XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI
AMOXICILLIN VÀ ACID CLAVULANIC BẰNG PHƯƠNG PHÁP QUANG PHỔ UV-VIS
Nguyễn Chí Toàn* và Tào Việt Hà Trường Đại học Tây Đô (*Email: [email protected]) Ngày nhận: 01/11/2021
Ngày phản biện: 10/02/2022 Ngày duyệt đăng: 01/3/2022
TÓM TẮT
Hiện nay, amoxicillin kết hợp với acid clavulanic trong cùng một chế phẩm được sử dụng rộng rãi để điều trị các bệnh nhiễm trùng do vi khuẩn tiết ra β - lactamase đề kháng amoxicillin nên phải có phương pháp định lượng đồng thời hai hoạt chất trên trong cùng một chế phẩm. Nghiên cứu nhằm mục tiêu xây dựng quy trình định lượng đồng thời hỗn hợp hai thành phần amoxicillin và acid clavulanic bằng phương pháp quang phổ. Ứng dụng phương pháp này để thẩm định định lượng đồng thời amoxicillin và acid clavulanic trong viên nén Augmentin. Phương pháp được thực hiện bằng cách sử dụng máy đo quang phổ UV-Vis với bước sóng sử dụng trong phân tích là 199 nm và 228 nm. Kết quả cho thấy có sự tuyến tính trong khoảng nồng độ 1,2 - 4,5 mg/l đối với clavulanat kali và 4,03 - 15,2 mg/l đối với amoxicillin. Phương pháp này được thẩm định với các chỉ tiêu: Độ đặc hiệu, độ đúng với tỷ lệ phục hồi nằm trong khoảng 97 - 103%, độ lặp lại với RSD < 2%, giới hạn định lượng và giới hạn phát hiện đối với amoxicillin là 2,01 mg/l và 0,61 mg/l; Đối với clavulanat kali là 0,6 mg/l và 0,18 mg/l, sử dụng phương pháp này đã định lượng đồng thời được 2 hoạt chất amoxicillin và acid clavulanic có trong viên nén Augmentin đạt theo tiêu chuẩn Dược Điển Việt Nam.
Từ khóa: Amoxicillin, acid clavulanic, máy quang phổ UV-Vis, quy trình định lượng
Trích dẫn: Nguyễn Chí Toàn và Tào Việt Hà, 2022. Xây dựng quy trình định lượng đồng thời amoxicillin và acid clavulanic bằng phương pháp quang phổ UV-Vis. Tạp chí Nghiên cứu khoa học và Phát triển kinh tế Trường Đại học Tây Đô. 14:
191-202.
*Ths. Nguyễn Chí Toàn – Giảng viên Khoa Dược và Điều dưỡng, Trường Đại học Tây Đô
1. GIỚI THIỆU
Đề kháng kháng sinh là vấn đề đã và đang diễn ra ngày càng phức tạp, gây nhiều khó khăn trong việc điều trị các bệnh nhiễm khuẩn ở Việt Nam nói riêng và thế giới nói chung. Để tăng khả năng điều trị, các chế phẩm dược có sự kết hợp của nhiều hoạt chất được bào chế.
Một trong những sự kết hợp điển hình đó là amoxicillin và acid clavulanic (Lê Minh Trí, 2009).
