http://myjms.mohe.gov.my/index.php/bsk
Copyright © 2021 Faculty of Health Science UKM. All right reserved Artikel Asli/Original Article
Kerintangan Sista Acanthamoeba spp. Isolat Klinikal terhadap Larutan Disinfektan Kanta Sentuh Opti-Free® Express® & Complete™
Resistance of Clinically Isolated Acanthamoeba cysts towards Opti-Free® Express® &
Complete™ Contact Lens Disinfecting Solutions
NOR ZALILAH MOHD NORDIN, MOHAMED KAMEL ABD GHANI, ANISAH NORDIN, YUSOF SUBOH
& NORAINA AB RAHIM
ABSTRAK
Acanthamoeba adalah ameba hidup bebas yang menyebabkan jangkitan mata yang serius dan boleh menyebabkan kebutaan dipanggil keratitis Acanthamoeba. Jangkitan ini biasanya berlaku dalam kalangan individu yang memakai kanta sentuh. Penggunaan larutan disinfektan kanta sentuh yang tidak berkesan terhadap sista Acanthamoeba meningkatkan risiko jangkitan. Terdapat kajian yang menunjukkan wujudnya kerintangan Acanthamoeba spp.
terhadap agen antimikrob, pencuci enzimatik dan disinfektan kimia. Oleh itu, objektif kajian ini adalah untuk menguji keberkesanan larutan disinfektan kanta sentuh Opti-Free® Express® dan Complete™ terhadap sista Acanthamoeba. Penentuan keberkesanan larutan disinfektan tersebut mengikut masa rendaman yang disyorkan pengeluar, 4, 6 dan 8 jam. Empat isolat klinikal Acanthamoeba digunakan adalah HKL 11, HKL 51, HKL 32 dan HKL 5. Suspensi sista sebanyak 10µl daripada 105 sel/ml daripada setiap pencilan diuji dalam larutan disinfektan masing-masing. Selepas 4 jam hingga 8 jam, larutan disinfektan diemparkan dan sedimen yang tinggal akan dikulturkan ke atas agar bukan nutrien yang dilapisi E. coli. Plat agar diperhati setiap hari di bawah mikroskop keterbalikan untuk melihat kehadiran trofozoit Acanthamoeba. Kehadiran trofozoit Acanthamoeba menunjukkan bahawa sista telah berjaya menjalani proses eksistasi yang bermakna larutan disinfektan kanta sentuh adalah tidak berkesan. Larutan disinfektan kanta sentuh Opti-Free® Express® dan Complete™ tidak menunjukkan keberkesanan terhadap kesemua 4 isolat klinikal Acanthamoeba pada masa yang disyorkan pengeluar mahupun pada masa rendaman 4, 6 dan 8 jam. Kajian menunjukkan lebih banyak larutan disinfektan kanta sentuh yang tidak berkesan terhadap sista Acanthamoeba berbanding dengan yang berkesan.
Kata kunci: Acanthamoeba, larutan disinfektan kanta sentuh, Opti-Free® Express®, Complete™, Malaysia
ABSTRACT
Acanthamoeba is a free-living amoeba that can cause serious eye infection leading to blindness known as Acanthamoeba keratitis. The infection usually occurs amongst individuals wearing contact lenses. The use of contact lens disinfecting solution not effective against the Acanthamoeba cysts increases the risk for infection. There have been many studies indicating the resistance of Acanthamoeba cyst towards certain antimicrobial agents, enzymatic disinfectant and chemical disinfectant. Therefore, this study was performed to evaluate the efficacy of contact lens disinfecting solutions comprising Opti-Free® Express® & Complete™, against the cysts of Acanthamoeba. This study also investigates the effectiveness of the disinfecting solutions based on the soaking time recommended by manufacturers, 4 hours, 6 hours and 8 hours. Four clinical isolates of Acanthamoeba were tested in this study comprising HKL 11, HKL 51, HKL 32 and HKL 5. Ten microliter of cysts suspension (105 cells/ml) was tested on the disinfectant solution respectively. After an interval varying from 4 hours to 8 hours, the solutions were centrifuged and then the sediment was inoculated onto non nutrient agar lawn with E. coli. The plates were examined daily using inverted microscope for the emergence of Acanthamoeba trophozoites. The presence of Acanthamoeba trophozoites indicates that the cysts had successfully undergone excystation process denoting that the disinfecting solution is not effective. Opti-Free® Express® & Complete™ contact lens disinfecting solutions were not effective against all 4 isolates of Acanthamoeba cysts based on time recommended by manufacturers, 4 hours, 6 hours and even 8 hours soaking time. This study shows that there are more contact lens disinfecting solutions not effective against Acanthamoeba cysts compared to those that are effective.
