rAP CHỈ KHOA HỌC DHQGHN. KHTN & CN, T .x x , sỏ' 3, 2004
TÁCH DÒNG GEN MẢ HOÁ MỘT CHAT ứ c CHẺ TRIPXIN CỦA HẠT
BÍ Đ ỏ { C U C U R B I T A M A X I M A ) CMTI-V VÀ B I Ẻ Ư H I Ệ N Ở E. C O L IĐ ào Thị T h u ý , N g u y ể n Q uỳn h U yến , N g u y ể n Thị B ích H ậu, Vò T h ị T h ư ơ n g Lan và P h ạ m Thị Trân Châu
T ru n g tă m Công nghệ S in h học, Đại học Quốc gia Hà Nội
1. Mở đ ầ u
Các protein ức chê trip xin (TI) của h ạ t các cây họ bầu bí (C ucurbitaceae) tu y được phát hiện muộn hơn các TI thực v ậ t khác nhưng đã được quan tâm nghiên cứu nhiêu vì chúng có những đạc tín h quí về m ặt khoa học và có tiềm năng ứng dụng lớn.
Hạt của h áu hết các loại b ầu bí kê cả 2 TI có cấu trúc vòng mới được p h á t hiện từ h ạ t gấc [4] đêu có TI với khôi lượng p h ân tứ vào khoáng 3 kDa, có 3 cầu clisunfua, chúng dược xếp thành một họ mới, họ TI b áu bí (squash inhibitor) [9). Trong sô các TI họ b ầ u bí, các TI phân tứ thấp của h ạt bí đỏ (CMTI-I, III) được phát hiện sớm hơn cả và ngoài tác d ụ n g ức chế tripxin các TI này còn ức ch ế factor Xlla [6] (proteinaz-xerin xúc tác cho p h ả n ứng đẩu tiên trong quá trìn h đông máu). G ần đây [7] người ta còn phát hiện thỏm một TI khác từ hạt bí dỏ, CMTl-V khác với các CMTI đã biết, CMTI-V bao gồm 68 axit am in, và chi có 1 cẩu đisuníua, có khỏi lượng p h â n tử là 7,lk D a, có tính kiềm và cũng có tác d ụ n g ức chê đặc hiệu factor XIla. Tuy nhiên h à m lượng TI này ở h ạ t bí đỏ tương đôi thấp, vì vậy đà có một scY công trình nghiên cứu sử d ụ n g kỹ t h u ậ t ADN tái tô hợp đê tách dòng gen mã hoá chúng [ 1,2,13,14] với hy vọng có th ể sản x u ấ t bằng các biện pháp Công nghệ Sinh học.
Công trình này tách gen mã hoá CMTI-V từ h ạ t bí đỏ, sử dụng kỹ t h u ậ t ADN tái tô họp đế tách dòng và biếu h iện gen CMTI-V ở E.coli.
2. N g u y ên liệu v à p h ư ơ n g p h á p 2.1. Nguyên liêu
- Lá bí đô (C ucurbita m axim a) cần non tươi được sử dụng làm nguyên liệu đê tách ADN tổng số.
- Chúng E.coli DHõcx (MBI Ferm entas) được dùng làm t ế bào chủ đê n h â n bản plasmit tái tô hợp. C h ủ n g E.coli BL21 (DE3) của Life Technologies (Mỹ) được dùng đê biêu hiện protein tái tố họp. Các mồi clo Invitrogen life technologies tống hợp theo th iế t kê của chủng tôi. Các hoá ch ất th ô n g d ụ n g trong Sinh học phân tử của các h ã n g Sigma, Bio.Rađ, Promega. đNTPs, Mix ladder, Taq DNA polimeraz, X DNA ladder của Finnzym es, BamHI, Tị DNA ligaz của Promega. Tripxin tuỵ tạng bò và cơ ch ât BApNA (Nu-benzoyl-DL- arginine-p-nitroanilide hydrochloride) của Sigma; Plasm it pET 14b của h à n g Invitrogen;
Kit để tách ADN tổng số và tách p lasm it của Qiagen; X-gal (Bromo-4-chloro-3 indolyl-P-D- galaetopyranoside) của MBI F e rm e n ta s; Glass microfibre filters của W h atm an , Anh.
Đ à o T h ị T h ú y . Nizuvcn Q u ỳ n h U y cn .
