يوونلا ضمحلا صلاختسا ةبرجت ايلاخ نم DNA
نولوقلا ايريتكب لثم ةاونلا ةيئادب
DNA EXTRACTION FROM PROKARYOTIC CELL
ةقيقدلا ءايحلأا ةثارو ررقمل يلمعلا ءزجلا قدح 251
9/25/2013
Amal KH Alghamdi 351 MIC 1
• ءيزج لمعي ن ام يلاتلاب و ،ةيحلا تانئاكلا عاونأ رئاس يف ةيفيكلا سفنب DNA
هملعت
ءايحلأا ءاملع دمتعأ اذل ،رخآ نئاك ىلع هقيبطت نكمي نئاك نع أدبم
براجتلا ءارجإ” ىلع
تانئاك بيكرتلا ةطيسب
يفلما جئاتنلا قيبطت مث نم و تايرطفلا و ايريتكبلا لثم سنلإا ىلع ةد
“نا .
•
* يف طساوأ
،تانيتسلا فشتكا
ملاع ءايزيفلا
” GEORGE GAMOW
“ وهو لمعي
نمض ةعومجم
ءاملع اهاشنأ
اهامسو (
RNA TIE CLUB )
ةفاضلإاب ىلإ
ملاعلا
MARSHALL NIRENBERG نورخآو
.
• نأ تامولعملا ةيثارولا
نوكت ةبترم
لكشب مظنم
يمس
” ةرفش ةيثارو
ًالثم :
ةيرظن نيملاعلا
نييسنرفلا
” بوكاج و
رنوم
” : -
( • دعب تاسارد
ىلع ايريتكب
E. COLI يتلا
جتنت ددع
دودحم نم
تاميزنلإا دنع
اهتعارز
يف ةئيب اهب
،زوتكلا و
لا جتنت هذه
رئامخلا يف
بايغ زوتكللا
نم ةئيب يمنتلا
ة ) :
[ • ةعومجم تانيجلا
يتلا موقت
ةرطيسلاب ىلع
نيوكت تانيتورب
ةنيعم ىمست
” تانيج
ةيبيكرت STRUCTURAL
GENES
“
و • يه عقت
تحت ةرطيس
نيج رخآ
عقي ىلع
دحا اهبناوج
، مظني اهلمع
و ىمسي
” يج ن
مظنم REGULATING GENES
“ ] .
تينب • ةيرظن
” بوكاج و
رنوم
“ ىلع ةسارد
ءايحلأل و،ةقيقدلا
كانه ةلدأ
ديؤت دوجو
ذ تا
ماظنلا يف
تانيج ءايحلأا
ةدقعملا
. 9/25/2013
Amal KH Alghamdi 351 MIC 3
نولوقلا ايريتكبل ةيثارولا ةطيرخلا
GENETIC ENGINEERING
ةبرجتلا نم ضرغلا
لوصحلا يوونلا ضمحلا ىلع
يموسومركلا هيقن ةروصب ايريتكبلل
.
9/25/2013
Amal KH Alghamdi 351 MIC 5
تاودلأا MATERIAL
قرم LURIA BERTANI
( .)LB ةلزع
ايريتكب نم ةيقن E. COLI
.
مظنم لولحم Buffer
( Tris/EDTA/glucose )
هل زمريو ALS-I
. طيلخ لولحم
( phenol/Chloroform/Isoamyl
alcohol )
25:24:1
2 مويدوصلا ديسكورديه يرايع 2 N NaOH
لوحك . Isoprpanol
.
4 % لولحم نم (SDS
Sodium dodecyl
تاودلأا MATERIAL
ءاطغ تاذ ةمقعم ةيكيتسلاب بيبانأ Microcentrifuge Tubes ( 1.5-2 ml .)
هينورتكلا ةقيقد تاصام Micropipette
ماجحلأا ةفلتخم (
(2-20µl, 10-100µl, 100-
1000µl .
بيبانلأل لماوح (Racks for tube) .