Keywords: Acanthamoeba, contact lens disinfecting solution, Opti-Free® Express®, Complete™, Malaysia
PENGENALAN
Acanthamoeba spp. merupakan organisma oportunistik yang menjadi agen penyebab kepada penyakit keratitis Acanthamoeba, iaitu sejenis infeksi mata yang dimanifestasikan dengan keradangan dan rasa sakit yang teruk pada mata (Ma et al. 1990). Kes keratitis yang pertama di United Kingdom dilaporkan pada tahun 1973 (Nagington et al. 1974), manakala kes keratitis Acanthamoeba yang pertama berlaku di Malaysia dilaporkan oleh Kamel & Norazah (1995). Kes ini melibatkan seorang wanita pemakai kanta sentuh.
Walaupun kes keratitis Acanthamoeba jarang berlaku, namun terdapat kebimbangan kerana peningkatan kes keratitis Acanthamoeba dikaitkan dengan meningkatnya populasi pemakai kanta sentuh (Schaumberg et al.
1998). Kebenaran ini dapat dibuktikan dengan peningkatan bilangan kes keratitis Acanthamoeba di Malaysia sejajar dengan peningkatan penggunaan kanta sentuh (Mohamed Kamel et al. 2018). Antara faktor risiko mendapat jangkitan ini adalah disebabkan terdapat kehadiran Acanthamoeba spp. pada peralatan kanta sentuh, penjagaan kanta sentuh yang tidak betul dan tidak higenik serta jarang melakukan disinfeksi kanta sentuh (Radford et al. 2002). Maka larutan disinfektan kanta sentuh yang berfungsi sebagai disinfektan kepada kanta sentuh sepatutnya dapat melindungi sebarang kontaminasi mikroorganisma yang memainkan peranan yang penting untuk mengawal penularan jangkitan keratitis Acanthamoeba ini.
Pemilihan larutan disinfektan kanta sentuh haruslah sesuai dengan jenis kanta sentuh yang digunakan dan bergantung kepada jenis bahan aktif yang terdapat di dalam larutan tersebut. Tambahan pula tidak semua larutan disinfektan yang terdapat di pasaran sekarang menyatakan samada ia telah diuji berkesan terhadap Acanthamoeba spp. Tambahan pula, sememangnya pelesenan larutan disinfektan kanta sentuh tidak memerlukan pembuktian keberkesanannya terhadap Acanthamoeba. Maka kajian ini dijalankan untuk menguji keberkesanan dua larutan disinfektan kanta sentuh yang terdapat di pasaran negara terhadap sista Acanthamoeba spp. Opti-Free® Express® dan Complete™ adalah antara jenama larutan disinfektan kanta sentuh yang mudah terdapat di pasaran dan juga popular dalam kalangan pengguna kanta sentuh.
Penggunaan sista berbanding trofozoit adalah kerana peringkat sista telah diketahui sebagai peringkat yang lebih resistan.
BAHAN DAN KAEDAH
SUMBER Acanthamoeba
Acanthamoeba spp. diperolehi dari Makmal Kultur Acanthamoeba, Jabatan Parasitologi, Fakulti Perubatan, Universiti Kebangsaan Malaysia. Empat isolat klinikal yang berasal daripada kes keratitis Acanthamoeba diperoleh dan disubkultur selama 14 hari untuk mendapatkan sista.
SUMBER LARUTAN DISINFEKTAN KANTA SENTUH
Larutan disinfektan kanta sentuh yang digunakan dalam kajian ini adalah Opti-free® Express® dan CompleteTM yang mudah terdapat di pasaran dan digunakan secara meluas di seluruh negara.