Sự phối hợp giữa amoxicillin, một kháng sinh họ
- lactam với acid clavulanic, một chất ức chế không hồi phục
- lactamase trong cùng một chế phẩm được sử dụng rộng rãi để điều trị các bệnh nhiễm trùng do vi khuẩn sản sinh
- lactamase đề kháng amoxicillin (Trần Đức Hậu, 2007), có rất nhiều chế phẩm kháng sinh trên thị trường có sự kết hợp giữa amoxicillin và acid clavulanic, dưới dạng amoxicillin trihydrat và clavulanat kali. Từ thực tiễn này, cần có phương pháp định lượng đồng thời các hoạt chất này trong cùng một chế phẩm. Phương pháp phổ biến để định lượng đồng thời chế phẩm có sự kết hợp trên là sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC). Ưu điểm của phương pháp này là có tính đặc hiệu, độ chính xác cao, cho kết quả ổn định, nhanh chóng cho việc kiểm nghiệm. Tuy nhiên, HPLC có các điểm hạn chế như phải sử dụng hóa chất, dung môi có độ tinh khiết cao, thiết bị đắt tiền.Đặc điểm tính chất của amoxicillin và clavulanat kali là cả hai chất này đều có khả năng hấp thụ ánh sáng ở vùng tử ngoại, nên có thể sử dụng máy quang
phổ UV-Vis để định lượng đồng thời hai chất này. Vì thế mục tiêu nghiên cứu nhằm thử nghiệm xây dựng quy trình định lượng đồng thời hỗn hợp hai thành phần amoxicillin và acid clavulanic bằng phương pháp quang phổ. Ứng dụng phương pháp đã xây dựng để thẩm định định lượng đồng thời amoxicillin và acid clavulanic trong viên nén Augmentin.
2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Phương pháp nghiên cứu này dựa trên tài liệu “Thẩm định quy trình phân tích bằng đo quang phổ tử ngoại khả - khả kiến UV-Vis” Phụ lục số 8, Sổ tay đăng ký thuốc, được ban hành bởi Cục quản lý Dược (Bộ Y tế, 2013).
Sử dụng Amoxicillin trihydrat với hàm lượng 99,5% tính trên lượng khan, đạt tiêu chuẩn IP USP 37 Acid clavulanic với hàm lượng 91,7%, được cung cấp bởi công ty Lek Pharmaceuticals, nước cất 2 lần đạt tiêu chuẩn phân tích.
Máy quang phổ hai chùm tia UV - 1800 SHIMAZDU (Nhật) được kết nối với máy tính (chạy hệ điều hành Window 7) với phần mềm chuyên dụng UV Probe 2.50, Máy siêu âm Elmasonic (Đức), Cân phân tích 4 số lẻ OHAUS CORPORATION (Mỹ).
Mẫu placebo: Là mẫu bao gồm các thành phần giống hệt như mẫu thử nhưng không chứa hoạt chất cần định lượng. (Đặng Văn Hòa và Vĩnh Định, 2011).
Công thức của các tá dược như sau (Lê Quan Nghiệm và Huỳnh Văn Hóa, 2007):
- Tinh bột biến tính: 15 - 20%
- Avicel: 10 - 30%
- Mg stearate: 1,2 - 1,5%
- Talc: 0,5%
Trên thực tế các tá dược, độ trơn chảy, rã sử dụng để sản xuất viên nén rất đa dạng, nên việc chọn các tá dược như trên chưa đại diện. Tuy nhiên, tạm chấp nhận cho áp dụng cho những viên nén có thành phần tá dược trên. % tá dược có trong 1 viên là 100 a%.
Tiến hành chọn % từng loại tá dược tương ứng với lượng thực tế.
Lượng cân của từng loại tá dược được tính theo công thức:
𝑚(𝑡á 𝑑ượ𝑐)𝑖 = %(𝑡á 𝑑ượ𝑐)𝑖 . 𝑚 ̅̅̅
. 𝑚𝑐ℎ𝑢ẩ𝑛(𝐴𝑇 + 𝑃𝐶) 𝑚𝑣𝑖ê𝑛(𝐴𝑇 + 𝑃𝐶)
(g) (1)
Cân và cho tất cả tá dược vào cùng một bình định mức 100 ml, thêm khoảng 70 ml nước cất và lắc đều, siêu âm khoảng 15 - 20 phút, bổ sung nước cất tới vạch, ta được bình 1. Hút chính xác 10 ml dung dịch từ bình 1 cho vào bình định mức 100 ml, bổ sung nước cất tới vạch, lắc đều, ta được bình 2, hút chính xác 10 ml dung dịch từ bình 2 cho vào bình định mức 100 ml, bổ sung nước cất tới vạch, lắc đều, ta được bình 3.
