The high phenolic and flavonoid contents were found in the leaf extracts of Azima sarmentosa and Pluchea indica and root extract of Maytenus mekongensis. On the other hand, it was found that the crude extract from the leaf of Pluchea indica reduced the reduction of TNF-alpha mRNA expression in the high concentration (500 µg/ml) at the level of 1X PBS + hydrogen peroxide (H2O2). In contrast, the leaves of Pluchea indica can be used for wound healing and anti-inflammatory agents, such as rheumatoid arthritis.
ความสำคัญและที่มาของปัญหาที่ทำการวิจัย
สรรพคุณเป็นยาสมุนไพร มีรายงานว่าสารสกัดจากรากที่สกัดจากเฮกเซนยับยั้งการเจริญเติบโตของเซลล์เนื้องอก glioblastoma (glioblastoma) ลดจำนวนเซลล์ในระยะ S และ G2/M อย่างมีนัยสำคัญ สารสกัดหยาบของใบและรากของคาลูสกัดจากน้ำ ทำให้เกิดการยับยั้งการเพิ่มจำนวนเซลล์ (proliferation) และการอยู่รอดของเซลล์ (viability) ของเซลล์มะเร็งสมอง (เซลล์ GBM8401) และเซลล์มะเร็งปากมดลูก (เซลล์ HeLa) (Cho et al., 2017; Cho et al., 2012) อย่างไรก็ตาม
วัตถุประสงค์ของการวิจัย
ประโยชน์ที่คาดว่าจะได้รับ
ขอบเขตงานวิจัย
สถานที่ทำการวิจัย
ดินเค็ม
ดินเค็มภาคตะวันออกเฉียงเหนือ
การจำแนกดินเค็มในภาคตะวันออกเฉียงเหนือ
พืชชอบเค็ม
หนามพุงดอและสารสกัดหนามพุงดอ
หนามแดงและสารสกัดหนามแดง
ขลู่และสารสกัดขลู่
พืชสมุนไพรไทยและตำรับยาไทย
ระบบภูมิคุ้มกัน (immune system)
ภูมิคุ้มกันโดยกำเนิด
ภูมิคุ้มกันแบบจำเพาะ
เซลล์ระบบภูมิคุ้มกัน (immune cells)
- เซลล์แมโครฟาจ (macrophage)
- เซลล์โมโนไซต์ (monocytes)
- เซลล์เดนไดรติกส์ (dendritic cells (DCs))
- ลิมโฟไซด์ชนิดที (T cells)
- Natural killer (NK) cells
16 โมโนไซต์ออกฤทธิ์ผ่าน TLR2, TLR4 และ TLR5 แต่ไม่สามารถถูกกระตุ้นโดย IL-1, TNF-, IFN-β, IFN-, GM-CSF หรือ CD40-L (Farina et al., 2004) -2 เป็นตัวรับในการจับยึดส่วนประกอบของแบคทีเรียแกรมบวก เช่น เพปทิโดไกลแคน (PGN) จดจำไลโปโปรตีน (ไลโปโปรตีน) และกรดไลโปเตอิโชอิก TLR4 เป็นตัวรับสำหรับ LPS ซึ่งเป็นส่วนประกอบของผนังเซลล์ของแบคทีเรียแกรมลบ TLR5 จดจำโปรตีนแฟลเจลลินของแบคทีเรีย (Skinner et al., 2005) เนื่องจากโมโนไซต์แสดง TLR ได้หลากหลาย นอกจากนี้ จนถึง TLR2, TLR4 และ TLR5 ยังมี TLR3 ซึ่งสามารถกระตุ้นโดย polyinosine-polycytidylic acid polyIC และ TLR9 สามารถเปิดใช้งานได้โดย oligodeoxynucleotides ที่ไม่ถูกเมทิลเลตซึ่งมีลวดลาย CpG (CpG-B) การกระตุ้น TLR