ةقيقدلا تاصاملا ةيطغأ Tips with different size .
جرلا زاهج (Vortex )
يئرملا فيطلا ليلحت زاهج . (Spectrophotometer)
.
قيقد يزكرم درط زاهج Microcentrifuge
. تاكلهتسملا نم صلختلل ةبلع
Biohazard Container
9/25/2013
Amal KH Alghamdi 351 MIC 7
لمعلا ةقيرط METHOD
ًالوأ • :
ًريضحت ليلاحملا
ًةمظنملا BUFFERS
صلاختسلاًيفًهمدختسملا ( :
ًيلمعلاًسردلاًيعجار
قباسلا .)
اًيناث • :
ًيوونلاًضمحلاًصلاختساًتاوطخ يريتكبلا DNA
:
• حقلي 5
ةئيب نم لم ةيقن ةلزعب LB
ايريتكب نم E. COLI
ةدمل نضحتو 12
- 24 دنع هعاس 37
م˚ .
• لقني 1.5
ةقيقد يزكرم درط ةبوبنأ ىلإ ةعرزملا نم لم MICROCENTRIFUGE
نم صلختن مث نيتقيقد ةدمل درطيو
قئارلا .
لمعلا ةقيرط METHOD
• يف بسارلا قلعي 240UL
مظنم لولحم نم BUFFER
( TRIS/EDTA/GLUCOSE )
زاهج يف ةبوبنلأا جرتو VORTEX
ًاديج (
ت مدع نم دكأتلل ًاديج بسارلا قيلعت بجي لتك
هيريتكبلا ايلاخلا .)
9/25/2013
Amal KH Alghamdi 351 MIC 9
لمعلا ةقيرط METHOD
• بسارلا ىلإ فاضي لولحم نم20UL
مويدوصلا ديسكورديه نم2N و NAOH
20UL
لولحم نم 4% SDS
جرلا زاهج مادختسا نودب ًاديج جيزملا جري مث VORTEX
.
• ةرشابم فاضي نم 40UL
مويدوصلا تاتيسأ لولحم نم3M NAOAC
ةجرد يف
PH=6.0 .
ا يزكرملا درطلاب جيزملا بسري مث جرلا زاهج نودب ًاديج جيزملا جريو قيقدل
ةدمل 10
قئاقد .
لمعلا ةقيرط METHOD
• هنم صلختلاو بسارلا بحس متي ةقيقدلا ةصاملا مادختساب .
ب قئارلا بيسرت متي يزكرملا درطلا
ةمقعم يزكرم درط ةبوبنأ ىلإ قئارلا لقني مث نيتقيقد ةدمل .
• ةبوبنلأا ىلإ فاضي نم 4UL
10UG/ML ميزنلا
RNASE ةجرد يف نضحتو ةرارحلاب طبثملا
37 ةدمل م 10
قئاقد .
• مادختساب نيترم قئارلا صلختسي 200UL
نم طيلخلا نم (
لونيفلا :
مروفورولكلا :
لوحك
ليمأوزيأ .)
• فاضي ( 1VOL
200UL )
نم يلخلا جزمي ،ةفافشلا ةيولعلا ةقبطلا ىلإ لونابوربوزيلأا كرتيو ط
ةدمل 5
قئاقد .
9/25/2013
Amal KH Alghamdi 351 MIC 11
لمعلا ةقيرط METHOD
• ةدمل جيزملا بسري 5
قئافلا ةعرسلا ىلع قئاقد ة
قئارلا نم صلختن مث يزكرملا درطلل .
• مادختساب نيترم بسارلا لسغي 400UL
نم
لوحك 70% ETHANOL
هرم لك درطي مث
محلا مادختسلا مقعملا رطقملا ءاملا يف بسارلا قلعي ض
لاو زيكرتلاك ةيلاتلا تاوطخلا يف لوزعملا يوونلا ةيقنت
.