- Lựa chọn các bước sóng phân tích:
Tiến hành quét phổ bình 3 của các chất chuẩn amoxicillin trihydrat và clavulanat kali từ 190 nm đến 400 nm. Lựa chọn 2 bước sóng có cực đại hấp thu thích hợp,
đồng thời thỏa điều kiện hai bước sóng này cách nhau không dưới 10 nm. Tiến hành khảo sát tính tuyến tính bằng cách dựng đường chuẩn y = ax + b.
- Khảo sát tính cộng phổ của dung dịch hỗn hợp:
Tiến hành quét phổ bình 3 của mẫu chuẩn và đo điểm tại 2 bước sóng đã chọn của 2 chất chuẩn. Tính cộng phổ của dung dịch hỗn hợp là đúng khi tổng độ hấp thu thành phần tại mỗi bước sóng bằng độ hấp thu của hỗn hợp.
- Thẩm định quy trình: Quy trình định lượng được thẩm định theo hướng dẫn của ICH trên nền mẫu thuốc bao gồm:
Tính đặc hiệu, Độ đúng, Độ chính xác liên ngày, Giới hạn phát hiện, Giới hạn định lượng, Tính tuyến tính.
Chuẩn bị mẫu
Mẫu chuẩn AT (amoxicillin trihydrat)
Cân chính xác khoảng một lượng chất chuẩn amoxicillin trihydrat cho vào bình định mức 100 ml, thêm khoảng 70 ml nước cất và lắc đều, siêu âm khoảng 15 phút, bổ sung nước cất tới vạch, ta được bình 1. Hút chính xác 10 ml dung dịch từ bình 1 cho vào bình định mức 100 ml, bổ sung nước cất tới vạch, lắc đều, ta được bình 2. Hút chính xác 10 ml dung dịch từ bình 2 cho vào bình định mức 100 ml, bổ sung nước cất tới vạch, lắc đều, ta được bình 3. Hút chính xác các thể tích: 4 ml; 6ml; 8 ml; 10ml; 12 ml;
15 ml từ bình số 2 ở trên cho vào 6 bình định mức 100 ml, thêm nước cất tới vạch, lắc đều.
PC (Potassium clavulanat)
Cân chính xác khoảng một lượng chất chuẩn Potassium clavulanat cho vào bình định mức 100 ml, thêm khoảng 70 ml nước cất và lắc đều, siêu âm khoảng 15 phút, bổ sung nước cất tới vạch, ta được bình 1. Hút chính xác 10 ml dung dịch từ bình 1 cho vào bình định mức 100 ml, bổ sung nước cất tới vạch, lắc đều, ta được bình 2. Hút chính xác 10 ml dung dịch từ bình 2 cho vào bình định mức 100 ml, bổ sung nước cất tới vạch, lắc đều, ta được bình 3. Hút chính xác các thể tích: 4 ml; 6ml; 8 ml; 10ml; 12 ml; 15 ml từ bình số 2 ở trên cho vào 6 bình định mức 100 ml, thêm nước cất tới vạch, lắc đều.
Mẫu hh chuẩn AT và PC: Cân chính xác một lượng mẫu chuẩn gồm AT và PC chuẩn cho vào bình định mức 100 ml, thêm khoảng 70 ml nước cất và lắc đều, siêu âm khoảng 15 - 20 phút, bổ sung nước cất tới vạch, ta được bình 1.
Hút chính xác 10 ml dung dịch từ bình 1 cho vào bình định mức 100 ml, bổ sung nước cất tới vạch, lắc đều, ta được bình 2. Hút chính xác 10 ml dung dịch từ bình 2 cho vào bình định mức 100 ml, bổ sung nước cất tới vạch, lắc đều, ta được bình 3.
Mẫu placebo: Là mẫu tự tạo, có công thức và thành phần các chất hoàn toàn giống như mẫu thử (Bộ Y tế, 2011). Cân lượng amoxicillin trihydrat và clavulanat kali giống như mẫu chuẩn, thêm lượng tá dược giống như khi tạo mẫu placebo, tất cả đều cho vào cùng một bình định mức 100 ml, thêm khoảng 70 ml nước cất và lắc đều, siêu âm khoảng 15-20
phút, bổ sung nước cất tới vạch, ta được bình 1.