2.2. Phương p h á p
- Tách ADN toàn phần từ lá bí đỏ:
ADN tông sô của lá bí đỏ non làm khuôn trong p h ả n ứng PCR được tách theo phương pháp của Eija Pehu và cộng sự [3]. Kiêm t r a h àm lượng và độ sạch của ADN bằng phương pháp đo độ hấp thụ ỏ bước sóng 260nm, 280nm; phương p h á p điện di trê n gel agaroz.
- Tách dòng và nh ản gen của CMTI-V Đà sử dụng 2 cặp mồi sau:
Mồi xuôi (forward primer) có chứa tru n g tâm n h ậ n biết của Ndel:
5 CAATGGATCCTCCTGCCCAGGTAAGTC 3
Mồi ngược (reverse primer) có chứa tru n g tâ m n h ậ n b iết của BamH I:
3 CGCGGATCCGCGTATACC G A T C C T C G G 5
Phản ứng PCR đê tổng hợp và kiếm tra lại gen CMTI-V được thực hiện như sau: thê tích hỗn họp phản ứng 25f.ll bao gồm: 2f.ll ADN genom bí đỏ (520ng ADN), l,25|.il mồi xuôi (225ng), 1.25|il mồi ngược (22õng), 0.5fil dNTPs (200|.iM), 0.5|.il Taq polimeraz (0.5IU),
19,5|.il đệm PCR 1 lần .
Chương trìn h chạy PCR: biến tính ADN khuôn ở 94°c tro ng 3 phút, nhiệt độ gắn mồi ở 63"C trong 1 phút, tổng hợp ở 72°c trong 1 phút, tổng sô" là 30 chu kỳ, n h â n lại gen CMTI- V trong 8 phút ở 72°c, cuôi cùng sản phẩm PCR được giữ ớ 4°c cho tới khi kiêm tra trên agaroz.
Kiểm tra sản phẩm PCR bằng phương pháp điện di trê n agaroz 2%, tinh sạch qua Glass Microfibre filters (GF/D, GF/C, W hatm an, UK).
- Phương pháp điện di ADN trên gel poliacrilam it 5% [12]: Đệm điện di TAE, tiến hành diện di ỏ điều kiện 90 phút, 150V. Sau khi điện di, cô định tro n g etanol 10% trong 5 phút, rửa bàng dung dịch HNO.ị 3% trong 3 phút, rử a b ằn g nước Milli Q 1 phút, nhuộm bàng AgNO;* 0,2% trong 20 phút, rửa sạch AgNO.3 bằn g nước Milli Q, cuối cùng hiện băng ADN bằng dung dịch Na , c o ị 3% và 0,1% focmaldehit tro n g k h o ản g 3 p h ú t, giữ gel trong axit acetic 10%.
- Điện di trên gel poliacrilamit 15% p h á t hiện b ăn g TI theo phương ph áp đã mô tả trước đây [8].
2.3. Thiết k ế v e c t ơ tái tô hợp
Plasmit pET-14b có chứa tru n g tâm n h ậ n biết của B am H I và Nde I được mở vòng bằng cách xử lí với 2 enzim này ở điểu kiện: 37°c trong 2 giờ.
T ạp ch i Khoa học Đ H Q G I IN . K Ì I T N C K . I XX. So 3. 2004
'lac'll ilònii *1011 m ã hóa m õi chãi ức chẽ.
San p h àm PCR n h â n bán ADN genom bí đỏ với mồi xuôi và mồi ngược dạc hiệu đã (luộc tinh sạch, cat với BamH I và Ncle I (ỏ điểu kiện 37“C trong 2 £ÌÒ'). đưa vào plasmit pKT-14b đà mỏ vòng bằn g 2 enzim trên.
Phán Íiníí íỊan được thực hiện ử 4°c trong thòi gian 16 giò' nhò T. liga/ [10].
Vectơ tái tô họp pET-14b - CMTI-V viết t á t (pET-TI-V) được biên nạp vào chủng E.coli DHõcx bằng phương p h áp sốc nhiệt [5].
Các thê biên nạp được sàn g lọc trê n môi trường thạch Luria-Bertani (LB) (l°b tripton, 0,5% cao nấm men, 1% NaCl) có bổ sung ampixilin (100|.ig/ml), nuôi qua đêm ỏ 'M"C. Chọn các k h u ẩ n lạc m ầu trắ n g (có m ang AON ngoại lai) cấy chuyền sang các đìa thạch trong môi trường LB có am pixilin (100|.ig/ml) đê dùng cho các thí nghiệm tièp theo.
