294
БИОЛОГИЯ
Б.К. КУРМАНОВ1, Р.И. БЕРСИМБАЙ1,4, Л.Б. ДЖАНСУГУРОВА1, А.И. ШИБАНОВА2, Ш. ЙАМАШИТА 3
РОЛЬ ПОЛИМОРФИЗМА ГЕНОВ СЕМЕЙСТВА ГЛУТАТИОН-S-ТРАНСФЕРАЗ В ПРЕДРАСПОЛОЖЕННОСТИ К РАЗВИТИЮ РАКА ПИЩЕВОДА НА ПРИМЕРЕ
КАЗАХСТАНСКИХ ПОПУЛЯЦИЙ
( 1Институт общей генетики и цитологии, Алматы) ( 2КазНИИ онкологии и радиологии, Алматы) ( 3Нагасакский университет, Нагасаки, Япония) ( 4Евразийский национальный университет им.Л.Н.Гумилева)
Изучена роль делеционного полиморфизма генов семейства глутатион-S-трансфераз (GSTM1 и GSTT1) в предрасположенности к развитию рака пищевода Установлено, что высокий риск развития рака пищевода связан с гомозиготным состоянием как GSTM1 (OR=8,078), так и GSTT1 (OR=3,447) генов.
В настоящее время уровень онкопатологий в Казахстане выше, чем в Европейском регионе и один из самых высоких среди Центрально-азиатских стран. При этом наиболее распространенными являются онкологические процессы, возникающие в постоянно обновляющихся тканевых системах, таких как эпителиальные ткани и ткани внутренней среды.
В структуре смертности от онкологических заболеваний рак пищевода занимает 4-е место.
Отмечается значительная неравномерность в географическом распределении заболевания, причем самые высокие показатели (в 3-5 раз выше среднего уровня) зарегистрированы в Китае, Иране и государствах Центральной и Средней Азии. В Казахстане, Туркменистане, Азербайджане и Киргизии рак пищевода занимает высокие позиции по частоте заболеваемости, в сравнении с другими видами рака его доля достигает 6-11%. Уровень заболеваемости раком пищевода в Казахстане и Туркменистане достигает 23,7-28,3 на 100 тыс. населения, что в 10-12 раз выше заболеваемости этим видом рака в Молдове, Украине и Белоруссии [1]. Отмечено, что наиболее высокие показатели встречаются у мужского населения, женщины болеют этим видом рака в 2-3 раза реже. Проблема усугубляется поздней диагностикой заболевания. Из всех заболеваний пищевода на долю рака приходится 70-90%. Рак пищевода чаще всего диагностируется в пожилом возрасте, в возрастной группе лиц старше 60 лет находится до 80% всех заболеваний раком пищевода.
Возникновению рака пищевода способствуют разнообразные факторы [2]. На территории с низким уровнем заболеваемости наибольшую роль играет курение и злоупотребление алкогольными напитками. В районах с высоким уровнем заболеваемости канцерогенный эффект связывают с приемом слишком горячей пищи и напитков, употреблением мелкокостной рыбы и жесткого мороженого мяса. Имеет значение однообразное питание с недостаточным потреблением фруктов и овощей, в результате чего в организме создается дефицит витаминов А, С и рибофлавина.
Факторами риска развития рака пищевода признаются систематический контакт с канцерогенными веществами, хроническое лучевое воздействие, чрезмерное механическое, термическое, химическое раздражение слизистой оболочки пищевода, рубцовое сужение пищевода после химических ожогов, его ахалазия, грыжа пищеводного отверстия диафрагмы, рефлюкс-эзофагит [3]. Хронический эзофагит создает условия для реализации токсического эффекта канцерогенных веществ, содержащихся в табачном дыме и поступающих в составе пищевых продуктов, что нередко сопровождается дисплазией эпителия слизистой оболочки пищевода.
