УДК 619:576.8.078:616.981.42
К.К. Акыл баева*, Г.О. Шы ны бе ко ва, С.О. Са ди ка лиева, К.Т. Сул тан ку ло ва, В.М. Ст роч ков, Б.А. Ес пем бе тов,
Н.Т. Сан ды баев,
А.Р. Сан сыз бай, А.М. Ме лис бек
Науч но-исс ле до ва тельс кий инс ти тут проб лем биоло ги чес кой бе зо пас нос ти, Республика Ка за хс тан, Жам былская об лас ть, п.г.т. Гвар дейс кий
*Е-mail: [email protected]
Мо ле ку ляр но-ге не ти чес кий ана лиз внеш не го мембран но го бел ка omp19 бак те рии brucella abortus, вы де лен ной в Рес пуб ли ке Ка за хс тан
В дан ной статье представ ле ны ре зульта ты вы пол нен ных ра бот по мо ле ку ляр ноге не ти чес ко му ана ли зу ге на, ко ди рующе го внеш ний мембран ный бе лок Omp19 штам мов бак те рии Brucella abortus, вы де лен ных на тер ри то рии Рес пуб ли ки Ка за хс тан. Ана лиз нук лео тид ной пос ле до ва тельнос ти ка
за хс танских штам мов бак те рии Brucella abortus по ге ну Omp19 по ка зал 100% иден тич нос ть меж ду со бой. Штамм Ала коль2 Brucella abortus, вы де лен ный в Тал ды кор ганском ре ги оне Ал ма тинской об лас ти, штамм СКО Brucella abortus, вы де лен ный в Cеве роКа за хс танской об лас ти, и штам мы Brucella abortus из Ген бан ка с ID но ме ра ми L27997, CP003176.1 и U35742.1 от ли чают ся на ли чием од ной нук лео тид ной за ме ны, A на G, в по зи ции 334 и сте пень иден тич нос ти сос тав ляет 99%.
Так же выяв ле но, что штам мы Brucella abortus, вы де лен ные в раз лич ных ре гио нах Рес пуб ли ки Ка за хс тан, от ли чают ся от штам мов из Ген бан ка с ID но ме ра ми: Е017223.1, СР000887 на ли чием мно же ст вен ных за мен в нук лео тид ной пос ле до ва тельнос ти.
Клю че вые сло ва: внеш ний мембран ный бе лок, бак те рия Brucella abortus, ПЦР (по ли ме раз ная цеп ная реак ция), сек ве ни ро ва ние, нук лео тид ная пос ле до ва тельнос ть.
K.K. Akylbayeva, G.O. Shynybekova, S.O. Sadikaliyeva, K.T. Sultankulova, V.M. Strochkov, B.A. Espembetov, N.T. Sandybayev,
A.R.Sansyzbay, A.M. Melisbek
molecular genetic analysis of the external membrane protein omp 19 bacteria brucella abortus, isolated in the
Republic of Kazakhstan
This article presents the results of performed work on the molecular genetic analysis of the gene encoding the outer membrane protein Omp19 strains of bacteria Brucella abortus, isolated in the territory of the Republic of Kazakhstan. Nucleotide sequence analysis of Kazakhstan strains of bacteria Brucella abortus Omp19 gene showed 100 % identity with each other. Alakol 2 strain Brucella abortus, highlighted in Taldykorganskiy region of Almatinskaya oblast, SKO Brucella abortus strain, highlighted in the North
Kazakhstan oblast and Brucella abortus strains from Genebank with ID numbers L27997, CP003176.1 and U35742.1 are characterized by a single nucleotide substitution, A to G, at position 334 and a degree of identity is 99 %.
МолекуляРная биология и генетика
МолекуляРная биология и генетика
Molecular
Biology
and geneticS
Also it is found that Brucella abortus strains, isolated in different regions of the Republic of Kazakhstan are different from the strains of the Genebank with ID numbers: E017223.1, SR000887 in presence of multiple substitutions in the nucleotide sequence.
Key words: outer membrane protein, bacteria Brucella abortus, PCR (polymerase chain reaction), sequencing, nucleotide sequence.