Nuôi vi k h u ân E.coli D H õa tái tô hợp, tách plasm it tái tô hợp, tinh sạch (theo phương pháp Qiagen [11]. Cat bang 2 enzim giới h ạ n BamH I và Nde I, kiểm tra hằng phương pháp PCR, sản phárn dược kiêm t r a kích thước bằng cách điện di trên gel agaroz 2°() với thang chu an ADN.
Dòng vectơ m ang gen CMTI-V đà qua kiểm tra như trôn, được giãi trình tự vùng có cADN theo phương p h áp Sanger.
2.4. Biêu hiện pr otei n tái tô ìuỉp ỏ E.coli
Vectớ tái tô hợp pET-14b-TI-V được biến nạp vào chủng E.coli BL21 bằng phương pháp sồc n h iệ t [5].
S àn g lọc vi k h u â n tủi tô hợp trê n môi trường thạch LB có ampixilin, X-gal, các khuân lạc trá n g được nuôi trôn môi trường lỏng có chứa ampixilin (100|Ag/ml) ở 37°c đến khi đạt g\{\ trị 00,;,,,,= 0,6. Thêm IPTG (isopropyl P-thiogalactoside) đê cảm ứng biếu hiện protein (tích.
Thu sinh khôi tê bào, phá m àng tê bào b ằ n g siêu ám (máy Sonicprep 150 cua Đức), 1 thể tích tê bào + 50 th ể tích d u n g dịch đệm TE (lOmM Tris-HCl, lm M EDTA, pH=8,0), li tâm 12.000 vòng /p h ú t ớ 4°c trong 30 phút, th u dịch trong giữ ỏ — 20nc đê cho các thí nghiệm tiỏp theo. Kiếm t r a h o ạ t tín h của protein tái tô hợp bằng phương pháp PAGE có chứa cơ ch ấ t [8].
3. Kết q u á và t h ả o lu ậ n
3.1. Tách và tinh chê ADN tổng sô
Lá bí đỏ non nghiền trong nitơ lóng, chiết theo tỉ lệ 1:4 (mg/f.il) dung dịch AP, nồng độ RNAz cuôi cùng là lOO^g/ml, giữ ở 65°c trong 10 phút, thêm 130 Ị.il AP, giữ trong nước đá 5
Tạp ('In Khoa học t ) Ỉ I Q ( i l / \ . K / Ỉ T N cC C/V. I XX, SỐ J. 2004
4 Đ à o T h ị T h ú y , N íĩu v ẻ n Q u ỳ n h U y ên .
phút, li tám, thu dịch nổi, cho qua cột QIA shreder (QIAsMC), thu dịch qua cột. Thêm dung dịch AP.J, etanol vào dung dịch n h ận được qua cột theo tỉ lệ thê tích 0,5:1:1, trộn đều cho toàn bộ hỗn dịch này qua cột Dneasy MC, rửa cột 2 lần bằng dưng dịch đệm AW. Thôi ADN khỏi cột bằng 100f.ll dung dịch đệm AE. Kiêm tra nồng độ và độ sạch của ADN tống số bằng điện di trên agaroz và trên máy quang phô (spectronic Unicam). Kết quả n h ận được tỉ lệ OD2(;o/ODJ8() là 1,86-1,90, chứng tỏ chế phẩm có độ sạch đ ạt yêu cầu. Điện di trê n gel agaroz 0,8% với th an g chuẩn X ADN các nồng độ khác nhau cho thấy hàm lượng ADN tống số’ thu được là 260ng/ml. Như vậy, ADN thu được có chất lượng tốt và hàm lượng đủ cho các nghiên cứu tiếp.
3.2. Nhản bản đoạn gen CMTỈ-V từ ADN genom bí đủ bằng kỹ th uật PCR
Sứ dụng ADN đã tin h sạch làm khuôn trong phán ứng PCR, với mồi xuôi, mồi ngược và các điều kiện phản ứng như đã nêu trong phần phương pháp. Theo tính toán lí thu y ết sê nhận được sản phẩm phản ứng có kích thước 230bp. Kết quá điện di trên gel poliacrilamit 5% (hĩnh 1) cho thấy sản phẩm PCR thu được có 1 băng với kích thước đúng như tính toán lí thuyết vào khoáng 230bp.