Многочисленные факторы внешней и внутренней среды воздействуют на геном. Участие разных генов в развитии любой патологии далеко не одинаково. Практически для каждой болезни можно выделить главные гены, продукты которых играют ключевую роль в инициации
патологического процесса, и второстепенные, чьи продукты играют дополнительную роль.
Индивидуальные отличия в последовательностях генов, вовлеченных в реакцию организма на условия окружающей среды, могут играть большую роль в развитии предрасположенности к
295
мультифакторным заболеваниям. Активно изучается роль геномного полиморфизма в развитии рака пищевода [4].
Наиболее широка и многообразна активность семейства генов глутатион-S-трансфераз (GST), продукты которых участвуют во второй фазе детоксикации, метаболизируют тысячи ксенобиотиков и ряд эндогенных веществ. О важности этих ферментов свидетельствует их чрезвычайно широкая распространенность [5].
У человека можно выделить 4 наиболее важных подсемейства GST обозначаемые как GSTA (α), GSTM (μ), GSTT (θ) и GSTP (π). Каждое из этих подсемейств состоит из нескольких членов, обозначаемых арабскими цифрами (GSTA1, GSTA2 и т.п.). Для многих членов этих семейств GST генов характерно наличие полиморфизмов, значительно снижающих или полностью выключающих функциональную активность соответствующих белковых продуктов. Это может приводить к ряду заболеваний и патологических состояний.
Многие работы, посвященные изучению ассоциации полиморфизмов генов семейства GST с канцерогенным действием, указывают на важную роль делеционных полиморфизмов генов GSTM1 и GSTT1 [6, 7].
Целью нашей работы было изучить влияние делеционного полиморфизма GSTT1 и GSTM1 генов на развитие рака пищевода в казахстанской популяции.
Материалы и методы исследования
Материалом для исследования служили образцы EDTA-обработанной периферической крови и буккальные мазки 184 жителей г. Алматы, с нормальным и патологическим состоянием пищевода:
норма – 86 человек, эпидермоидная карцинома – 91 человек, аденокарцинома – 7 человек. Материал собирали на базе Казахского научно-исследовательского института онкологии и радиологии МЗ РК с согласия пациентов. Верификация клинических диагнозов проводилась гистологически на биопсийном материале.
ДНК выделяли стандартным фенол-хлороформным методом с модификациями в составе лизирующеего буфера для образцов периферической крови (0,2 M ацетата натрия и 1%
додецилсульфата натрия, pH 8,0) и буккальных мазков (0,02М EDTA; 0,02 М трис HCl, pH 8,0; 0,16 M NaCl; 0,5 % SDS).
Генотипирование GSTM1 и GSTT1 аллелей проводили в мультиплексном режиме ПЦР с использованием Taq-полимеразы (Sigma, США). По 20–50 нг ДНК амплифицировали в 20 мкл реакционной смеси, содержащей по 15 пкмоль специфических праймеров. В качестве внутреннего контроля реакции использовали амплификацию фрагмента гена -глобина. Продукты амплификации анализировали в 1,4% агарозном геле в присутствии бромистого этидия и визуализацией фрагментов в проходящем УФ-свете. -глобин дает одну полосу размером 268 п.н. Присутствие или отсутствие GSTM1 и GSTT1 генов определялось наличием (или отсутствием) полос в области 480 т.п.н. (GSTT1 ген) и 215 т.п.н. (GSTM1 ген), которые позволяли различить гомозиготную/гетерозиготную делецию от нормальной гомозиготы.
Статистический анализ ассоциации полиморфизма GSTT1 и GSTM1 генов выполнен с использованием метода χ2 в программах Software GraphPad Instat tm Copyrigh (V. 2.04.
Ralf Stahlman, Purdue University) и «Калькулятора для расчета статистики в исследованиях «случай- контроль»», предоставляемой сайтом компании «Тапотили» лаборатории молекулярной диагностики и геномной дактилоскопии Государственного Научного Центра Российской Федерации "ГосНИИ генетика" (http://www.tapotili.ru).