Hút chính xác 10 ml dung dịch từ bình 1 cho vào bình định mức 100 ml, bổ sung nước cất tới vạch, lắc đều, ta được bình 2. Hút chính xác 10 ml dung dịch từ bình 2 cho vào bình định mức 100 ml, bổ sung nước cất tới vạch, lắc đều, ta được bình 3.
Dung môi pha mẫu: nước cất Mẫu thử Augmentin:
Mẫu thử: Là viên nén bao phim Augmentin
K là hệ số chuyển đổi:
- Đối với amoxicillin 𝐾𝐴𝑚𝑜𝑥 = 𝑀𝐴𝑚𝑜𝑥
𝑀𝐴𝑇 = 365,4
419,4 - Đối với acid clavulanic 𝐾𝐶𝑙𝑎𝑣 = 𝑀𝐶𝑙𝑎𝑣
𝑀𝑃𝐶 = 199,16
237,3
Vậy khối lượng amoxicillin trihydrat và clavulanat kali thực tế có trong viên Augmentin chứa 500 mg amoxicillin và 125 mg acid clavulanic là:
𝑚𝑣𝑖ê𝑛(𝐴𝑇 + 𝑃𝐶) = 500
𝐾𝐴𝑚𝑜𝑥 + 125
𝐾𝐶𝑙𝑎𝑣 (mg) (2)
Cân 20 viên Augmentin (đối tượng nghiên cứu) đã loại vỏ bao, tính khối lượng trung bình viên 𝑚̅. Tỷ lệ % (amoxicillin trihydrat và clavulanat kali) có trong viên là:
a% = 𝑚𝑣𝑖ê𝑛(𝐴𝑇 + 𝑃𝐶) . 100 𝑚̅
Vậy lượng cân mẫu thử là:
𝑚𝑐â𝑛(𝐴𝑇 + 𝑃𝐶) = 𝑚𝑐ℎ𝑢ẩ𝑛(𝐴𝑇 + 𝑃𝐶)
𝑎% (g) (3)
Cân chính xác một lượng mẫu thử đã tính toán cho vào bình định mức 100 ml, thêm khoảng 70 ml nước cất và lắc đều, siêu âm khoảng 15 - 20 phút, bổ sung nước cất tới vạch, ta được bình 1. Hút chính xác 10 ml dung dịch từ bình 1 cho vào bình định mức 100 ml, bổ sung nước cất tới vạch, lắc đều, ta được bình 2. Hút chính xác 10 ml dung dịch từ bình 2 cho vào bình định mức 100 ml, bổ sung nước cất tới vạch, lắc đều, ta được bình 3. Gọi 𝐶𝑗 (mol/l) là nồng độ của từng chất sau khi định lượng mẫu thử. Hàm lượng trong 1 viên là: ℎ𝑗 =
𝑚𝑣𝑖ê𝑛(𝐴𝑇 + 𝑃𝐶) . 𝐶𝑗 . 𝐾
𝑚𝑐â𝑛(𝐴𝑇 + 𝑃𝐶) (g) (4)
3. KẾT QUẢ
3.1. Lựa chọn bước sóng phân tích Kết quả quét phổ UV-VIS ở thang sóng 400-199 nm các dung dịch chuẩn amoxicillin và clavulanat kali thu được kết quả ở Hình 1. Có 3 bước sóng có cực đại hấp thu là 339 nm, 199 nm và 193 nm. Tại bước sóng 339 nm có độ hấp thu quá nhỏ, nên (A = .l.C) sẽ rất nhỏ, không chọn bước sóng này. Tại 193 nm, bước sóng này gần với bước sóng thấp nhất của dải sóng đang quét là từ 199 nm đến 400 nm (Hình 1). Do đó bước sóng 199 nm được chọn là bước sóng phân tích của clavulanat kali.