ةظحلام :
خ لك دعب لولحملا يف ريغتلا ليجست بجي ةوط
.
Amal AlGhamdi- MIC251-2011 13
لمعلا ةقيرط
METHOD
لمعلاًءانثاًةماهًتاظحلام
• هوغرلا روهظ بنجتل ةفينع ةروصب جرلا مدع ىلع صرحلا .
• ةيولقلا ةداملا ةيلاعلا ةرارحلا عم SDS
55-60 يولخلا رادجلا يف نوهدلا ةباذإ ىلإ يدؤت م˚
يوونلا ضمحلا ررحتو .
• ميزنا مادختسا نكمي PROTEINSAE K
ق تانيتورب يأ نم صلختل ًاضيأ ةيلاعلا ةرارحلا عم د
يوونلا ضمحلا عم طبترت .
• ا ةياهن ىلا ةصاملا لاخدا قيرط نع هتفاضا نكميو يجلثلا لوحكلا فاضي نمو هبوبنلا
مث
• عيمج سكعب لوحكلا يف يوونلا ضمحلا بوذي لا مزلابوتوربلا تانوكم
تلا يولخلا بوذت ي
بسار لكش يف يوونلا ضمحلا ةكرات لوحكلا يف
• ةدمل رقتسيل لولحملا كرت بجي -2
ةقرل ةلحرملا هذه يف ةبوبنلأا جر مدع بجيو قئاقد 3
يوونلا ضمحلا بيكرت .
• اضيب ةدام ةئيه ىلع لوحكلا ةقبط يف يوونلا ضمحلا بسرت ةظحلام نكميو هجزل ء
.
• نم ىلعأ ةيلاعلا ةرارحلا ةجرد لماع مدختسن 60
مامحلا ةرارح ةجرد ديزت لا نأ بجيل م˚
نع يئاملا 70
نع ةرارحلا تداز اذا هتعيبط ريغتتو رسكتي هنلا م˚ 80
م˚ .
لمعلاًءانثاًةماهًتاظحلام
Amal AlGhamdi- MIC251-2011 15
1 - هيجوملا لاوطلأا نم لك دنع صاصتملاا ةجرد بسحي (
رتمونان ) NM
260-280 2 - لجسن ةيئوضلا ةفاثكلا ةؤارق
زاهجلا نم O.D.
.
3 - متي يوونلا ضمحلا زيكرت نم لك ريدقت
يلي امك هتواقن ةجردو DNA
.
3 - بسحن زيكرت
ضمحلا يوونلا
ةلداعملا يف ضيوعتلاب DNA :
CONC. OF DNA (UG/ML) = 𝑂.𝐷.260×50×𝑑𝑖𝑙𝑢𝑡𝑖𝑜𝑛 𝑓𝑎𝑐𝑡𝑜𝑟 1000
ليوحتلا لماعمCONVERSION FACTOR: = 1* OD 260 =50 MG OF DNA/ML
WITH DILUTION FACTOR OF 25 (I.E. 2ML IN 48ML), THIS FORMULA REDUCED TO:
MG DNA/ML = OD 260 X 1.25 4 - نوناقلا يف قبطن ةينيتوربلا بئاوشلا نم ةواقنلا ةجرد سايقل :
OD 260/OD 280 ≥ 1.7-1.8
• يوونلا ضمحلا زيكرت ناك اذإ اذه نم لقأ
هحلاص ةنيعلا نوكت لا ىدملا .
• يوونلا ضمحلا نابوذ مدع ينعي اذهو دوجو وأ
تانيتوربلا لثم بئاوش .
• يلوحكلا طولخملا مادختساب بيسرتلا ةداعإ متي كلذل .
Amal AlGhamdi- MIC251-2011 17
لاوأ : يوونلا ضمحلا ريرحتو ةيلخلا ليلحت :DNA
يرولب وا ةيجاجز تابيبح وأ ةللحملا تاميزنلإا مادختساب ةيلخلا للحت رطلا ءانثأ يف ة
يزكرملا د .