UJIAN KEBERKESANAN
Metodologi ujian ini adalah mengikut kaedah Narasimhan et al. (2002). Suspensi sista yang disediakan divorteks selama 1 minit supaya sista bertabur rata dalam suspensi yang dibuat. Sebanyak l ml larutan disinfektan dimasukkan ke dalam tiub apendof bersama 10 µl suspensi sista dan dibiarkan selama masa ujian. Campuran dibiarkan selama 4 jam, 8 jam dan selama masa yang disyorkan pengeluar.
Dua kawalan positif dijalankan iaitu kawalan positif suspensi sista yang disediakan dengan sista dalam larutan salin page manakala kawalan positif untuk ujian adalah dengan mendedahkan sista kepada hidrogen peroksida 3%. Kawalan positif dijalankan untuk memastikan bahawa sista yang digunakan adalah sista yang viable atau hidup. Bagi kawalan negatif pula, larutan salin page dan larutan disinfektan tanpa adanya sista Acanthamoeba digunakan. Kawalan negatif dijalankan bagi mempastikan tiada kontaminasi berlaku.
Kajian dijalankan secara duplikat.
Selepas dibiarkan dalam selang masa rendaman, campuran dalam tiub apendof tersebut diemparkan pada halaju 5000 rpm selama 10 minit. Kemudian supernatan dibuang. Sedimen dibilas dengan larutan salin page untuk menyingkirkan larutan disinfektan yang terdapat di sekeliling sista. Sedimen dalam tiub dipindahkan ke atas agar bukan nutrien yang diinokulasi dengan E. coli dan diinkubasi pada suhu 30ºC selama semalaman.
Kemudian agar diperhatikan di bawah mikroskop keterbalikan untuk melihat kehadiran trofozoit yang bertukar daripada sista. Pemerhatian kultur agar dilakukan selama 14 hari sebelum mengesahkannya sebagai negatif.
HASIL KAJIAN
KEBERKESANAN LARUTAN DISINFEKTAN KANTA SENTUH TERHADAP SISTA
Acanthamoeba ISOLAT KLINIKAL
Ujian keberkesanan bagi larutan disinfektan kanta sentuh Opti-free® Express® dan CompleteTM dijalankan terhadap sista Acanthamoeba daripada kesemua 4 isolat klinikal. Kehadiran trofozoit pada plat agar selepas 24 jam diinkubasi dicatatkan sebagai positif yang
menunjukkan bahawa larutan disinfektan tidak mempunyai kesan sistisidal manakala agar yang didapati tiada pertumbuhan trofozoit setelah 14 hari diperhatikan, dicatatkan sebagai negatif menunjukkan larutan disinfektan mempunyai kesan sistisidal.
JADUAL 1 Keberkesanan larutan disinfektan kanta sentuh terhadap sista Acanthamoeba isolat klinikal
Masa Rendaman/jam
CompleteTM Opti-free® Express®
4* 6 8 4 6* 8
HKL51 + + + + + +
HKL32 + + + + + +
HKL11 + + + + + +
HKL5 + + + + + +
Petunjuk:
+ Kehadiran trofozoit Acanthamoeba (Disinfektan tidak berkesan) - Tiada trofozoit Acanthamoeba (Disinfektan berkesan)
* Masa rendaman yang disyorkan oleh pengeluar Kedua-dua larutan disinfektan kanta sentuh iaitu Complete TM dan Opti-free® Express® didapati tidak dapat membunuh kesemua sista empat isolat klinikal Acanthamoeba dalam kesemua masa rendaman yang ditetapkan.
KAWALAN POSITIF DAN NEGATIF Jadual 2 dan 3 menunjukkan keputusan kawalan bagi ujian keberkesanan larutan disinfektan kanta sentuh terhadap sista Acanthamoeba sp. Bagi kawalan positif sista, didapati sista yang digunakan masih viabel. Bagi kawalan positif ujian, dimana suspensi sista didedahkan kepada hidrogen peroksida 3% menunjukkan semua sista yang diuji berjaya dibunuh. Manakala bagi kawalan negatif pula menunjukkan tiada Acanthamoeba dikesan di dalam larutan PAS dan juga bagi setiap larutan kanta sentuh yang diuji. Ini menunjukkan larutan
PAS dan larutan disinfektan kanta sentuh adalah dalam keadaan baik dan tiada sebarang kontaminasi.