H ì n h 1: Đ i ệ n di đ ồ s á n p h ẩ m P C R s ứ d ụ n g A D N g e n o m b í n g ô l à m k h u ô n
1 - T h a n g A D N c h u ẩ n (1 0 0 - 1 0 0 0 0 b p )
2 - S ả n p h ẩ m P C R - 2 3 0 b p
— 2 3 0 b p
1 2
Phân tích trình tự nưcleotit chứng tỏ đúng là gen CMTI-V (kết quả không trìn h bày ở đây). Ngoài ra, chúng tôi cùng đã tống hợp gen mă hoá CMT1-V theo phương pháp đã mô tả trước đây [14] và nhân đoạn gen đã được tông hợp bằng kỹ th u ậ t PCR với 2 phản ứng PCR
Tạp chi Khoa học Đ Ỉ I Q G I /N . K Ỉ Ỉ T N á C N . I XX. Sò'3, 2004
Tách dònc gcn mã hóa một chất ức chẽ. 5
nôi tiếp nhau, phản ứng sau sử dụng sản phẩm của phản ứng trước làm khuôn, với 2 mồi xuôi và ngược. Kết quả trên hình 2 cho thấy sản phẩm PCR có kích thước khoảng 230bp, đúng theo tính toán lí thuyết. Sản phâm PCR được tin h sạch qua màng Recochip, nhận được một băng ADN sác nét, có kích thước tương ứng 230bp (hình 3).
— 1353
— 1078
— 872
— 603
— 310
— 281
— 234
— 194 -►118 -*72
1 2 3 4 5 6
H ì n h 2: K ế t q u ả t ồ n g h ợ p g e n C M T I-V 1 - S ả n p h ẩ m P C R 1 với n ồ n g
độ c ủ a m ồ i m ồ i là 2 0 0 n g 2- S ả n p h ấ m P C R 1 với n ồ n g
độ của m ồ i m ồi là 2 5 0 n g 3 - T h a n g A D N c h u ấ n (lOObp)
4,5- S ả n p h ẩ m P C R 2, m ồi xu ô i, mồi ngư ợc, k h u ô n là s ả n p h à m P C R l .
1 2 3
H ì n h 3: K ế t q u ả t i n h s ạ c h s ả n p h ẩ m P C R c ủ a g e n C M T I - V
1- T h a n g A D N c h u ẩ n (lOObp)
2- S ả n p h ẩ m P C R ( c ủ a cột 4, 5 ả n h 3) s a u k h i t i n h s ạ c h
3- T h a n g A D N c h u ẩ n Â/Hae III (lOObp)
3.3. Tách dòng gen CMTI-V
Đê thu được đủ sô* lượng gen CMTI-V dùng trong biến nạp, sản phẩm PCR nhân bản từ genom bí đò đã được tinh sạch, cắt bằng BamHI và Ndel, điện di trê n gel agaroz 2 % đê tách và tinh sạch gen CMTI-V, nôi vào plasmit pET 14b cũng đã được cắt với 2 enzim BamHI và Ndel. Quá trình gắn gen vào plasmit được thực hiện nhờ T .J ligaz. Vectơ mang gen CMTI-V (được kí hiệu là pET-TI-V) được biến nạp vào tê bào kh ả biến E.coli chủng DHõa đê n h ân vectơ tái tô hợp. Kết quả biến nạp được sàng lọc' trên môi trường LB-agar có
Tạp chi Khoa học D H Q G IIN . K H I N Ầ CA/. T.xx, S ổ 3, 2004
6 Đ à o T h ị T h ú y , N g u yễn Q u ỳ n h U yên.
ampixilin, X-gal và IPTG, các k h u ẩn lạc m àu trắ n g (khuẩn lạc dương tính) là các vi k h u ẩn tái tồ hợp có chứa pET-TI-V.
3.4. Kiếm tra tiếp sản p h ẩ m biên nạp bằng PCR
Tách ADN plasm it từ các k h u ẩ n lạc dương tính dùng làm khuôn trong PCR với cặp mồi xuôi, ngược đặc hiệu của gen CMTI-V. Kết quả trên hình 4 cho thấy sản phẩm PCR có 1 băng ADN sắc nét được nh ân bản từ các vectơ tái tổ hợp có kích thước tương ứng vối sản phẩm PCR khi sử dụng ADN genom bí đỏ làm khuôn, đã được tách dòng trong E.coli.