:
Hình 1. Phổ hấp thu của clavulanat kali với nồng độ 3 mg/L
Hình 2. Phổ hấp thu của amoxicillin với nồng độ 10,072 mg/L
Kết quả trình bày ở Hình 2 cho thấy có 6 cực đại hấp thu tại các bước sóng 340 nm, 272nm, 258 nm, 228 nm, 219 nm và 193 nm. Tuy nhiên, độ hấp thu tại các bước sóng 340 nm, 272 nm, 258 nm là quá thấp, dẫn đến hệ số hấp thu mol sẽ rất nhỏ (A = .l.C), nên các bước sóng này không được chọn.
Tại bước sóng 193 nm, có độ hấp thu cao, tuy nhiên lại gần với bước đã chọn cho clavulanat kali là 199 nm, nên
không chọn bước sóng này. Vậy bước sóng 228 nm là thích hợp nhất. Vậy, bước sóng phân tích của amoxicillin là 228 nm và của clavulanat kali là 199 nm.
3.2. Tính cộng phổ của dung dịch hỗn hợp
Tiến hành quét phổ của chất chuẩn amoxicillin, clavulanat kali và mẫu chuẩn. chúng tôi thu được kết quả ở Hình 3.
Hình 3. Phổ hấp thu của amoxicillin, clavulanat kali và mẫu chuẩn
Bảng 2. Kết quả khảo sát tính cộng phổ của amoxicillin và clavulanat kali Bước sóng
Độ hấp thu 199 nm 228 nm
Amox 1,057 0,279
Potassium clavulanate 0,146 0,053
Tổng độ hấp thu hỗn hợp 1,203 0,332
Mẫu chuẩn 1,203 0,332
Từ Hình 4 và Bảng 2 cho thấy, độ hấp thu của dung dịch hỗn hợp amoxicillin và clavulanat kali có tính cộng phổ rõ ràng ở hai bước sóng 199 nm và 228 nm.
Từ định luật Lambert - Beer, A =
.l.C, ta tìm được hệ số hấp thu của từng chất tại từng bước sóng như sau:
Hệ số hấp thu mol của amoxicillin có nồng độ 10,072 mg/l tại bước sóng 199 nm là:
𝑎𝑚𝑜𝑥 199 = 1,057.365,410,072.10−3 = 38346,6839 (l/mol.cm-1)
Hệ số hấp thu mol của amoxicillin có nồng độ 10,072 mg/l tại bước sóng 228 nm là:
𝑎𝑚𝑜𝑥 228 = 0,279.365,410,072.10−3 = 10121,7832 (l/mol.cm-1)
Hệ số hấp thu mol của clavulanat kali có nồng độ 3 mg/l tại bước sóng 199 nm là:
𝑃𝐶 199 = 0,146.237,3
3.10−3 = 11548,6 (l/mol.cm-1)
Hệ số hấp thu mol của clavulanat kali có nồng độ 3 mg/l tại bước sóng 228 nm là:
𝑃𝐶 228 = 0,053.237,3
3.10−3 = 4192,3 (l/mol.cm-1) Ta được hệ phương trình tuân theo tính cộng phổ của định luật Lambert - Beer như sau:
A199 = 38346,6839x + 11548,6y A228 = 10121,7832x + 4192,3y Bằng việc đo độ hấp thu của mẫu thử tại các bước sóng 199 nm và 228 nm, ta sẽ có được hệ 2 phương trình 2 ẩn số, sẽ tìm được x và y.
3.3. Độ đặc hiệu
Hình 4. Phổ hấp thu của mẫu giả định, mẫu thử, mẫu chuẩn và mẫu placebo
3.4. Khảo sát tính tuyến tính
Tiến hành xây dựng phương trình hồi quy tuyến tính cho AT (4,029 - 15,107
mg/L và PC (1,2 - 4,5 mg/L) thu được kết quả trình bày ở Bảng 3.