К.К. Акыл баева, Г.О. Шы ны бе ко ва, С.О. Са ди ка лиева, К.Т. Сул тан ку ло ва, В.М. Ст роч ков, Б.А. Ес пем бе тов, Н.Т. Сан ды баев,
А.Р.Сан сыз бай, А.М. Ме лис бек
Қа зақстан рес пуб ли ка сын да бө лі ніп алын ған brucella abortus бак те риясы ның omp
19 сыртқы мембра на лық ақуы зын мо ле ку ла лы-ге не ти ка лық тал дау
Осы ма қа ла да Brucella abortus бак те риясы ның қа зақстан дық штам да ры ның Omp19 сыртқы мембра на лық ақуызы мо ле ку ла лыге не ти ка лық тал дау дың нә ти же ле рі көр се тіл ген. Нук лео тид ті тіз бек тің тал дауы қа зақстан дық штам да ры ның Brucella abortus бак те риясы ның Omp19 ге ні бой ын
ша өза ра 100% ұқ сас ты ғын көр сет ті. Ал ма ты об лы сы ның Тал ды қор ған айма ғын да бө лі ніп алын
ған Brucella abortus Ала көл 2 шта мы, со ны мен қа тар Сол түс тік Қа зақстан об лы сын да бө лі ніп алын
ған Brucella abortus СКО шта мы жә не Ген банктан алын ған ID нө мір ле рі: L27997, CP003176.1 жә не U35742.1 Brucella abortus штам да ры 334 по зи цияда ғы Aнен Gге бір нук лео тид ті ауы сым мен ажы
ра ты ла ды жә не оның ұқ сас тық дең гейі 99%ды құ рай ды.
Сон дайақ, Қа зақстан Рес пуб ли ка сы ның әр түр лі ай мақ та ры нан бө лі ніп алын ған Brucella abor
tus штам да ры, Ген банктан алын ған ID нө мір ле рі: Е017223.1, СР000887 штам да ры нан нук лео тид тік тіз бек те гі көп те ген ауы сым мен ерек ше ле не ті ні анық тал ды.
Түйін сөз дер: сыртқы мембра на лық ақуыз, Brucella abortus бак те риясы, ПТР (по ли ме раз ды тіз бек ті реак ция), сек ве нир леу, нук лео тид ті тіз бек.
Бру цел лез – осо бо опас ная и со ци ально зна- чи мая ин фек ция, вы зы ваемое бак те риями ро- да Brucella. Дан ная бо лез нь при но сит зна чи- тельный эко но ми чес кий ущерб и представ ляет со бой ми ро вую проб ле му для ме ди ци ны и ве те- ри на рии [1, 2]. Ес те ст вен ным ре зер вуа ром бру- целл в при ро де яв ляют ся жи вот ные.
По дан ным Объеди нен но го ко ми те та экс- пер тов ВОЗ по бру цел ле зу (1986), эта бо лез нь сре ди жи вот ных ре ги ст ри рует ся в 155 ст ра нах ми ра. Наибо лее ши ро ко бру цел лез распростра- нен в ст ра нах Сре ди зем но морья, Юго-Вос точ- ной Азии, Аф ри ки, Центральной и Юж ной Аме- ри ки [3, 4].
При соз да нии вак ци ны ос нов ным дей ст вую- щим на ча лом яв ляются им му но ген ные бел ки, от ве тс твен ные за вы ра бот ку им му ни те та. Мно- гие бел ки бак те рии Brucella abortus исс ле до- ва ны, и оп ре де ле ны их ро ли в им му ном от ве те про тив бру цел ле за.
В на ших экс пе ри мен тах в ка че ст ве объек та исс ле до ва ния был выб ран ген, ко ди рую щий бе- лок Omp19 бак те рии Brucella abortus.
Бе лок Omp19 (мол.мас са 19 кДа) яв ляет ся бел ком на руж ной мембра ны, представ ляет со- бой ли поп ро те ин, и это вы ра жает ся во всех ви- дах и из ве ст ных биова рах Brucella abortus [5].
В свя зи с этим про ве де ние мо ле ку ляр но-ге- не ти чес ких исс ле до ва ний ге на Omp19 бак те рии Brucella abortus, вы де лен ной от больных жи вот- ных на тер ри то рии Рес пуб ли ки Ка за хс тан, яв- ляет ся ак ту аль ным.
Ма те ри алы и ме то ды
В дан ной ра бо те ис пользо ва ны штам мы бак- те рии Brucella abortus, вы де лен ные на тер ри то- рии Рес пуб ли ки Ка за хс тан, ко то рые представ ле- ны в таб ли це 1.