Результаты и их обсуждение
Для поиска ассоциации между делеционным полиморфизмом GSTT1 и GSTM1 генов и развитием рака пищевода проводили исследование методом «случай-контроль». На основе гистологического анализа биоптатов пищевода среди жителей г. Алматы, обращавшихся в КазНИИ онкологии и радиологии МЗ РК, была выделена группа больных (98 человек) 1920-1977 года рождения с диагнозами эпидермоидная карцинома пищевода (плоскоклеточный рак) и
аденокарцинома пищевода (мелкоклеточный рак). Среди пациентов с эпидермоидной карциномой диагностированы высоко- (6 случаев), умеренно- (34 случая) и низкодифференцированные (51 случай) варианты плосколеточного рака. Аденокарцинома Баррета была определена у 7 человек.
296
С учетом возраста, этнической принадлежности, пола и социального фактора (городское население) была подобрана контрольная группа здоровых людей (86 человек). Гистологический анализ показал нормальное состояние эпителия пищевода. Соответствие выбранных когорт представлено в таблице 1.
Таблица 1 Соответствие контрольной и исследуемой популяции больных раком пищевода
Когорта Год
рождения
Национальность, чел. (%) Пол, чел. (%) Всего, чел.
Казахи Русские Мужчин Женщин
Рак пищевода
1920-1977 88 (89,80) 10 (10,20) 45 (45,92) 53 (54,08) 98 Норма 1921-1976 76 (88,37) 10 (11,63) 37 (43,02) 49 (56,98) 86
Генотипирование образцов ДНК представителей контрольной и исследуемой популяции проводили методом мультиплексного ПЦР с применением специфических праймеров к GSTT1 и GSTM1 генам, а также к гену -глобин в качестве контроля реакции (рис. 1).
Рисунок 8 - Электрофореграмма
Рисунок 1 - Электрофореграмма амплифицированных аллельных вариантов GSTM1 и GSTT1 генов.
На рисунке 2 представлено распределение выявленных аллельных вариантов среди представителей изученных групп, выраженное через процент особей определенного генотипа в когорте.
а б
Рисунок 2 – Распределение аллельных вариантов полиморфизма гена GSTT1 (a) и GSTM1 гена (б) в изучаемых когортах
Распределение частот нормальных аллелей и делеций локусов генов детоксикации ксенобиотиков GSTT1 и GSTM1 в изученных популяциях соответствует распределению Харди- Вайнберга (GSTT1: χ2=15,61, p=8,0е-5; GSTM1: χ2=35,53, p=3,0е-9). Частота функционального аллеля GSTT1 в контрольной популяции составила 0,360, а для больных раком пищевода – 0,179, частота делеции этого локуса в контроле – 0,640, в случае рака - 0,821. Частота встречаемости функционального аллеля GSTM1 гена в контрольной популяции составила 0,506, в случае рака пищевода – 0,209, соответственно делеция GSTM1 гена встречалась с частотой 0,494 у здоровых людей и с частотой 0,791 у больных раком пищевода.
Сравнивая частоты делеций генов GST-семейства в казахстанских популяциях с данными, представленными в литературе [6], можно отметить, что в контрольной популяции жителей г.Алматы частота делеции GSTT1 гена довольно высока (0,640). Литературные данные свидетельствуют, что в
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
480 п.н.
268 п.н.
215 п.н.
GSTT1 GSTM1
297
популяциях азиатов (0,480-0,540) частота делеции этого гена выше чем в популяциях европейцев (0,160-0,385). Высокое распространение делеции GSTT1 гена в популяции здоровых доноров может быть обусловлено относительно небольшим объемом выборки (86 чел.). Возможно также, что делеция данного гена случайным образом сильно распространилась среди жителей г. Алматы.