PERBINCANGAN
Opti-Free® Express® mengandungi bahan aktif POLYQUAD (polidronium chloride) 0.001% dengan kombinasi ALDOX (myristamidopropyl dimethylamine) 0.0005%. Larutan ini dinyatakan berkesan terhadap Acanthamoeba sp. oleh pengeluarnya. Tambahan pula ALDOX mempunyai kesan yang boleh meyebabkan kemusnahan sel dengan mempenetrasi dinding sel sista Acanthamoeba. Menurut kajian yang dilakukan oleh Codling et al. (2003), didapati myristamidopropyl dimethylamine mempunyai aktiviti yang boleh menyebabkan kematian sel A.
castelanii yang tinggi.
JADUAL 2 Keputusan kawalan bagi ujian keberkesanan larutan disinfektan kanta sentuh
Isolat
Kawalan
Positif Negatif
Suspensi sista 3 % H2O2 Larutan PAS
HKL 5 + - -
HKL 11 + - -
HKL 32 + - -
HKL 51 + - -
Petunjuk:
+ Kehadiran trofozoit Acanthamoeba (sista viabel) - Tiada trofozoit Acanthamoeba
H2O2 Hidrogen peroksida PAS Page amebic saline
JADUAL 3 Keputusan kawalan negatif larutan disinfektan kanta sentuh
Jenama Pemerhatian
CompleteTM -
Opti-free® Express® - Petunjuk:
- Tiada trofozoit Acanthamoeba (tiada kontaminasi)
Namun hasil kajian ini menunjukkan Opti-Free®
Express® adalah tidak berkesan dalam membunuh sista Acanthamoeba bagi kesemua empat isolat klinikal yang diuji. Keputusan yang sama didapati oleh Niszl dan Markus (1995), bahawa POLYQUAD 0.001% adalah tidak berkesan terhadap sista Acanthamoeba dalam masa 4 hingga 8 jam. Menurut Borajzani dan Kilvington (2005), Opti-Free® Express® menunjukkan bahawa terdapat pengurangan trofozoit Acanthamoeba sp.
apabila diuji pada masa yang disyorkan pengeluar tetapi ia adalah tidak berkesan terhadap sista Acanthamoeba sp.
Dalam kajian ini, larutan Complete™ yang mengandungi bahan aktif utamanya polyhexamethylene bigunide (PHMB) 0.0001% adalah tidak berkesan terhadap kesemua isolat Acanthamoeba sp. yang diuji.
Keputusan ini disokong oleh Putri et al. (2007) dan Mohamed Kamel et al. (2016) di mana PHMB pada kepekatan 0.0001% tidak dapat membunuh sista Acanthamoeba.
Hasil yang didapati oleh Hiti et al. (2002) menunjukkan satu daripada strain sista Acanthamoeba yang diuji dapat dibunuh oleh PHMB pada kepekatan 0.0005%. Tetapi ia berbeza dengan hasil kajian Kilvington (1990) yang menunjukkan walaupun pada kepekatan PHMB 0.0005% ia masih tidak dapat membunuh sista Acanthamoeba.
Menurut Larkin et al. (1992), PHMB pada kepekatan yang lebih tinggi seperti pada kepekatan 0.02% adalah berkesan dalam merawat keratitis Acanthamoeba. Hal ini adalah kerana PHMB adalah agen antiseptik kationik yang berkebolehan dalam merencatkan fungsi membran dan seterusnya dapat memberi kesan dalam membunuh trofozoit dan sista Acanthamoeba.
Sesetengah larutan disinfektan adalah tidak berkesan terhadap Acanthamoeba samada pada masa rendaman yang disyorkan pengeluar bahkan pada masa rendaman yang lebih lama daripada itu. Antara sebab perkara ini boleh berlaku adalah kerana kebanyakan larutan disinfektan kanta sentuh yang dipasarkan, adalah tidak diuji akan keberkesanannya terhadap Acanthamoeba terlebih dahulu. Kebanyakannya hanya
diuji keberkesanannya terhadap bakteria ataupun fungus sahaja (Seal et al. 1999) disebabkan tiadanya kaedah piawai ditetapkan untuk pengujian larutan ini terhadap Acanthamoeba (ISO 2001).
