蒙古色楞格省森林地区蜱自然感染嗜吞噬细胞无形体现况

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短篇报道

WPSAR Vol 5, No 1, 2014 | doi: 10.5365/wpsar.2013.4.3.001

www.wpro.who.int/wpsar 1

a 蒙古国立农业大学兽医研究所分子遗传学实验室，蒙古乌兰巴托。

b

国家人兽共患病中心病毒实验室，蒙古乌兰巴托。

投稿日期：2013年7月26日；发表日期：2014年3月5日

doi: 10.5365/wpsar.2013.4.3.001

嗜

吞噬细胞无形体 (

A n a p l a s m a phagocytophilum) 是一种革兰氏阴性、

专性细胞内生长的细菌，很早以前就被认为是一种动物病原体

^{[ 1 ]}

，最近发现其也可以感染人类。人粒细胞无形体病(Human granulocytic

anaplasmosis，HGA)于1994年首先报告于美国 ^[2]

，自那以后嗜吞噬细胞无形体被认为是有公共卫生意义的新发传染病病原体

^[3]

。HGA的特点是：头痛、畏寒、

肌痛、关节痛、全身乏力，以及血象异常，如血小板减少、白细胞减少、转氨酶升高

^[4]

。嗜吞噬细胞无形体通过蜱-啮齿动物循环维持自然传播，人作为终末宿主(dead-end hosts)偶然感染发病

^[5]

。

在蒙古地方性流行区，牲畜是嗜吞噬细胞无形体的重要宿主。中亚地区首次对人感染嗜吞噬细胞无形体的血清流行率调查结果显示，色楞格省为

2.3

％，

布尔干省为

5.6

％，东戈壁省

2.8

％，中央省和乌兰巴托均为

3.0

％

^[6]

。

本研究的目的是调查蒙古色楞格省森林地区蜱媒嗜吞噬细胞无形体的感染现况。

方法

在蒙古色楞格省与俄罗斯接壤的阿勒坦布拉格和库德

2个地区采集未进食的蜱。选择这些地区作为研究对

象，是因为它们有森林地区且蜱分布广泛。对蜱进行种属鉴定，使用前活蜱在4°C条件下保藏。蜱标本 (3–5只蜱) 用液氮冻存和捣碎，然后使用G-spin基因

蒙古色楞格省森林地区蜱自然感染嗜吞噬细胞无形体现况

Javkhlan G ^a

，Enkhtaivan B

^a

，Baigal B

^b

，Myagmarsuren P

^a

，Battur B

^a

和Battsetseg B

^a

通讯作者：Battsetseg Badgar (e-mail: bata07@gmail.com)。

组

DNA

提取试剂盒(韩国

iNrRON

生物技术公司)提取

DNA

。

开展聚合酶链反应(PCR)，采用groEL PCR限制性片段长度多态性检测并测序分析

^[7]

。引物设计针对编码嗜吞噬细胞无形体热休克蛋白的部分

groEL基

因，检测嗜吞噬细胞无形体和扁平无形体分别使用

EphplgroELF(5'–ATGGTATGCAGTTTGATCGC-3')和 EphplgroELR(5'–TCTACTCTGTCTTTGCGTTC-3')，预

期可以扩增出625个碱基对的基因序列。PCR扩增采用Maxime PCR PreMix试剂盒(韩国iNrRON生物技术公司)。所有PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳分离、溴化乙锭染色并在紫外光下显像(图1)。

使用相同的

PCR

引物进行

DNA

测序。如果测序结果质量低，则将扩增子通过

TOPO TA

克隆试剂盒(加利福尼亚州卡尔斯巴德

Invitrogen

公司)克隆到质粒载体中，再使用该试剂盒提供的引物进行测序。在美国国家生物技术信息中心的

BLAST

(

Basic Local Alignment Search Tool

，

http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgim

) 中进行核苷酸序列的初步检索，与其它已知核苷酸序列进行比对。多重比对分析和系统树分析则使用

ClustalW

在线服务(

http://www.genome.jp/tool s/

clustalw/

)，相关参数采用系统默认值。

结果

共采集了242只未进食的蜱，包括222只成年全沟硬蜱和20只成年草原革蜱，对每一只蜱都进行了逐一检

(2)