Вы де ле ние бак те ри аль ной ДНК. Вы де ле ние ДНК про во ди ли с ис пользо ва нием ком мер чес- ко го на бо ра «PrepMan Ultra Sample Preparation Reagent» фир мы Applied Biosystems, сог лас но про то ко лу произ во ди те ля.
ПЦР по станов ка. Амп ли фи ка цию фраг мен- тов ДНК ге нов бак те рии Brucella abortus про во ди- ли на тер мо цик ле ре «GeneAmp PCR 9700», фир мы
«Applied Biosystems». Для амп ли фи ка ции фраг мен- тов ДНК ге нов бак те рии Brucella abortus ис пользо- ван прай мер с нук лео тид ной пос ле до ва тельнос тью:
5’-CGCATATGGGAATTTCAAAAGCAAGT CT-3’;
5’-CGCTCGAGGCGCGACAGCGTCACGG CCT-3’.
Раз мер про дук тов сос тав ляет 544 п.о.
Амп ли фи ка цию про во ди ли в 50 µl, со дер жа- щих 5 µl 10X ПЦР бу фе ра (Qiagen), 1 µl 10 mM dNTPs (NEB), 0,1 µl ДНК, 1 µl каж до го прай ме-
ра (20 pmol/µl), 0,25 µl Taq DNA по ли ме ра зы (2.5 units, Qiagen). Ус ло вия амп ли фи ка ции: 94˚C 5 мин; за тем 30 цик лов 94˚C 1 мин, 50˚C 1 мин, 72˚C, 2 мин, и 1 цикл 72˚C 7 мин.
М – 1 kb Мар кер, Invitrogen; 1 – по ло жи тельный контроль Brucella abortus 544; 2 – Brucella abortus 0001/H; 3 – Brucella abortus 0002/H; 4 – Brucella abortus 0006/В; 5 – Brucella abortus 0007/В; 6 – Brucella abortus 0008/В; 7 – Brucella abortus 0009/Х; 8 – Brucella abortus ЮКО 198 212; 9 – Brucella abortus ЮКО
2535;
10 – Brucella abortus ЮКО 198 767578; 11 – Brucella abortus Ала коль 1; 12 – Brucella abortus Ала коль 2;
13 – Brucella abortus Аты рау 88; 14 – Brucella abortus СКО
Ри су нок 1 – Электро фо рег рам ма ПЦР про дук тов фраг мен тов ге нов, ко ди рую щих бе лок внеш ней мембра ны Omp19 штам мов бак те рии Brucella abortus, вы де лен ных на тер ри то рии Рес пуб ли ки Ка за хс тан
Таб ли ца 1 – Штам мы бак те рии Brucella abortus, вы де лен ные на тер ри то рии Рес пуб ли ки Ка за хс тан
Наиме но ва ние штам ма Ре ги оны
brucella abortus 0001/h
Жам былская об лас ть brucella abortus 0002/h
brucella abortus 0006/b
Ал ма тинская об лас ть Brucella abortus 0007/B
brucella abortus 0008/b Brucella abortus в R-фор ме 0009/X
Юж но-Ка за хс танская об лас ть Brucella abortus ЮКО 198 212
Brucella abortus ЮКО 2535 Brucella abortus ЮКО198767578
Brucella abortus Ала коль1
Ал ма тинская об лас ть, Тал ды кор ганский ре ги он Brucella abortus Ала коль 2
Brucella abortus Аты рау 88 Аты раус кая об лас ть
Brucella abortus СКО Се ве ро-Ка за хс танская об лас ть
brucella abortus 544 контроль, эта лон ный штамм
Ана лиз ПЦР про дук тов. Де тек цию ПЦР про- дук тов про ве ли на 1% ага роз ном ге ле в ТАЕ бу- фе ре с бро мис тым эти дием.
Сек ве ни ро ва ние. Для сек ве ни ро ва ния ге на Omp19 штам мов бак те рии Brucella abortus, вы- де лен ных на тер ри то рии Рес пуб ли ки Ка за хс тан,
ис пользо ва ли ме тод ди де ок си сек ве ни ро ва ния по Сен ге ру на ав то ма ти чес ком 16-ка пил ляр ном сек ве- на то ре Genetic Analyser 3130 xl, Applied Biosystems.
В ка че ст ве по ли ме ра для ка пил ля ров ис пользо ва ли РОР-7. На ра бот ку тер ми ни рую щих про дук тов ДНК про во ди ли ме то дом цик ли чес ко го сек ве ни ро ва ния.