Selain itu, faktor perbezaan spesies Acanthamoeba walaupun dari kumpulan genus yang sama, boleh mempengaruhi hasil kajian. Selain itu, isolat klinikal biasanya lebih rentan berbanding isolat persekitaran.
Hal ini adalah kerana isolat klinikal Acanthamoeba sering terdedah kepada pelbagai jenis agen antimikrob yang mana akan menggalakkan Acanthamoeba untuk beradaptasi dengan tindakan mekanisme pelbagai jenis antimikrob dan akhirnya menyebabkan kerintangan berlaku secara beransuran.
Perbezaan dari segi kaedah yang digunakan juga mungkin boleh menyumbang kepada terdapatnya perbezaan keberkesanan larutan disinfektan berbanding kajian yang dilakukan sebelumnya. Kajian ini menggunakan kaedah pengkulturan bagi mendapatkan sista secara monoxenic iaitu cara konvensional melalui pengkulturan Acanthamoeba di atas plat agar yang dilapisi dengan E. coli. Berbeza dengan kaedah axenic yang menggunakan agar yang telah diperkaya dengan kandungan nutrien. Kaedah axenic lebih mudah menyebabkan kontaminasi dan sista yang berasal daripada strain makmal yang telah berada dalam kultur axenic untuk tempoh masa yang lama, adalah lebih sensitif kepada disinfektan dan agen terapeutik berbanding sista yang berasal daripada pencilan asalnya (Hughes et al. 2003).
Kematangan sista yang digunakan dalam kajian juga boleh memberi kesan terhadap ujian keberkesanan yang dijalankan. Sista yang tidak matang adalah lebih sensitif kepada disinfektan berbanding dengan sista yang matang kerana terdapat perbezaan ketebalan dinding sista yang berkembang menjadi semakin menebal apabila sista semakin matang. Dengan ini, bahan kimia lebih sukar menembusi dinding sista yang lebih tebal (Niszl & Markus 1998).
KESIMPULAN
Kajian ini menunjukkan larutan disinfektan kanta sentuh Opti-Free® Express® dan Complete™ adalah tidak berkesan membunuh sista Acanthamoeba isolat klinikal yang diuji pada masa yang disyorkan pengeluar dan pada masa rendaman 4, 6 dan 8 jam. Sista Acanthamoeba isolat klinikal yang diuji telah menunjukkan kerintangan terhadap larutan disinfektan kanta sentuh yang diuji.
PENGHARGAAN
Setinggi penghargaan diucapkan kepada kakitangan teknikal makmal Sains Bioperubatan yang telah membantu dalam aspek teknikal kajian ini
REFERENCES
Borazjani, R. N. & Kilvington, S. 2005. Efficacy of Multipurpose Solutions Against Acanthamoeba Species. Cont. Lens Anterior Eye 28:169–175.
Codling, C. E., Maillard, J. Y. & Rusell, A. D. 2003.
Aspects of the Antimicrobial Mechanism of Action of Polyquaternium and an Amidoamine.
Antimicrob. Agents Chemother. 51(5): 1153-1158.
Hiti, K., Walochnik, J., Haller-Schober, E. M., Faschinger, C. & Aspock, H. 2002. Viability of Acanthamoeba after Exposure to a Multipurpose Disinfecting Contact Lens Solution and Two Hydrogen Peroxide Systems. Br. J. Ophthalmol. 86:
144-146.
Hughes, R., Heaselgrave, W. & Kilvington, S. 2003.
Acanthamoeba Polyphaga Strain Age and Method of Cyst Production Influence the Observed Efficacy of Therapeutic Agents and Contact Lens Disinfectants. Antimicrob. Agents Chemother.
47(10): 3080-3084.
International Organization for Standardization. 2001.
Ophthalmic Optics-Contact Lens Care Products- Microbiological Requirements and Test Methods for Products and Regiments for Hygienic Management of Contact Lenses. ISO/CD 14729.
Geneva: International Organization for Standardization.
Kamel, A. G. M. & Norazah, A. 1995. First Case of Acanthamoeba Keratitis in Malaysia. Trans. R. Soc.