Частота встречаемости делеции GSTM1 у здоровых жителей г. Алматы (0,494) не противоречит литературным данным, полученным при анализе азиатских (0,490-0,540) и европейских популяций (0,420-0,540).
Для оценки значения полиморфизма GST-генов в предрасположенности к развитию рака пищевода проведен статистический анализ с использованием χ2 –теста. Применено 2 варианта анализа: в первом случае гетерозиготные варианты генотипов объединены в одну группу с гомозиготными по минорному аллелю исследуемого локуса вариантами (доминантная модель), в другом – носители наиболее часто встречающегося аллеля (гомозиготы и гетерозиготы по нормальному аллелю) представляли одну группу, а гомозиготы по полиморфному аллельному варианту – другую (рецессивная модель). Все результаты анализа представлены в таблице 2.
Таблица 2 Относительный риск влияния полиморфизма генов GSTT1 и GSTМ1 на развитие рака пищевода в
популяциях жителей г. Алматы Вид
полиморфизма
Генотип Рак
пищевода, чел (%)
Контроль,
чел (%) OR CI (95%) χ2 P
GSTT1 +/+
4 (4,08) 11 (12,79) 0,318
0,173-0,582
14,70 0,00013 +/- 27 (27,55) 40 (46,51) 0,353 0,187-0,667
-/- 67 (68,37) 35 (40,70) 3,447 1,055-11,261 GSTT1
Доминантная модель
+/+ 4 (4,08) 11 (12,79) 0,290
0,089-0,948
4,64 0,03124 +/- и -/- 27+67=94
(95,92)
40+35=75
(87,21) 3,447 1,055-11,261 GSTT1
Рецессивная модель
+/+ и +/- 4+27=31 (31,63)
11+40=51 (59,30)
0,318
0,173-0,582
14,20 0,00016 -/- 67 (68,37) 35 (40,70) 3,149 1,719-5,769
GSTM1 +/+
4 (4,08) 22 (25,58) 0,063
0,019-0,203
32,61 1,125e-08 +/- 33 (33,67) 43 (50,00) 0,264 0,135-0,517
-/- 61 (62,25) 21 (24,42) 8,078 2,658-24,554 GSTM1
Доминантная модель
+/+ 4 (4,08) 22 (25,58) 0,124
0,041-0,376
17,45 0,00003 +/- и -/- 33+61=94
(95,92)
43+21=64
(74,42) 8,078 2,658-24,554 GSTM1
Рецессивная модель
+/+ и +/- 4+33=37 (37,75)
22+43=65
(75,58) 0,196 0,103-0,371
26,53 2,597e-07 -/- 61 (62,25) 21 (24,42) 5,103
2,692-9,672
Из представленных данных видно, что с развитием рака пищевода в изученных казахстанских популяциях проявляют достоверную ассоциацию «нулевые» генотипы (-/-) как по гену GSTТ1 (OR=3,447), так и по гену GSTM1 (OR=8,078).
Согласно литературным данным, гены глутатион-S-трансфераз, особенно GSTM1, вовлечены в патогенез различных раков и выступают в качестве модификаторов и факторов риска при самых различных заболеваниях, связанных с неблагоприятным действием факторов внешней среды.
Влияние полиморфизма GST-генов ассоциируется с развитием многочисленных злокачественных опухолей: рака легкого 8-10], мочевого пузыря 11, 12], прямой кишки 13], желудка 14, 15], пищевода 16], груди [17], яичников и кожи 18], а также лейкемии [19]. Выявлена ассоциация делеционного полиморфизма GST-генов с доброкачественными новообразованиями, такими как первичные опухоли мозга [20], аденома прямой кишки 18] и эндометриоз 21]. Есть работы, показывающие связь полиморфизма генов, кодирующих ферменты 2-ой фазы детоксикации, с хроническими и наследственными заболеваниями: хроническим бронхитом, бронхиальной астмой
22], гипертонией 23], ревматоидным артритом 24] и алкогольным циррозом 25].