Hình 4: Đ i ệ n di đồ s ả n p h ẩ m P C R t r ê n P A G E 5% A D N p l a s m i t t á c h t ừ các k h u â n lạ c d ư ơ n g t í n h
1 - T h a n g A D N c h u ẩ n ( 1 0 0 - 1 0 0 0 0 b p ) 2- S ả n p h ẩ m P C R s ử d ụ n g A D N
p l a s m i t
t á i t ô h ợ p l à m k h u ô n với c ặ p mồi đ ặ c
h i ệ u c h o g e n C M T I - V
3- S ả n p h ẩ m P C R s ử d ụ n g A D N g e n o m b í đỏ l à m k h u ô n
Đế tiếp tục kiểm tra sản phẩm biến nạp, plasm it của các k h u ẩ n lạc dương tính đã được tinh sạch và xác định trìn h tự nucleotit của đoạn gen đích nối vào plasm it pETl4b.
Kết quả được trình bày ở hình 5.
0
-£ 500
400 300
200 230bp
100
Tạp chí K lioa liọc Đ H Q G H N . K I I T N & C N , r.xx, S ố 3 ,2 0 0 4
Tách cỉòiìi! nen m à hóa một chất ức chê. 7
1 0 2 0 3 0 1*0
G G i : ' I í G G G C C C G 1 c C ì i: 1 C c i: G c 1
S O 6 0 7 0 8 0 VO
I c c c c: c ] i: r. G V c c I I ft tì A G c I G 1 \ H I c c i G G G G G
1 0 0 1 1 0 1 2 0 1 3 0 11 (0
Ũ c i: i: G c c ! 1 c I* c G T c c ‘ì f< c fi c G G c G I V. 1 c c G
; c c G c »: i G c c ' c r> c c n c • : G c c • 1 i: c c ( I C C c c
atccgaacgttaaagctgttatcctggaagaaggtacaccagttaccaaggaettcaggt 120 gcaacagggttaggatctgggttaacaagagagtctggtagtatcaccaccgaggatcgg 180 ttaacgcggatcatggctgccgcgcggcaccaggccgctgctgtgatgatgatgatgat 240
Hình 5: K ế t q u a x á c đ ị n h t r ì n h t ự đ o ạ n A D N p l a s m i t t á i tố h ợ p có c h ứ a g e n C M T I-V
3.5. Biêu hiện gen CMTI-V trong E.coli BL21
Plasm it tái tô hợp pET-TI-V được biến nạp vào E.coli BL21 (DE3), kí hiệu là BL21- pET-TI-V. Sau khi biến nạp, cấy trải vi k h u ẩn tái tổ hợp trên môi trường LB đặc có ampixilin và X-gal, chọn các khuẩn lạc trắ n g (khuẩn lạc dương tính, đã được biến nạp) nuôi cấy tiếp trên môi trường LB lỏng có ampixilin ỏ
37°c
qua đêm, tách plasm it và kiêm tral ap chí Khoa học D H Q G ỈIN . K I I T N & C N . I .XX. So 3, 2004
8 Đ à o T h ị T h ú y , N g u yễn Q u ỳn h U y ển .
bằng kỹ th u ậ t PCR. Kết .quả trên hình 6 và 7 cho thấy các k h u ẩn lạc đều cho sản phẩm PCR đúng kích thước đã dự tính.
230bp
8 9 1011
230b|
H ì n h 6: Đ i ệ n di đồ s á n p h ấ m P C R t r ê n gel a g a r o z 2% (sứ d ụ n g A D N p l a s m i t t á i tô h ợ p t á c h t ừ c ác k h u â n l ạ c k h á c n h a u c ủ a B L 2 1 - p E T - T I - V l à m k h u ô n ) .
1- T h a n g A D N c h u ẩ n
( M a r k e r M ix: t ừ 1 0 0 - 1 0 0 0 0 b p )
2-11: s ả n p h ẩ m P C R c ủ a A D N p l a s m i t c ủ a các k h u â n lạc d ư ơ n g t í n h k h á c n h a u
1 2 3 4 5 6
Hình 7: Điện di đồ sản phẩm PCR trên PAGE 5% (sử dụng ADN plasmit
t á i tô h ợ p t á c h t ừ c á c k h u ẩ n lạc k h á c n h a u c ủ a B L 2 1 - p E T - T I - V l à m k h u ô n ) .