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2

Javkhlan等

蒙古蜱自然感染嗜吞噬细胞无形体现况

染率高于雄性。全沟硬蜱的扁平无形体感染率为

1.8

％

。对于草原革蜱，嗜吞噬细胞无形体的感染率为

20

％

，扁平无形体感染率为

10

％。结果提示，这些蜱种可能在嗜吞噬细胞无形体和扁平无形体从蜱传染给人中发挥重要作用。

系统树分析表明本次发现的无形体属于俄罗斯簇群，与从俄罗斯相同蜱种样本分离的无形体最为接近，而与从蓖子硬蜱、反刍动物、马和人等分离的无形体遗传学上明显不同。由于色楞格省位于蒙古北部，毗邻俄罗斯，与其有类似的地理地貌，因此这一结果并不奇怪。在亚洲、俄罗斯的乌拉尔山脉、西伯利亚、远东和俄罗斯波罗的海地区，全沟硬蜱是嗜吞噬细胞无形体的媒介

^[9]

。全沟硬蜱分布在蒙古的北部和东北部地区，而草原革蜱则广泛分布在蒙古全境。

据作者所知，本研究是蒙古关于蜱中嗜吞噬细胞无形体和扁平无形体的首次描述，由于这些病原体既能感染动物也能感染人，因此这一结果在兽医和公共查。其中，

14

只(

6.3

％)全沟硬蜱和

4

只(

20

％)草原革

蜱嗜吞噬细胞无形体阳性；4只(

1.8

％)全沟硬蜱和

2

只 (

10

％)草原革蜱扁平无形体阳性(表

1

)。

系统树分析显示有4个簇群：欧洲

-I

、俄罗斯、

欧洲

-II

和美国。本次调查获得的嗜吞噬细胞无形体的

groEL

基因序列属于俄罗斯簇群，与俄罗斯新西伯利

亚(

GenBank

：

HM366567.1

)和斯维尔德洛夫斯克州 (

GenBank

：

HM366569.1

)的全沟硬蜱中检测到的嗜吞噬细胞无形体最为相近，而与欧洲

-I

、欧洲

-II

和美国簇群的遗传学特性则有明显不同(图

1

)。

讨论

世界各地已经发现了不同种类能感染嗜吞噬细胞无形体的蜱。本研究在蒙古色楞格省森林地区的蜱中发现了嗜吞噬细胞无形体和扁平无形体。全沟硬蜱的嗜吞噬细胞无形体的流行率为

6.3

％，与中国内蒙古自治区和黑龙江省先前报告的

4.6

％相近

^[8]

。雌性全沟硬蜱感图1. 嗜吞噬细胞无形体groEL基因系统树

1 – HM366576.1 株 5 – HM366572.1 株

蒙古 I. 全沟硬蜱

6 – HM366569.1 株 7 – HM366567.1 株 3 – HM366574.1 株 4 – HM366573.1 株 2 – HM366575.1 株 10 – HM366577.1 株 11 – HM366568.1 株 9 – HM366578.1 株 8 – HM752098.1 株

46 – JN005746.1 isolate 47 – JN005745.1 isolate 35 – AY281814.1 isolate 36 – AY281810.1 isolate 37 – AY281814.1 isolate 39 – AF478551.1 isolate 25 – AY281851.1 isolate 27 – AY281846.1 isolate 31 – AY281821.1 isolate 32 – AY281819.1 isolate 82 – EU552912.1 isolate 38 – AF478559.1 isolate 40 – AF383226.1 Ehrlichia 26 – AY281850.1 isolate 30 – AY281822.1 isolate 33 – AY281817.1 isolate 34 – AY281816.1 isolate 81 – EU552913.1 isolate 20 – AF478560.1 isolate 59 – EU552914.1 isolate 24 – HQ629902.1 strain 54 – AF478554.1 isolate 42 – EU246960.1 isolate 19 – AY281824.1 isolate 22 – AY220468.1 isolate 17 – AY220467.1 isolate 56 – EU552923.1 isolate 18 – AY281827.1 isolate 21 – AF478555.1 isolate 16 – AF478556.1 isolate 15 – AY281820.1 isolate 14 – AY281832.1 isolate 13 – AY281848.1 isolate 12 – AY220459.1 isolate 23 – HQ629904.1 strain 41 – HQ629905.1 strain 43 – AY281811.1 isolate 44 – AF383225.1 Ehrlichia 55 – AY220470.1 isolate 52 – AY281836.1 isolate 53 – AF478564.1 isolate 51 – AY281813.1 isolate 50 – AY281813.1 isolate 78 – EU552921.1 isolate 80 – EU552919.1 isolate 28 – AY281825.1 isolate 29 – AY281825.1 isolate 79 – EU552920.1 isolate 58 – EU552918.1 isolate 48 – JN005744.1 isolate 49 – JN005748.1 isolate 45 – JN005747.1 isolate 6 – HM366569.1 isolate 7 – HM366567.1 isolate Mongolia I. persulcatus 1 – HM366576.1 isolate 5 – HM366572.1 isolate 3 – HM366574.1 isolate 4 – HM366573.1 isolate 2 – HM366575.1 isolate 10 – HM366577.1 isolate 11 – HM366568.1 isolate 9 – HM366578.1 isolate 8 – HM752098.1 isolate 61 – EU246959.1 isolate 86 – HM057233.1 isolate 87 – HM057227.1 isolate 68 – AF478552.1 isolate 63 – AY281844.1 isolate 74 – U96729 strain 89 – HM057225.1 isolate 91 – HM057223.1 A. centrale 83 – AY281828.1 isolate 64 – AY281831.1 isolate 88 – HM057226.1 isolate 95 – AF202895.1 Ehrlichia 90 – HM057224.1 isolate 84 – HQ629909.1 strain 92 – AY539489.1 strain 85 – HQ629906.1 strain 93 – AF478561.1 isolate 94 – AF383227.1 isolate 65 – AY281818.1 isolate 99 – JN005748.1 isolate 57 – AF478553.1 isolate 60 – EU860090.1 isolate 77 – U72628.1 strain 66 – AY219849.1 isolated 75 – U96728.1 strain HGE 76 – U96727.1 isolated 69 – AF172163.1 isolate 70 – AF172162.1 isolate 71 – AF172161.1 isolate 72 – AF172160.1 isolate 96 – AF173989.1 97 – AF173988.1 Ehrlichia 73 – AF172159.1 isolate 62 – AY626282.1 isolate 98 – AF172158.1 isolate 100 – EU352647.1 USA CA pituophi