298
Отмечено, что нулевой вариант гена GSTM1 предрасполагает к тем видам заболеваний, для которых имеет важное значение связь с мутагенными факторами (особенно курением, потреблением алкоголя, пищевыми злоупотреблениями и профессиональным вредом), в то время как для гена GSTT1 такая связь в большинстве случаев не характерна [18].
В нашей работе с высокой степенью достоверности показано, что высокий риск развития рака пищевода у жителей г.Алматы может быть связан с гомозиготным по делеции состоянием как GSTМ1 гена, так и GSTT1 гена. В условиях неблагополучной экологической ситуации г. Алматы отсутствие в генотипе функциональных генов глутатион-S-трансфераз должно быть тревожным сигналом. В связи с выявленной нами высокой ассоциативностью нулевого генотипа GSTМ1 гена, возможно, было бы интересно изучить влияние фактора курения на развитие рака пищевода у жителей г.Алматы. Однако, это не представляется возможным, поскольку информация о курении в анкетных данных представителей исследованных групп неполная.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Аксель Е.М., Давыдов М.И. Статистика заболеваемости и смертности от злокачественных новообразований в 2008 году.// Злокачественные новообразования в России и странах СНГ в 2008 г.// РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН. Москва. 2009. C.85-106.
2. Заридзе Д.Г. Канцерогенез.// Медицина. Москва 2004. С. 132-141.
3. Enzinger P.C., Mayer R.J. Esophageal Cancer.// N Engl J Med. 2003. V.349. P.2241-2252.
4. Hiyama T., Yoshihara M., Tanaka S., Chayama K. Genetic polymorphisms and
5. Wilce M.C.J., Parker M.W. Structure and function of glutathione S-transferases.// Biochim. Biophys.
Acta. 1994. V.1205. P.1–18.
6. Their R., Bruning T., Roos P.H., et al. Markers of genetic susceptibility in human environmental hygiene and toxicology: the role of selected CYP, NAT, GST genes.// Int J Hyg Environ Health. 2003.
V.206. P.149–171.
7. Landi S. Mammalian class theta GST and differential susceptibility to carcinogens: a review.// Mutat Res. 2000. V.463. P.247-283.
8. Seidegard J., Pero R.W., Markowitz M.M., Roush G. et al. Isoenzyme(s) of glutathione transferase (class A) as a marker for the susceptibility to lung cancer: a follow up study // Carcinogenesis. 1990, Vol.11, P.33-36.
9. Saarikoski S.T., Voho A., Reinikainen M., et al. Combined effect of polymorphic GST genes on individual susceptibility to lung cancer.// Int J Cancer. 1998. V.77. P.516-521
10. Nazar-Stewart V., Vaughan T.L., Stapleton P., Van Loo J., Nicol-Blades B., and Eaton D.L. A population-based study of glutathione S-transferase M1, T1 and P1 genotypes and risk for lung cancer //
Lung Cancer. 2003, V.40, P.247-258.
11. Kempkes M., Golka K., Reich S., Reckwitz T. et al. Glutathione S-transferase GSTM1 and GSTT1 null genotypes as potential risk factors for urothelial cancer of the bladder // Arch. Toxicol. 1996, V.71, P.123-126.
12. Okkels H., Sigsgaard T., Wolf H. and Autrup H. Glutathione S-transferase M as a risk factor in bladder tumors // Pharmacogenetics. 1996, V.6, P.251-256.
13. Seow A., Yuan J.M., Sun C.L. et al. Dietary isothiocyanates, glutathione S-transferase polymorphisms and colorectal cancer risk in the Singapore Chinese Health Study.// Carcinogenesis. 2002. V.23(12).
P.2055-2061.
14. Setiawan V.W., Zhang Z.F., Yu G.P. et al. GSTT1 and GSTM1 null genotypes and the risk of gastric cancer: a case-control study in a Chinese population.// Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 2000. V.9.