1 - Thang ADN chuẩn
(Marker lOObp: từ 80-1031bp) 2,3 - Đôi chứng: sản phẩm PCR ban đầu
(sử dụng ADN genom bí đỏ làm khuôn với mồi xuôi, ngược (1 Ị-il và 0,5f.il) 4,5,6 - Sản phẩm PCR của các ADN
p l a s m i t t á c h t ừ c á c k h u ẩ n lạc k h á c n h a u c ủ a B L 2 1 - p E T - T I - V .
Các khuẩn lạc dương tính được nuôi trên môi trường LB lỏng, cảm ứng bằng IPTG đê biếu hiện gen CMTI-V. Chúng tôi đã tiến h àn h nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ chất cảm ứng, thòi gian, nhiệt độ nuôi cấy v.v... đến quá trìn h biểu hiện (kết quả không trình bày ở đây). Ớ các điều kiện đã lựa chọn tiến hàn h nuôi vi k h u ẩn trê n máy lắc hoặc lên men. Sau khi thu tê bào vi khuẩn, phá võ màng tê bào và li tâm.
Kiểm tra hoạt tín h của protein tái tổ hợp có trong dịch nổi sau li tâm bằng phương pháp điện di trên gel poliacrilamit không có SDS, có cơ chất [8]. Kết quả trên hình 8 cho thây có một băng TI chủ yếu (băng m àu xanh trefi nền trắng).
Tạp chí Khoa học Đ H Q G ỈỈN , K H I N & C N . r.xx. Sô'3. 2004
Tách dòiiíi ecu mã hóa một chãi ức chc. 9
Hình 8: Điện di trên gel poliacrilamit 15%
không SDS, có cơ chất, băng TI có màu xanh
4. Kết luận
1. Đã tách tinh chế ADN genom của bí đỏ có độ sạch đạt tỉ lệ OD260/OD280 là 1,86-1,90.
2. Gen mã hoá CMTI-V đã được n h ân lên bằng kỹ t h u ậ t PCR khi sử dụng ADN genom bí đỏ làm khuôn, đã tin h sạch và xác định trìn h tự.
Gen mã hoá CMTI-V cũng đã được tổng hợp th à n h công từ 4 mồi gôl nhau.
3. Đã th iết kê vectơ tái tố hợp mang gen CMTI-V (pET-TI-V) và n h ân dòng trong E.coli DH5a
4. Biểu hiện gen CMTI-V trong E.coli BL21, nh ận được protein tái tổ hợp có hoạt tính ức chê tripxin.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Bolewska, K., Krowarsch, D., Otlewski, J., Jaroszewski, L., Bierzynski, A., Synthesis, cloning and expression in E.coli of a gene coding for the Met 8->Leu CMTI-I- a
r e p r e s e n t a t i v e o f s q u a s h i n h i b i t o r s o f s e r i n e p r o t e i n a s e s F E B S L e t t e r s V . 3 7 7 ( 1 9 9 5 ) , p p
172-174.
2. Botes DP., Qobose MD., Corfield VA. Synthesis of wild type and three mutant Cucurbita maxima trypsin inhibitor encoding genes by a single-strand approach. Gene V. 105 N" 2 (1991), pp 243-247.
3. Deana Namuth, Kimmo Koivu, Jelena Arbatova, Viktor Kuvshinov and Eija Pehu.
Advanced plant Molecular Biology Laboratory M anual, University of Helsinki, Finland (1998), pp 4-7
4. Hernandez, J.F., Gagnon, J., Chiche, L., Nguyen, T.M, xA.ndrieu, J.P., Heitz, A., Trinh H.T., Pham T.T. Chau., and Le Nguyen D., V. Squash trypsin inhibitors from Momordica cochinchinensis exhibit an atypical macrocyclic structure. Biochemistry, V. 39 (2000), pp 5722-5730.
5. Hioraki Inoue, Hiroshi Nojima and Hiroto Okayama, Transformation of E. coli with plasmids, Genef96 (1990), pp 23-28.
Tạp chi Khou học Đ H Q G H N. K H T N & C N . r.xx. So 3, 2004
10 Đ à o T h ị T h ú y . Nszuycn Q u ỳ n h U ycn .