โดยลิแกนด์ดังกล่าวนำไปสู่การผลิตไซโตไคน์ที่มีการอักเสบ เช่น IL-1 IL-6 IL-8 IL-12p70 และ TNF- (Mao et al., 2005) มีการรายงานการกระตุ้น TLR โดยใช้ IL-15/IL-15R เพื่อกระตุ้นให้เกิดการเปลี่ยนแปลงอย่างรวดเร็วของโมโนไซต์ไปเป็นมาโครฟาจและการกระตุ้น GM-CSF/GM-CSFR ชักนำให้เกิดความแตกต่าง โมโนไซต์เข้าไปในเซลล์เดนไดรต์ (Krutzik et al., 2006) Pam3Cys) และลิแกนด์ TLR5 (แฟลเจลลิน) สามารถกระตุ้นเซลล์ Th-2 ได้ มีรายงานว่า LPS ในปริมาณสูงเพื่อกระตุ้นเซลล์ Th1 ในขณะที่ LPS ในปริมาณต่ำจะกระตุ้นการตอบสนองของ Th2 แสดงให้เห็นว่าลิแกนด์ TLR มีอิทธิพลต่อการตอบสนองของ Th1 และ Th2 ผ่านทางเซลล์เดนไดรต์ที่เกิดจากเพอร์ฟอริน จากนั้น Granzyme จะกระตุ้นให้เซลล์เป้าหมายตายจากการตายของเซลล์ (Abbas et al., 2015; Alam, 1998)
เซลล์แมโครฟาจและกลไกการทำงานของเซลล์แมโครฟาจ
รูปที่ 2 การพัฒนาจากเซลล์ monocytic ไปสู่เซลล์ Macrophage ที่มา: Abbas et al. รูปที่ 3 โพลาไรเซชันของเซลล์มาโครฟาจประเภทต่างๆ ที่มา: Palma และคณะ รูปที่ 4 ฟังก์ชันและฟังก์ชันของเซลลูล่าร์ Macrophages ที่มา: Abbas et al.
ไซโตไคน์ (cytokines)
Mitogen-activated protein kinase (MAPK) pathway
การรักษาแผนปัจจุบัน
อุปกรณ์และวิธีการ
ตัวอย่างเลือดจากอาสาสมัคร
ตัวอย่างพืชชอบเค็ม
จุลินทรีย์ที่ใช้ในการวิจัย (เลขที่การรับรอง IBC09-10/2563)
วิธีการทดลอง
ระยะที่ 1 การขอรับการพิจารณาจรรยาบรรณการวิจัยในมนุษย์ และขอรับรองความ
- ขอรับการพิจารณาจรรยาบรรณการวิจัยในมนุษย์
- ขอรับรองความปลอดภัยทางชีวภาพ ระดับห้องปฏิบัติการ
- การเก็บและการเตรียมตัวอย่างพืช
- กระบวนการสกัดสารจากพืชชอบเค็ม
- การวิเคราะห์หาปริมาณสารประกอบฟีนอลทั้งหมด (TPC)
- การวิเคราะห์หาปริมาณสารประกอบฟลาโวนอยด์ทั้งหมด (TFC)
- การวัดฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระด้วยวิธี 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH)
- การวัดฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระด้วยวิธี 2, 2-azobis (3-ethylbenzothialzoline-
- การหาค่าความสัมพันธ์ระหว่างฤทธิ์การต้านอนุมูลอิสระและปริมาณสารสำคัญ
- การทดสอบฤทธิ์ต้านแบคทีเรียด้วยวิธี agar disc diffusion
- การทดสอบหาความเข้มข้นต่ำสุดที่สามารถยับยั้งเชื้อแบคทีเรีย (Minimum
ระยะที่ 3 การศึกษาการความเป็นพิษของสารสกัดหยาบต่อเซลล์เม็ดเลือดแดงและ
- การแยกเซลล์กลุ่มโมโนไซต์ (CD14 + ) จากเซลล์เม็ดเลือดขาว (White blood
- การทดสอบความเป็นพิษของสารสกัดหยาบจากพืชชอบเค็ม (cytotoxicity
- การศึกษาคุณสมบัติการเป็นพิษต่อเซลล์เม็ดเลือดแดง โดยวิธี hemolysis