欧洲

- I

俄罗斯

欧洲

- II

美国

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WPSAR Vol 5, No 1, 2014 | doi: 10.5365/wpsar.2013.4.3.001

www.wpro.who.int/wpsar 3

蒙古蜱自然感染嗜吞噬细胞无形体现况

Javkhlan等

Microbiology, 2001, 51:2145–2165. doi:10.1099/00207713- 51-6-2145 pmid:11760958

2. Chen SM et al. Identification of a granulocytotropic Ehrlichia spe- cies as the etiologic agent of human disease. Journal of Clinical Microbiology, 1994, 32:589–595. pmid:8195363

3. Walker DH, Dumler JS. Emergence of the ehrlichioses as human health problems. Emerging Infectious Diseases, 1996, 2:18–29.

doi:10.3201/eid0201.960102 pmid:8903194

4. Bakken JS et al. Clinical and laboratory characteristics of hu- man granulocytic ehrlichiosis. Journal of the American Medical Association, 1996, 275:199–205. doi:10.1001/

jama.1996.03530270039029 pmid:8604172

5. Telford SR 3rd et al. Perpetuation of the agent of human granu- locytic ehrlichiosis in a deer tick-rodent cycle. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of Ameri- ca, 1996, 93:6209–6214. doi:10.1073/pnas.93.12.6209 pmid:8650245

6. Walder G et al. Serological evidence for tick-borne encepha- litis, borreliosis, and human granulocytic anaplasmosis in Mongolia. International Journal of Medical Microbiology, 2006, 296 Suppl 40:69–75. doi:10.1016/j.ijmm.2006.01.031 pmid:16524782

7. Hancock SI, Breitschwerdt EB, Pitulle C. Differentiation of Ehr- lichia platys and E. equi infections in dogs by using 16S ri- bosomal DNA-based PCR. Journal of Clinical Microbiology, 2001, 39:4577–4578. doi:10.1128/JCM.39.12.4577- 4578.2001 pmid:11724889

8. Cao WC et al. Prevalence of Anaplasma phagocytophila and Bor- relia burgdorferi in Ixodes persulcatus ticks from northeastern China. The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene, 2003, 68:547–550. pmid:12812342

9. Katargina O et al. Identification of Anaplasma phagocyt- ophilum in tick populations in Estonia, the European part of Russia and Belarus. Clinical Microbiology and Infection, 2012, 18:40–46. doi:10.1111/j.1469-0691.2010.03457.x pmid: 21199155

卫生界均有重要意义。蒙古已有人感染嗜吞噬细胞无形体的血清学证据

^[6]