Bảng 3. Kết quả khảo sát tương quan hồi quy tuyến tính đối với amoxicillin và clavulanat kali ở 2 bước sóng 199 nm và 228 nm
Bước sóng (nm)
Amox (4,029 - 15,107 mg/l) Potassium Clavulanate (1,2 - 4,5 mg/l) Phương trình hồi quy Hệ số tương
quan R Phương trình hồi quy Hệ số tương quan R 199 y = 0,104121x +
0,0117763 0,9999 y = 0,0486186x +
2,93535.10-4 0,9999 228 y = 0,0278482x +
7,1664.10-4 0,9999 y = 0,0184288x –
0,00217162 0,9999
3.5. Giới hạn định lượng
Chất chuẩn amoxicillin và clavulanat kali được pha loãng với các mức nồng
độ 10%, 20%, 30% để khảo sát giới hạn định lượng. Kết quả được trình bày ở Bảng 4.
Bảng 4. Kết quả khảo sát giới hạn định lượng
199 nm 228 nm
Amox Potassium
Clavulanate Amox Potassium Clavulanate 10% đo được (a) 0,105 0,015 0,027 0,005
10% tính theo phương trình tuyến tính (b)
0,116 0,014 0,028 0,003
Lệch(1- a/b)% 9,64% 2,74% 5,93% 47,06%
20% đo được (c) 0,217 0,029 0,057 0,009 20% tính theo
phương trình tuyến tính (d)
0,220 0,029 0,056 0,008
Lệch(1- c/d)% 1,36% 0,34% 0,53% 1,12%
Từ kết quả này cho thấy, ở mức nồng độ 10%, độ hấp thu đo được của mỗi chất tại từng bước sóng không thỏa phương tình tuyến tính đã dựng (chênh lệch lớn hơn 2%) với mức nồng độ 20%
của mỗi chất, cho độ hấp thu đo được
còn tuân theo phương trình tuyến tính của mỗi chất (chênh lệch không quá 2%). Vậy, tại 20% nồng độ khảo sát:
2,014 mg/L đối với amoxicillin và 0,60 mg/l đối với clavulanat kali là giới hạn định lượng của phương pháp.
3.6. Giới hạn phát hiện
Đối với amoxicillin LOD = LOQ/3,3
= 2,014/3,3 = 0,61 mg/l, Đối với clavulanat kali: LOD = LOQ/3,3 = 0,6/3,3 = 0,18 mg/L.
3.7. Định lượng mẫu thử
Mẫu thử được chuẩn bị như mục 2.3.
Bảng 5. Kết quả đo độ hấp thu của mẫu thử Bước sóng
Độ hấp thu 199 nm 228 nm
Mẫu thử 1,154 0,319
Tiến hành đo độ hấp thu của mẫu thử tại 2 bước sóng 199 nm và 228 nm.
Từ hệ phương trình (*) của mục 4.1.2, ta có hệ phương trình sau:
1,154 = 38346,6839x + 11548,6y 0,319 = 10121,7832x + 4192,3y x = 2,6304.10-5 mol/l
y = 1,2584.10-5 mol/l Vậy hàm lượng của:
- Amoxicillin là 0,4772 g ứng với 95,44% so với hàm lượng nhãn
- Acid clavulanic là 0,1244 g ứng với 99,52% so với hàm lượng nhãn.
Vậy kết quả định lượng mẫu thử (viên nén Augmentin) đạt tiêu chuẩn Dược điển Việt Nam V (Bộ Y tế, 2018).
4. THẢO LUẬN
Kết quả thực nghiệm cho thấy phương pháp đo quang hỗn hợp tại nhiều bước sóng có thể định lượng đồng thời amoxicillin và acid clavulanic trong cùng một hỗn hợp mà không cần chiết tách các thành phần riêng rẽ. Cần thiết
pha loãng mẫu thử l để tìm được nồng độ từng hoạt chất có trong hỗn hợp.
Ngoài ra, việc sử dụng nước cất làm dung môi là một ưu điểm nổi bật của phương pháp này.