P.73–80.
15. Tamer L., Ates N.A., Ates C., Ercan B., Elipek T., Yildirim H., Camdeviren H., Atik U., Aydin S.
Glutathione S-transferase M1, T1 and P1 genetic polymorphisms, cigarette smoking and gastric cancer risk.// Cell Biochem Funct. 2005. V.23(4). P.267-272.
16. Abbas A., Delvinquiere K., Lechevrel M. et al. GSTM1, GSTT1, GSTP1 and CYP1A1 genetic polymorphisms and susceptibility to esophageal cancer in a French population: different pattern of squamous cell carcinoma and adenocarcinoma.// World J Gastroenterol. 2004. V.10(23). P.3389-3393.
17. Park S.K., Yoo K.Y., Lee S.J. et al. Alcohol consumption, glutathione S-transferase M1 and T1 genetic polymorphisms and breast cancer risk // Pharmacogenetics. 2000, Vol.10, P.301.
18. Strange R.C. and Fryer A.A. The Glutathione S-Transferases: Influence of Polymorphism on Cancer Susceptibility // IARC Scientific Publications, IARC, Lyon. 1999, P. 231-249.
299
19. Little M.P., Charles M.W., Wakeford R. A review of the risks of leukaemia in relation to parental pre- conception exposure to radiation // Health Phys. 1995, V.68, P.299-310.
20. Pinarbasi H., Silig Y., Gurelik M. Genetic polymorphisms of GSTs and their association with primary brain tumor incidence.// Cancer Genet Cytogenet. 2005. V.156(2). P.144-149.
21. Baranova H., Bothorishvili R., Canis M., Albuission E., et al. Glutation-S-transferase M1 gene polimirphism and susceptibility to endometriosis in a Franch population // Mol. Hum. Reprod. 1997, V.
3, № 9, P. 775-780.
22. Gilliland F.D., Li Y.F., Saxon A., Diaz-Sanchez D. Effect of glutathione-S-transferase M1 and P1 genotypes on xenobiotic enhancement of allergic responses: randomised, placebo-controlled crossover study.// Lancet. 2004. V.363. P.119-125.
23. Saadat M., Dadbine-Pour A. Influence of polymorphism of glutathione S-transferase M1 on systolic blood pressure of normotensive individuals.// Biochem Biophys Res Commun. 2005. V.326(2). P.449- 454.
24. Yun B.R., El-Sohemy A., Cornelis M.C., Bae S.C. Glutathione S-transferase M1, T1, and P1 genotypes and rheumatoid arthritis.// J Rheumatol. 2005. V.32(6). P.992-997.
25. Афанасьева И.С., Спицын В.А. Наследственный полиморфизм глутатион-S-трансферазы печени человека в норме и при алкогольном гепатите. // Генетика. 1990, Т.26, №7, С. 1309-1315.
Өңеш ісік ауруына бейімделуде глутатион-S-трансфераза гендер жүйесі полиморфизмінің рөлі
Глутатион S-трансфераза - GSTT1 және GSTM1 - гендер жүйесінің делециялық полиморфизмі мен өңеш ісік ауруының арасындағы байланыстар зерттелді. Бұл зерттеулер біріші рет Қазақстан популяциясында жүргізілді. Алынған мәліметтер бойынша гомозиготалық GSTM1 (OR=8,078) және GSTT1 (OR=3,447) гендер жүйесінің делециялық полиморфизмі адамдардың өңеш ісік ауруына қауіпті екендігі анықталды.
The role of polymorphism of gluthatione-S-transferase genes in predisposition to esophagus carcinoma in Kazakhstan population
An association of gluthatione-S-transferase GSTM1 and GSTT1 gene polymorphism and esophagus cancer in Kazakhstan population was analysed. The statistically significant association of homozygous GSTM1 (OR=8,078) and GSTT1 (OR=3,447) genes with disease was shown.