6. Hojima, Y., Pierce, J.V., and Pisano, J.J., Pumpkin seeds inhibitor of human Faxtor Xlla, (activated Hageman factor) and bovine trypsin. Biochemistry V.21, (1982), pp 3741-3746.
7. Krishnamoorthi, R., Gong, Y.-X., and Richardson, M. A new protein inhibitor of trypsin and activated Hageman factor from pumpkin (Cucurbita maxima) seeds. FEBS Letter. V. 273,
( 1 9 9 0 ) . p p 1 6 3 - 1 6 7 .
8. Pham Tran Chau, Konopska L., Leluk J., Trypsin inhibitors in the aleurone grains of Cucurbita pepo var. patissonina (white bush) cotyledons. Biochem. Physiol, pflartz V. 181
( 1 9 8 6 ) , p p 5 6 5 - 5 6 9 .
9. Polanowski, A., Otlewski, J., Leluk, J., Wilimowska - Pelc, A., and Wilusz, T., . A new family of serine proteinase inhibitors from squash seeds. Biol. Zentralbl V. 107, (1988), pp
4 5 - 4 9 .
10. Promega Protocols and Applications Guide (1989), pp 52-56.
11. Qiagen Mini Hand book (1999), p p 9 - ll .
12. Ulrike Schindler and Anthony R. Cashmore. Methods in Plant Molecular Biology A Laboratory Course Mannual, (1995), Cold Spring Harbor laboratory Press in USA, pp 275-277.
13. Võ Thị Thương Lan, Phạm Thị Trân Châu, Phân lập gen mã cho tripxin inhibitor (TI-IV) từ một sô cây thuộc họ bầu bí bằng kỹ thuật PCR. Di truyền và ứng dụng. Chuyên san CNSH
( 2 0 0 0 ) , p p . 3 2 - 3 6 .
14. Wen L., Kim S-S., Tinn T.T., Hoang J-K., Krishnamoorthi Gong Y., Lwin Y. N., and Kyin s.
C h e m i c a l s y n t h e s i s , M o l e c u l a r c l o n i n g , o v e r e x p r e s s i o n a n d s i t e - d i r e c t e d m u t a g e n e s i s o f t h e
gene coding for pumpkin (Cucurbita maxima) trypsin inhibitor CMTI-V. Protein Expression and purification V.4 (1993), pp. 215-222.
VNU. JOURNAL OF SCIENCE. Nat., Sci., & Tech., T .x x , N03, 2004
CLONING AND EXPRESION IN E.COLI OF THE GENE CODING FOR PUMPKIN (CUCURBITA MAXIMA) TRYPSIN INHIBITOR, CMTI-V
D ao Thi Thuy, N g u y e n Q u yn h U yen, N g u y e n Thi B ic h Hau, Vo Thi T h u o n g Lan and P h a m Thi T ran C hau
Centre o f Biotechnology, Vietnam N ational U niversity, H anoi
CMTI-V is a trypsin inhibitor discovered in 1990. from p u m p k in seeds. It consists of 68 amino acid residues in a single chain and one didulfide bridge, M r of T.lkDa. The CMTI- V also specifically inhibits factor Xlla. However the content of CMTI-V in pum pkin seeds is rather low, therefore it is worthy to study the gene encoding CMTI-V, cloning and expression of the gene in E.coli.
For this purpose, the total genomic DNA from pum pkin (C ucurbita m axim a) was isolated and purified. The CMTI-V gene was sucessfully cloned from genomic DNA of pumpkin by PCR technique, using its specific forward and reverse prim ers containing restriction enzyme specific sites. The PCR amplified product was inserted into plasmid pET-14b to form pET-14b-CMTI-V and transform ed into E.coli DH 5a. Selection and checking the positive clones by PCR and th e targ e t gene in recom binant vector was sequenced. The obtained results indicated t h a t the gene was sucessfully cloned. The target gene was expressed in E.coli BL21 (DE3) and the recom binant protein was tested for inhibitory activity against trypsin on PAGE containing substrate. One major TI band was found.
Tạp chí Khoa học D H Q G ỈỈN . K i n N á C N . T.xx. S ố 3. 2004