Ри су нок 2 – Срав ни тельный ана лиз фраг мен та пос ле до ва тельнос ти ге на Оmp 19 раз лич ных штам мов воз бу ди те ля Brucella abortus, вы де лен ных на тер ри то рии Рес пуб ли ки Ка за хс тан
Срав ни тельный ана лиз нук лео тид ной пос- ле до ва тельнос ти исс ле дуемо го участка ге на Omp19 штам мов бак те рии бру цел ла про ве ден с по мощью ком пью тер ных прог рамм Vector NTI Suite 9 с дан ны ми Ген бан ка.
Ре зульта ты и их об суж де ние
Внеш ние мембран ные бел ки бру цел лы бы- ли иден ти фи ци ро ва ны Dubray и Bezard в на ча ле 1980-ых и представ ле ны как по тен циальные им- му но ген ные и за щит ные ан ти ге ны [6].
В ли те ра тур ных ис точ ни ках вс тре чают ся пуб ли ка ции по соз да нию вак цин про тив бру цел- ле за на ос но ве дан ных бел ков [7, 5].
В дан ной ра бо те объек том исс ле до ва ния яв ляет ся бе лок внеш ней на руж ной мембра ны Omp19, ко то рый ис пользует ся при соз да нии вак ци ны про тив бру цел ле за и ха рак те ри зует ся как за щит ный и им му но ген ный бе лок.
С целью изу че ния ге на Omp19 штам мов бру- целл, вы де лен ных на тер ри то рии Рес пуб ли ки Ка за хс тан, был про ве ден ПЦР ана лиз.
На ри сун ке 1 представ ле ны ре зульта ты амп- ли фи ка ции фраг мен тов ДНК ге нов, ко ди рую- щий бе лок внеш ней мембра ны Omp19 штам мов воз бу ди те ля Brucella.
В ре зульта те про ве ден но го ПЦР ана ли за установ ле но, что раз ме ры ПЦР про дук та ге на Omp 19 соот ве тс твуют 544 п.о.
Исс ле до ва ния по срав ни тельно му ана ли- зу нук лео тид ных пос ле до ва тельнос тей участ- ка ге на Omp19 штам мов бак те рии Brucella abortus, вы де лен ных в Рес пуб ли ке Ка за хс тан, с имеющи ми ся дан ны ми меж ду на род но го бан ка
ге нов «GenBank» про во ди лось с по мощью ком- пью тер ной прог рам мы Vector NTI.
Ре зульта ты исс ле до ва ний по вы рав ни ва- нию и срав ни тельно му ана ли зу фраг мен тов ге- нов Omp19 штам мов бак те рии Brucella abortus с дан ны ми ген бан ка представ ле ны на ри сун ке 2.
Из ри сун ка 2 вид но, что срав ни ваемые пос- ле до ва тельнос ти штам мов, вы де лен ных в раз- лич ных ре гио нах, не от ли чают ся меж ду со бой и иден тич ны на 100%. Штамм Ала коль2 Brucella abortus, вы де лен ный в Тал ды кор ганском ре ги- оне Ал ма тинской об лас ти, штамм СКО Brucella abortus, вы де лен ный в Се ве ро-Ка за хс танской об лас ти, и штам мы Brucella abortus из Ген бан ка с ID но ме ра ми L27997, CP003176.1 и U35742.1 от ли чают ся от ос тальных штам мов на ли чием од ной нук лео тид ной за ме ны, A на G, в по зи ции 334, сте пень иден тич нос ти сос тав ляет 99%.
Выяв ле но, что ка за хс танские штам мы Brucella abortus от ли чают ся от штам мов из Ген- бан ка с ID но ме ра ми: Е017223.1, СР000887 на- ли чием мно же ст вен ных за мен в нук лео тид ной пос ле до ва тельнос ти.
Та ким об ра зом, в ре зульта те мо ле ку ляр но- ге не ти чес ких исс ле до ва нии штам мов Brucella abortus, вы де лен ных на тер ри то рии Рес пуб ли ки Ка за хс тан, по ге ну Omp19 бы ло выяв ле но, что дан ные штам мы имеют вы со кую го мо ло гич- нос ть меж ду со бой. Штамм Ала коль2 Brucella abortus, вы де лен ный в Тал ды кор ганском ре- ги оне Ал ма тинской об лас ти, и штамм СКО Brucella abortus, вы де лен ный в Се ве ро-Ка за хс- танской об лас ти, от ли чают ся на ли чием од ной нук лео тид ной за ме ны, сте пень иден тич нос ти сос тав ляет 99%.
