Синицын, А.В. Гусаков, В.М. Черноглазов. Биоконверсия лигноцеллюлозных материалов: Учебное пособие. М.: Изд-во МГУ, 1995.
3. Wyman, C. E., and N. D. Hinman. 1990. Ethanol. Fundamentals of production from renewable feedstocks and use as a transportation fuel. Appl. Biochem. Biotechnol. 24/25:735–
753
4. Novagen pET system manual (11th edition) // Novagen, 2005.