- การตรวจสอบการเปลี่ยนแปลงของเซลล์โมโนไซต์เป็นเซลล์แมโครฟาจที่
- การตรวจสอบฤทธิ์ของสารสกัดหยาบต่อการ phagocytosis ของเซลล์แมโคร
- การตรวจสอบฤทธิ์ของสารสกัดหยาบต่อการแสดงออกของยีน TNF- และ
และการนำเสนอแอนติเจนโดยทีลิมโฟไซต์ที่ถูกกระตุ้นจะถูกโพลาไรซ์เป็นมาโครฟาจเชิงฟังก์ชันที่แตกต่างกันอย่างน้อยสามชนิด: M1 มาโครฟาจ เมื่อกระตุ้นด้วย LPS, IFN- GM-CSF และ IL-1β จะไปตามวิถีทางที่แตกต่างกันที่มีคุณสมบัติในการเพิ่มประสิทธิภาพในการล้าง การติดเชื้อ. การบุกรุกของจุลินทรีย์และการตอบสนองต่อการอักเสบเพิ่มขึ้นกระตุ้นการแสดงออกของไซโตไคน์ที่ทำให้เกิดการอักเสบเช่น TNF-, IL-1β, IL-16, IL-12 และ IL-23 ลดการแสดงออกของมาโครฟาจประเภท IL-10 และ M2 (M2a , M2b หรือ M2c) หลัง ด้วย IL-4 และ IL-13 ซึ่งมีความสามารถในการกำจัดจุลินทรีย์ โดยทำให้เกิดการผลิต TNF- ในเซลล์มาโครฟาจผ่านทาง p38 และโปรตีนไคเนสที่กระตุ้นความเครียด (SAPK/JNK) (Nakao et al., 2008) ในการศึกษานี้ ผลของสารนี้ต่อการแสดงออกของ TNF- มีการศึกษายีน เซลล์แมคโครฟาจ M ascorbic acid เป็นสารต้านอนุมูลอิสระและต้านการอักเสบ มีรายงานว่า Quercetin ช่วยกระตุ้นการแสดงออกของ CD169 ซึ่งเป็นเครื่องหมายของเซลล์มาโครฟาจ และยับยั้งการอักเสบ (Fu et al., 2020; Fujiwara et al., 2018) และมีรายงานว่า quercetin และ ascorbic acid ยับยั้งโปรตีนที่ทำปฏิกิริยากับไทโอรีด็อกซิน (TXNIP) ซึ่งควบคุมกิจกรรมการอักเสบของ NLRP3 ที่เกิดจากฟรุกโตส ส่งผลให้เกิดการยับยั้ง การแสดงออกของไซโตไคน์อักเสบ (Choe and Kim, 2017) แล้วทำให้เซลล์ปลอดโปร่ง และกระตุ้นด้วย 40 M H2O2, ฟักตัวต่อเป็นเวลา 6 ชั่วโมงหลังการกระตุ้น, จากนั้นเซลล์ถูกเก็บเกี่ยว เพื่อสกัด RNA ด้วยรีเอเจนต์ Trizol® และศึกษาการแสดงออกของ TNF- (ไซโตไคน์สำหรับ M1 มาโครฟาจ) โดย RT-PCR โดยใช้ยีน GAPDH เป็นยีนควบคุมภายใน ปริมาณของผลิตภัณฑ์ PCR ได้รับการวิเคราะห์ด้วยโปรแกรม ImageJ (Choe และ Kim, 2017; Kim และ Park, 2016; Nakao และคณะ, 2008; Nathan และ Root, 1977)
การวิเคราะห์ผลและการวิเคราะห์ทางสถิติ
การเตรียมตัวอย่างพืชชอบเค็มและการสกัดสารสกัดหยาบ
การวิเคราะห์คุณสมบัติทางเคมีเบื้องต้น
การศึกษาฤทธิ์การต้านอนุมูลอิสระด้วยวิธี DPPH และ ABTS
รูปที่ 13 เส้นกราฟมาตรฐานของกรดแอสคอร์บิกจากวิธี DPPH (a) และกราฟมาตรฐานของกรดแอสคอร์บิกจากวิธี ABTS (b)
การหาค่าความสัมพันธ์ระหว่างฤทธิ์การต้านอนุมูลอิสระและปริมาณสารสำคัญ
การศึกษาคุณสมบัติการเป็นสารต้านจุลินทรีย์