Trong phương pháp thí nghiệm, yếu tố quan trọng để quyết định có định lượng đồng thời 2 chất được hay không là dung môi hòa tan mẫu và lựa chọn các bước sóng thích hợp. Vì amoxicillin và acid clavulanic rất dễ bị ảnh hưởng bởi nhiệt độ và ánh sáng nên việc lựa chọn dung môi thích hợp để không phá hỏng hoạt chất hòa tan rất quan trọng.Thực tế, amoxicillin khó tan trong nước nhưng vẫn tan được (1g/370 ml), clavulanat kali tan tốt trong nước nên đây là một điều kiện thuận lợi cho việc hòa tan mẫu. Tuy nhiên, cần phải có môi trường tiến hành định lượng ổn định, mọi thao tác khi tiến hành định lượng cần cẩn thận để giảm đến mức thấp nhất ảnh hưởng của các yếu tố nhiệt độ và ánh sáng.
Qua khảo sát, bước sóng được lựa chọn để định lượng theo phương pháp
đo quang hỗn hợp là 199 nm đối với clavulanat kali và 228 nm đối với amoxicillin.
- Đối với clavulanat kali, có 2 cực đại hấp thu có thể chọn được là 199 nm và 193 nm. Tuy nhiên, ta chọn 199 nm vì 193 nm gần với bước sóng nhỏ nhất khi quét phổ (từ 190 nm đến 400 nm).
- Đối với amoxicillin, có thể chọn các bước sóng 272 nm, 258 nm, 219 nm để định lượng. Tuy nhiên, độ hấp thu của amoxicillin tại 272 nm và 259 nm nhỏ, dẫn đến hệ số hấp thu mol nhỏ, phép đo quang không nhạy. Giữa 2 bước sóng 219 nm và 228 nm ta chọn 228 nm vì bước sóng này sẽ cách xa bước sóng đã chọn cho clavulanat kali hơn. Việc chọn 2 bước sóng 199 nm và 228 nm cho phương pháp này cũng là điểm khác so với tài liệu tham khảo (Trần Trúc Bình và Trần Thị My, 2015), có thể do sự khác nhau về cách xử lý phổ và máy đo quang được sử dụng.
Với phương pháp định lượng đồng thời này, tính ổn định của mẫu chuẩn đã được xác định khi tiến hành lặp lại khảo sát tính cộng phổ của mẫu chuẩn. Kết quả thẩm định phương pháp định lượng cho thấy, phương pháp này có độ đúng cao (tỷ lệ phần trăm tìm lại trong khoảng 98 - 102%), độ lặp lại cao.
Từ kết quả nghiên cứu cho thấy cần định lượng một chế phẩm có dạng bào chế tương tự (chứa hàm lượng amoxicillin và acid clavulanic với tỷ lệ 500/125), cần tính toán lượng cân thích hợp và đo độ hấp thu tại 2 bước sóng 199 nm và 228 nm, có thể xác định
được hàm lượng của amoxicillin và acid clavulanic trong chế phẩm đó.
Với sự phát triển của công nghiệp sản xuất và bào chế thuốc hiện nay cho phép kết hợp nhiều thành phần hoạt chất vào cùng một chế phẩm để đạt được nhiều mục đích điều trị. Việc định lượng chính xác các thành phần trong cùng một chế phẩm là rất quan trọng bởi hàm lượng cũng như tỷ lệ hàm lượng của các thành phần đó có vai trò quyết định đối với hiệu quả sử dụng. Hiện nay, đa số các chế phẩm đều được định lượng bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC), vì có độ chọn lọc cao, cho kết quả ổn định. Tuy nhiên, với phương pháp này đòi hỏi thiết bị đắt tiền, chi phí dung môi khá tốn kém mà không phải cơ sở nào cũng đủ điều kiện để tiến hành.
Vì vậy, nếu hoạt chất có trong chế phẩm cần định lượng phù hợp với phương pháp sử dụng máy quang phổ UV - Vis thì có thể thử nghiệm để tiến hành định lượng một cách đơn giản, tiết kiệm được chi phí và vẫn cho kết quả hợp lý.