，因此有必要开展从蜱到人具体传播机制的研究，以制定有效的人感染嗜吞噬细胞无形体预防措施。

利益冲突

未申报。

基金

无。

引用本文地址：

Javkhlan G et al. Natural Anaplasma phagocytophilum infection in ticks from a forest area of Selenge province, Mongolia. Western Pacific Surveillance and Response Journal, 2014, 5(1):21–24. doi:10.5365/

wpsar.2014.5.1.013

参考文献:

1. Dumler JS et al. Reorganization of genera in the families Rick- ettsiaceae and Anaplasmataceae in the order Rickettsiales: uni- fication of some species of Ehrlichia with Anaplasma, Cowdria with Ehrlichia and Ehrlichia with Neorickettsia, descriptions of six new species combinations and designation of Ehrlichiaequi and ‘HGE agent’ as subjective synonyms of Ehrlichiaphagocy- tophila.International Journal of Systematic and Evolutionary

表

1. 2013

年蒙古色楞格省不同地区、不同性别的蜱种嗜吞噬细胞无形体和扁平无形体检出情况

蜱种类地区蜱性别标本数嗜吞噬细胞无形体阳性(%) 扁平无形体阳性(%)

草原革蜱 (20只)

阿勒坦布拉格雌

6 1 (16.7) –

雄

4 1 (25.0) –

库德雌

6 1 (16.7) 2 (33.3)

雄

4 1 (25.0) –

小计雌

12 2 (16.7) 2 (16.7)

雄

8 2 (25.0) –

全部

20 4 (20.0) 2 (10.0)

全沟硬蜱 (222只)

阿勒坦布拉格雌

23 3 (13.0) 1 (4.4)

雄

26 2 (7.7) 1 (3.8)

库德雌

88 5 (5.7) 2 (2.3)

雄

77 4 (5.2) –

不详

8 – –

小计雌

111 8 (7.2) 3 (2.7)

雄

103 6 (5.8) 1 (1.0)

全部

222 14 (6.3) 4 (1.8)

合计

蒙古色楞格省森林地区蜱自然感染嗜吞噬细胞无形体现况

短篇报道

WPSAR Vol 5, No 1, 2014 | doi: 10.5365/wpsar.2013.4.3.001

www.wpro.who.int/wpsar 1

doi: 10.5365/wpsar.2013.4.3.001

嗜

A n a p l a s m a phagocytophilum) 是 一 种 革 兰 氏 阴 性 、

[ 1 ]

anaplasmosis，HGA)于1994年首先报告于美国 [2]

[3]

[4]

[5]

2.3

5.6

2.8

3.0

[6]

方法

2个地区采集未进食的蜱。选择这些地区作为研究对

蒙古色楞格省森林地区蜱自然感染嗜吞噬细 胞无形体现况

Javkhlan G a

a

b

a

a

a

DNA

iNrRON

DNA

[7]

groEL基

EphplgroELF(5'–ATGGTATGCAGTTTGATCGC-3')和 EphplgroELR(5'–TCTACTCTGTCTTTGCGTTC-3')，预

PCR

DNA

TOPO TA

Invitrogen

BLAST

Basic Local Alignment Search Tool

http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgim

ClustalW

http://www.genome.jp/tool s/

clustalw/

结果

WPSAR Vol 5, No 1, 2014 | doi: 10.5365/wpsar.2013.4.3.001 www.wpro.who.int/wpsar

2

Javkhlan等

1.8

20

10

[9]

14

6.3

4

20

1.8

2

10

1

-I

-II

groEL

GenBank

HM366567.1

GenBank

HM366569.1

-I

-II

1

讨论

6.3

4.6

[8]

1 – HM366576.1 株 5 – HM366572.1 株

6 – HM366569.1 株 7 – HM366567.1 株 3 – HM366574.1 株 4 – HM366573.1 株 2 – HM366575.1 株 10 – HM366577.1 株 11 – HM366568.1 株 9 – HM366578.1 株 8 – HM752098.1 株

- I

- II

WPSAR Vol 5, No 1, 2014 | doi: 10.5365/wpsar.2013.4.3.001

www.wpro.who.int/wpsar 3

Javkhlan等

Microbiology, 2001, 51:2145–2165. doi:10.1099/00207713- 51-6-2145 pmid:11760958

A n a p l a s m a phagocytophilum) 是一种革兰氏阴性、

^{[ 1 ]}

anaplasmosis，HGA)于1994年首先报告于美国 ^[2]

^[3]

^[4]

^[5]

^[6]

蒙古色楞格省森林地区蜱自然感染嗜吞噬细胞无形体现况

Javkhlan G ^a

^a

^b

^a

^a

^a

^[7]

^[9]

^[8]

^[6]