ميزنلإا وأ LYSOZYME
:
ا رادجلا تانوكمل ةيديسوكيلجلا ةطبارلل يئاملا ليلحتلا زيفحتب موقي تارديهوبركل
ةي
لخاد ايلاخلا دوجو يف مظنملا لولحملا
BUFFER SOLUTION :
ـلا ىلع يوتحملا لولحم هب دجاوتملا طسولا نوكي نأ دب لا ،مظنم لولحم ةروص يف DNA
ىلع يوتحي يحلم لولحم EDTA
.
يوونلا ضمحلا نيأت ببسب لا يف انابوذو ًاتابث رثكأ هنإف هبلاس هنحشل هلمحو DNA
ليلاحم
رطقملا ءاملا يف هنع هيحلملا .
9/25/2013
Amal KH Alghamdi 351 MIC 19
ـلا ةيمهأ :EDTA
1 - لثم هنحشلا ةيئانث ةبجوملا تانويلأا عم طبترت (
CD+2, MG+2, MN+2 )
عم حلامأ نوكت دق يتلا
يوونلا ضمحلا يف ةينويلأا تافسوفلا تاعومجم .DNA
2 - يوونلا ضمحلل للحملا ميزنلإا طيبثت DEOXYRIBONUCLEASE
تانويأ ىلإ جاتحي هنلأ
مويسينغملا MG+2
زينجنملا وأ MN+2
يوونلا ضمحلا ليلحت يف هتفيظوب موقي يكل .DNA
• يولقلا طسولا (
)PH=8 يوونلا ضمحلا نيب هيتيلورتكللإا تلاعافتلا للقي
تانوتسيهلاو DNA
ؤفاكتلا ةديدع تانيملأاو ةيولقلا .
• ةيلاعلا ةيولقلا (
ةجرد ةيلاعلا PH
) ميزنا طاشن نم للقت NUCLEASE
نيتوربلا ةعيبط ريغتو
• ًايناث : يوونلا ضمحلا دقعم لصف نيتوربلاو DNA
:
يب ةينويلأا تلاعافتلا ليطعتل ةلحرملا هذه يف ةداع تافظنملا مدختست تسهلا ن
ةبجوم تانو
يوونلا ضمحلل ةبلاسلا ةنحشلا عم هنحشلا .DNA
ةداع مدختسي SODIUM DODECYL SULPHATE
( :)SDS
1 - ةينويلأا ةديدش ةفص اهيطعيو تانيتوربلا عم طبتري نيأتم فظنم .
2 - ـلل ةللحملا تاميزنلإل فلتم (DNA
DEOXYRIBONUCLEASES )
نم هريغو
تانيتوربلا .
Amal AlGhamdi- MIC251-2011 21
• حلاملأا نم ةيلاعلا زيكارتلا (
لثم هريغو NACL
) ماتلا لصفلا نم دكأتلل فاضت
يوونلا ضمحلاب ةطبترملا تانيتوربلل ةبجوم تانيملأا عم ةطبارلا ليزتو هنعDNA
ةنحشلا .
• تابكرملاو يوونلا ضمحلا نيب ينويلأا طابترلاا ةوق حلاملأا فعضت ثيح جوم
ةب
هنحشلا .
اثلاث : يوونلا ضمحلا لصف ةبئاذلا ةيلخلا تانوكم نم هريغ نع DNA
ساب كلذو تانيتوربلا نم لولحملا ولخ نم دكأتلا بجي ،ةلحرملا هذه يف طيلخ مادخت
لوحكلا عم مروفورولكلا ISOAMYL ALCOHOL
يزكرملا درطلا مث .
رهظت كلذ دعب 3
تاقبط :
م طيرش لثمت ةيطسو ةقبط امهنيبو ةيوضع ىلفس ةقبطو ،ةلئاس ايلع ةقبط ضن
نم طغ
هوملا نيتوربلا .