5. KẾT LUẬN
Quy trình định lượng đồng thời đã được xây dựng với công thức để tính được hàm lượng của từng hoạt chất.
Dung môi để tiến hành định lượng đồng thời amoxicillin và acid clavulanic trong viên nén là nước; khoảng nồng độ phân tích của amoxicillin là 4,029 - 15,107 mg/l, clavulanat kali là 1,2 - 4,5 mg/l;
với các bước sóng phân tích là 199 nm và 228 nm. Thẩm định quy trình đã xây dựng qua định lượng chế phẩm chứa 2 thành phần amoxicillin và acid clavulanic, cho kết quả đạt tiêu chuẩn
Dược điển Việt Nam V. Quy trình phân tích theo ICH với các chỉ tiêu độ đặc hiệu; độ đúng có tỷ lệ thu hồi nằm trong khoảng 97 - 103%; độ lặp lại với RSD <
2%; giới hạn định lượng: 2,014 mg/l đối với amoxicillin và 0,60 mg/l đối với clavulanat kali; giới hạn phát hiện: 0,61 mg/l đối với amoxicillin và 0,18 mg/l đối với clavulanat kali.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Bộ Y tế, 2013. Sổ tay hướng dẫn đăng ký thuốc, phụ lục 8. Nxb Y học 92 trang.
2. Đặng Văn Hòa và Vĩnh Định, 2011. Kiểm nghiệm thuốc. Nxb Giáo dục Việt Nam. 367 trang.
3. ICH Harmonised tripartite
guideline, 2005. Validation of analytical procedures: text and methodology.17 pages.
4. Lê Quan Nghiệm và Huỳnh Văn Hóa, 2007. Bào chế và sinh dược học, tập 2. Nxb Giáo dục Việt Nam. 445 trang.
5. Lê Minh Trí, 2009. Hóa Dược 1.Nxb Giáo dục Việt Nam. 517 trang.
6. O.Haidar, 2015. Simple indirect spectrophotometric determination of amoxicillin in pharmaceutical
preparations. Journal of Natural Sciences Research, Vol. 5 - No. 16. 8 pages.
7. Trần Đức Hậu, 2007. Hóa Dược, tập 2. Nxb Y học. 276 trang.
8. Trần Trúc Bình và Trần Thị My, 2015. Xác định đồng thời amoxicillin và kali clavulanat trong dược phẩm bằng phương pháp trắc quang - chemometrics.
Tạp chí Hóa, Lý và Sinh học. 1: 120 - 129.
SIMULTANEOUS DETERMINATION OF POTASSIUM CLAVULANATE AND AMOXICILLIN BY USING UV-VIS
SPECTROPHOTOMETRY
Nguyen Chi Toan* and Tao Viet Ha Tay Do University (*Email: [email protected]) ABSTRACT
Currently, the combination of amoxicillin and clavulanic acid is widely used to treat infections caused by bacteria that produced β - lactamases resistant to amoxicillin, so it is necessary to have a method to simultaneously quantify these two active ingredients. In the same composition, HPLC method is commonly used for giving highly accurate results, but it requires pure chemical solvents and expensive equipment. This study introduces a simple, easy-to-implement, cost-effective method using a UV-Vis spectrophotometer to quantify amoxicillin and clavulanic acid all at once. The analytical wavelengths of the method are 199 nm and 228 nm. The method is linear in the concentration range of 1,2 – 4,5 mg/l for clavulanate potassium and 4,03 – 15,2 mg/l for amoxicillin. This method has been validated with the following criteria: Specificity, with an accuracy of the recovery rate in the range of 97 - 103%, a repeatability with RSD < 2%, with the limit of quantification and limit of detection for amoxicillin are at 2,0144 mg/l and 0,61 mg/l; and for clavulanate potassium they are 0,6 mg/l and 0,18 mg/l,. By using this method, amoxicillin and clavulanic acid were simultaneously quantified in Augmentin tablets that meet the standards of Vietnamese Pharmacopoeia.
Keywords: amoxicillin, clavulanic acid, simultaneous determination method, UV-Vis spectrophotometer