Ли те ра ту ра
1 England T., Kelly 1, Jones RD, MacMillan A., Wooldridge M. A simulation model of brucellosis spread in British cattle under several testing regimes. // Prev Vet Med. – 2004. – V. 63 (1-2). – P. 63-73.
2 Hubalek Z., Scholz HC, Sedlacek I., Melzer F., Sanogo YO, Nesvadbova J. Brucellosis of the common vole (Microtus arva- lis) // Vector Borne Zoonotic Dis. – 2007. –V.7(4). – P.679-87.
3 Ре мен цо ва М.М. Эпи де ми оло гия и за да чи борьбы с бру цел ле зом // Зд ра во ох ра не ние Ка зах стана. 1988. – №2. – С.5-7.
4 Navarro E., Fernandez J. A., Escribano J. et al. PCR assay for diagnosis of human brucellosis. J. Clin. Microbiol. 1999. – V. 37. – P. 1654-1657.
5 Pasquevich K.A., Estein S.M., Garcia Samartino C., Zwerdling A., Coria L.M., Barrionuevo P., Fossati C.A., Giambartolo- mei G.H., Cassataro J. Immunization with recombinant Brucella spp. outer membrane proteins Omp16 or Omp19 in adjuvant induces specific CD41 and CD81 T cells as well as systemic and oral protection against Brucella abortus infection // Infect Immun. – 2008. – 77. – P. 436–445.
6 Dubray G., Bezard G. Isolation of three Brucella abortus cell wall anti-genes protective in murine experimental Brucellosis //
Ann. Rech. Vet. – 1980. – V. 11. – P. 367-373.
7 Аlexandrova G.I., Polezaev F.I., Budilovsky G.N., Garmashova L.M., Topuria N.F., Egorov A.Y., Romejko-Gurko Y.R., Koval T.A., Lisovakaya K.V., Klimov A.I., et al. Recombinant cold-adapted attenuated influenza A vaccines for use in chil- dren: reactogenicity and antigenic activity of cold-adapted recombinants and analysis of isolates from the vaccines // Infect Immun. – 1984. – V.44. – P.734-739.
References
1 England T., Kelly 1, Jones RD, MacMillan A., Wooldridge M. A simulation model of brucellosis spread in British cattle under several testing regimes. // Prev Vet Med. – 2004. – V. 63 (1-2). – P. 63-73.
2 Hubalek Z., Scholz HC, Sedlacek I., Melzer F., Sanogo YO, Nesvadbova J. Brucellosis of the common vole (Microtus arvalis) // Vector Borne Zoonotic Dis. – 2007. – V.7(4). – P.679-87.
3 Remencova M.M. Jepidemiologija i zadachi bor’by s brucellezom // Zdravoohranenie Kazahstana. 1988. – №2. – P.5-7.
4 Navarro E., Fernandez J. A., Escribano J. et al. PCR assay for diagnosis of human brucellosis. J. Clin. Microbiol. 1999. – V. 37. – P. 1654-1657.
5 Pasquevich K.A., Estein S.M., Garcia Samartino C., Zwerdling A., Coria L.M., Barrionuevo P., Fossati C.A., Giambartolomei G.H., Cassataro J. Immunization with recombinant Brucella spp. outer membrane proteins Omp16 or Omp19 in adjuvant induces specific CD41 and CD81 T cells as well as systemic and oral protection against Brucella abortus infection // Infect Immun. – 2008. – 77. – P. 436–445.
6 Dubray G., Bezard G. Isolation of three Brucella abortus cell wall anti-genes protective in murine experimental Brucellosis //
Ann. Rech. Vet. – 1980. – V. 11. – P. 367-373.
7 Alexandrova G.I., Polezaev F.I., Budilovsky G.N., Garmashova L.M., Topuria N.F., Egorov A.Y., Romejko-Gurko Y.R., Koval T.A., Lisovakaya K.V., Klimov A.I., et al. Recombinant cold-adapted attenuated influenza A vaccines for use in chil- dren: reactogenicity and antigenic activity of cold-adapted recombinants and analysis of isolates from the vaccines // Infect Immun. – 1984. – V.44. – P.734-739.