نيتوربلل يحطس هيوشت مروفورولكلا ببسي لوحكلاو ISOAMYL ALCOHOL
ملا ةلصافلا ةقبطلا تابث ىلع دعاسيو هوغرلا للقي ةيوتح
نيتقبطلا نيب لصفتو نيتوربلا ىلع .
Amal AlGhamdi- MIC251-2011 23
• لا بيسرت متيو اهلصف متيو ةيوونلا ضامحلأا ىلع ايلعلا ةقبطلا يوتحت مح
يوونلا ض
لوناثيلإا لوحك مادختساب .
• يوونلا ضمحلل ةنيأتملا ةعيبطلا ببسب يف دجاوت اذإ نابوذلل لباق ريغ حبصي DNA
ةيبطقلا ضفخنم يوضع طسو .
• ةيجاجز اصع ىلع هفلب هعمج نكميو لكشلا يطيخ بسار يوونلا ضمحلا نوكي .
• يوونلا ضمحلاو تانيتوربلاب لوزعملا يوونلا ضمحلا ثولتي دق .RNA
• يحلم طسو يف بسرتملا يوونلا ضمحلا ةباذإب نيتوربلا نم صلختلا نكمي و
ةداعإ
لوحكلاو مروفورولكلا طيلخ مادختسا ISOAMYL ALCOHOL
نيتورب يا ىقبي لا ىتح
• يوونلا ضمحلا بسرتي لا ـلا عم RNA
يوونلا ضمحلل ةثولم ةروص يف دجاوتي دق هنكلوDNA .DNA
• هل للحملا ميزنلإا مادختساب هنم صلختلا نكمي RIBONUCLEASE
( RNASE )
نيتوربلا نم صلختلا دعب .
• لوحكلا مدختسي دق ISOPROBANOL
يوونلا ضمحلا بيسرتل يوونلا ضمحلا ًاكرات DNA
يف RNA
لولحملا .
• يوونلا ضمحلاو نيتوربلا لصف تاوطخ ةداعإ نكمي يوون ضمح ىلع لوصحلل تارم ةدع RNA
DNA
ةواقنلا يلاع .
• لصف متي نأ ضرتفي ةقيرطلا هذهب 50
% يوونلا ضمحلل يلكلا ىوتحملا نم طسوتمم ،ةيلخلا يف DNA
يواسي لوصحملا 1
- 2 ةيريتكبلا ايلاخلل بطرلا نزولا نم مج لكل مجلم .
Amal AlGhamdi- MIC251-2011 25
• نئاكلاب ةصاخلا تانيجلا عيمج ىلع ةيوتحملا ةيثارولا ةطيرخلا ديدحت قيقدلا يحلا
.
• هينيجورتينلا دعاوقلا عباتتو يئيزجلا هبيكرت يف يوونلا ضمحلا لمحي ةيثارولا تامولعملا عيمج
ةروص يف
تانيج .
• يوونلا ضمحلا لصف دنع نيسوتيسلا ىلإ نيناوجلا ةبسن ةفرعم نكمي تانئاكلل DNA
%G:C فيرعت يلاتلابو
اهعبتي يتلا ةكلمملا ةفرعمو يحلا نئاكلا .
ًمادختسإًةلثمأ
ًيوونلاًضمحلا
ًةيويحلاًهينقتلاًبراجتًيف DNA
BIOTECHNOLOGY :
9/25/2013
Amal KH Alghamdi 351 MIC 27
؟؟؟ببسلام
• لاا للاخ ملأا ةيلخلا نم ةمداق ايريتكبلل ةيثارولا ةداملا تناك اذإ
،يئانثلا راطشن اذاملف
سفن نم ثدحلأا لايجلأاب ةصاخلا تاردقلاو تافصلا يف ريغت دوجو ظحلان ونلا
ع
؟ةيويحلا تاداضملا ةمواقم لثم يريتكبلا .
9/25/2013
Amal KH Alghamdi 351 MIC 29