การศึกษาผลของสารสกัดหยาบพืชชอบเค็มต่ออัตราการมีชีวิตรอดของเซลล์เม็ดเลือดขาว
การศึกษาคุณสมบัติการเป็นพิษของสารสกัดหยาบพืชชอบเค็มต่อเซลล์เม็ดเลือดแดง โดยวิธี
การตรวจสอบการเปลี่ยนแปลงของเซลล์โมโนไซต์เป็นเซลล์แมโครฟาจที่เพาะเลี้ยง
การตรวจสอบฤทธิ์ของสารสกัดหยาบต่อการ phagocytosis ของเซลล์แมโครฟาจ
การตรวจสอบฤทธิ์ของสารสกัดหยาบต่อการแสดงออกของยีน TNF- ของเซลล์แมโครฟาจ
70 4.10 การตรวจสอบผลของสารสกัดหยาบต่อการแสดงออกของยีน TNF- ของเซลล์มาโครฟาจ จากผลการทดลองพบว่า H2O2 กระตุ้นการแสดงออกของ TNF- ในเซลล์มาโครฟาจด้วย p38 และสารสกัดจากดอกคาลู รากหนามพุงโด และเปลือกนอกคาลู กระตุ้นการแสดงออกของ TNF- รูปที่ 33. การแสดงออกของ TNF- ของเซลล์มาโครฟาจที่บำบัดด้วยสารสกัดหยาบของฮอว์ธอร์น
การตรวจสอบฤทธิ์ของสารสกัดหยาบต่อการแสดงออกของยีน IL-10 ของเซลล์แมโครฟาจ73
ภาคผนวก ตารางที่ 6 ผลการทดสอบ MIC และ MBC ของสารสกัดใบหนามแดงต่อแบคทีเรีย ภาคผนวก ตารางที่ 7 ผลการทดสอบ MIC และ MBC ของสารสกัดรากคาลูต่อแบคทีเรีย 153 ภาคผนวก ตารางที่ 1 ผลการทดสอบความเป็นพิษของสารต่อ WBCs, CD14+ และ CD14- เซลล์, สารสกัดหยาบของรากหนามพุงโด, ความเข้มข้นของสาร (g/ml)
154 ตารางภาคผนวก G2 ผลการทดสอบความเป็นพิษของสารในเซลล์ WBC, CD14+ และ CD14, สารสกัดจากก้านหนามปุงโดแบบดิบ, ความเข้มข้นของสาร (g/mL) 155 ตารางภาคผนวก G3 ผลการทดสอบความเป็นพิษของสารในเซลล์ WBC, CD14+ และ CD14- สาร ความเป็นพิษต่อเซลล์ WBC, CD14+ และ CD14- Thorn Phung Do สารสกัดหยาบจากใบ ความเข้มข้นของสาร (g/mL) 156 ภาคผนวกตารางที่ 1. , ความเข้มข้นของสาร (g/mL)
157 ตารางภาคผนวก G5 ผลการทดสอบความเป็นพิษของสารในเซลล์ WBC, CD14+ และ CD14, สารสกัดก้านหนามแดงดิบ, ความเข้มข้นของสาร (g/mL) 158 ตารางภาคผนวก G6 ผลการทดสอบความเป็นพิษของสารในเซลล์ WBC, CD14+ และ CD14 ความเป็นพิษ ของสารในเซลล์ WBC, CD14+ และ CD14- สารสกัดจากใบหนามแดง ความเข้มข้นของสาร (g/mL) 159 ภาคผนวกตารางที่ 1 ความเข้มข้นของสารคาลูรากหยาบ ( กรัม/มล.)
160 ภาคผนวกตารางที่ 1 ความเป็นพิษของสารต่อเซลล์ WBCs, CD14+ และ CD14 สารสกัดดิบของใบคลู ความเข้มข้นของสาร (g/ml) 162 ตารางภาคผนวกตารางที่ ความเข้มข้นของสารดอกคาลูดิบ (g/ml ) .
163 ภาคผนวกตารางที่ G11 ผลการทดสอบความเป็นพิษของสารบน WBCs, CD14+ และเซลล์ CD14-, สารสกัดหยาบด้านนอกเบส, ความเข้มข้นของสาร (g/mL) 164 ภาคผนวกตารางที่ G12 ผลการทดสอบความเป็นพิษของสารบน WBCs , CD14+ และ CD14- เซลล์ ความเป็นพิษของสารต่อ WBCs, CD14+ และ CD14- เซลล์, โพลิส, ความเข้มข้นของสาร