Trop. Med. Hyg. 89: 652.
Kilvington, S. 1990. Activity of Water Biocide Chemicals and Contact Lens Disinfectant on Pathogenic Free-Living Amoebas. Int. Biodeter. 26:
127-138.
Larkin, D. F. P., Kilvington, S. & Dart, J. K. G. 1992.
Treatment for Acanthamoeba Keratitis with Polyhexamethylene Biguanide. Ophthalmol. 99:
185-191.
Ma, P., Visvesvara, G. S., Martinez, A. J., Theodore, F.
H., Daggett, P. M. & Sawyer, T. K. 1990.
Naegleria and Acanthamoeba Infection: Review.
Rev. Infect. Dis. 12: 490-513.
Mohamed Kamel Abd Ghani, Ee Chin Liew, Anisah Nordin, Yusof Suboh, Noraina Ab Rahim Norazah Ahmad & Wan Omar Abdullah. 2016. Viability of Acanthamoeba after Exposure to Multipurpose Contact Lens Disinfecting Solutions. Int. Med. J.
23:5;509-11.
Mohamed Kamel Abd Ghani, Irdawati Azhar, Haliza Abdul Mutalib, Anisah Nordin, Yusof Suboh, Noraina Ab Rahim & Norazah Ahmad. 2018.
Acanthamoeba Keratitis in Malaysia. Sains Malays.
47(7): 1563–1569.
Nagington, J., Watson, P. G., Playfair, T. J., McGill, J., Jones, B. R. & Steele, A. D. 1974. Amoebic Infection of the Eye. Lancet 2: 1537-1540.
Narasimhan, S., Madhavan, H. & Lily Therese, K. 2002.
Development and Application of an In Vitro Susceptibility Test for Acanthamoeba Species Isolated from Keratitis to Polyhexamethylene Biguanide and Chlorhexidine. Cornea 21(2): 203- 205
Niszl, I. A. & Markus, M. B. 1998. Anti-Acanthamoeba Activity of Contact Lens Solutions. Br. J.
Ophthalmol. 82: 1033-1038.
Niszl, I. A., Markus, M. B. & Van Deventer, J. M. G.
1995. Anti-Mastigina Activities of Eight Contact Lens Solutions. Antimicrob. Agents Chemother.
39(10): 2364-2366.
Radford, C. F., Minassian, D. C., & Dart, J. K. G. 2002.
Acanthamoeba Keratitis in England and Wales:
Incidence, Outcome and Risk Factors. Br. J.
Ophthalmol. 86: 536-542.
Schaumberg, D. A., Snow, K. K. & Dana, M. R. 1998.
The Epidemic of Acanthamoeba Keratitis: Where Do We Stand? Cornea 17: 3-10.
Seal, D., Dalton, A. & Doris, D. 1999. Disinfectant of Contact Lenses without Tap Water Rinsing: Is It Effective? Eye 13:226-230.
Nor Zalilah Mohd Nordin Anisah Nordin,
Yusof Suboh Noraina Ab Rahim
Program Sains Bioberubatan
Fakulti Sains Kesihatan
Universiti Kebangsaan Malaysia Jalan Raja Muda Abdul Aziz
50300 Wilayah Persekutuan Kuala Lumpur Malaysia
Mohamed Kamel Abd Ghani
Pusat Kajian Diagnostik, Teraputik dan Penyiasatan Fakulti Sains Kesihatan
Universiti Kebangsaan Malaysia Jalan Raja Muda Abdul Aziz
50300 Wilayah Persekutuan Kuala Lumpur Malaysia
Anisah, N.
Jabatan Parasitologi & Entomologi Perubatan Fakulti Perubatan
Universiti Kebangsaan Malaysia Jalan Yaacob Latif, Bandar Tun Razak 56000 Wilayah Persekutuan Kuala Lumpur Malaysia
Pengarang berutusan: Mohamed Kamel Abdul Ghani
E-mail: [email protected], [email protected] Tel: 03-92897634
Fax: 03-26929032
Diterima: 12 Februari 2021 Diperbaiki: 5 Mac 2021
Diterima untuk diterbitkan: 7 May 2021
