HIỆU QUẢ CỦA BỔ SUNG AMPHIREGULIN TRONG MÔI TRƢỜNG TRƢỞNG THÀNH NOÃN NON
Phạm Dương Toàn1, Hà Thị Diễm Uyên2, Nguyễn Hoàng Nhất Minh1, Lê Hoàng Anh2, Vương Thị Ngọc Lan3
TÓM TẮT
Đặt vấn đề: Amphiregulin (AREG) là chất trung gian quan trọng ảnh hưởng trực tiếp đến quá trình trưởng thành noãn. Bổ sung AREG vào môi trường có thể có tác động tích cực trên sự trưởng thành noãn và chất lượng phôi của kỹ thuật trưởng thành noãn (IVM).
Mục tiêu: So sánh kết quả phôi học của 2 nhóm noãn được cấy trong môi trường IVM có hay không bổ sung AREG.
Đối tượng và phương pháp nghiên cứu: Nghiên cứu đoàn hệ tiến cứu, trên bệnh nhân có hội chứng buồng trứng đa nang PCOS, <37 tuổi, có tối thiểu 25 nang (2-9mm) trên siêu âm, thực hiện CAPA-IVM. Sau chọc hút, phức hợp noãn-tế bào hạt (COC) của mỗi bệnh nhân được cấy trong mội trường CAPA, sau đó, chia làm 2 nhóm và cấy trong môi trường IVM có hoặc không bổ sung AREG.
Kết quả: Có 30 bệnh nhân được nhận vào nghiên cứu. Tổng số COC thu nhận được là 671, trong đó, 336 COC được nuôi cấy trong môi trường AREG và 335 COC được nuôi cấy trong môi trường không có AREG. Tỷ lệ trưởng thành của noãn ở 2 nhóm lần lượt là 62,5% và 55,2% (p=0,06). Các kết cục khác về phôi đều tương đương giữa 2 nhóm.
Kết luận: Không có bằng chứng rõ ràng về hiệu quả của việc bổ sung AREG vào môi trường giúp cải thiện kết quả phôi học của CAPA-IVM trên người.
Từ khóa: thụ tinh trong ống nghiệm, trưởng thành noãn non, kết quả phôi học
ABSTRACT
THE EFFECTIVENESS OF THE ADDITION OF AMPHIREGULIN TO THE MATURATION MEDIUM Pham Duong Toan, Ha Thi Diem Uyen, Nguyen Hoang Nhat Minh, Le Hoang Anh, Vuong Thi Ngoc Lan * Ho Chi Minh City Journal of Medicine * Vol. 25 - No. 1 - 2021: 150 - 154 Background: Amphiregulin is a crucial mediated substance that affects directly on the maturation process of the oocyte. The addition of AREG to the medium may have a positive effect on the oocyte maturation and embryo quality of the in-vitro maturation (IVM) technique.
Objective: To compare the embryology outcomes of the immature oocytes cultured in maturation medium that have or have not AREG added.
Methods: This was a prospective cohort study conducted on patients who were diagnosed with PCOS, aged
<37 years, had a minimum of 25 follicles (2 to 9 mm) on ultrasound and treated with CAPA-IVM. At oocyte collection, the cumulus-oocyte complexes (COC) were distributed to two groups that were cultured in medium with (AREG group) or without AREG (Control group) added.
Results: A total of 30 patients were recruited to the study. The total number of COC collected were 671,
1Trung tâm nghiên cứu HOPE, Bệnh viện Mỹ Đức TP. Hồ Chí Minh
2Đơn vị Hỗ trợ sinh sản IVFMD, Trung tâm nghiên cứu HOPE, Bệnh viện Mỹ Đức TP. Hồ Chí Minh
3Bộ môn Phụ Sản, Đại học Y Dược TP. Hồ Chí Minh
Tác giả liên lạc: BS. Phạm Dương Toàn ĐT: 0986808979 Email: [email protected]
in which, 336 were in AREG group and 335 in Control group. The maturation rate was not different between AREG group and control group (62.5% versus 55.2%, p=0.06). Other embryology outcomes were similar between two groups.
Conclusion: There is no strong evidence for adding AREG to IVM medium to improve embryology outcomes of CAPA-IVM in human.
Key words: in-vitro fertilization, in-vitro maturation, embryology outcomes
ĐẶT VẤN ĐỀ
Trưởng thành noãn trong ống nghiệm (IVM) là một kỹ thuật hỗ trợ sinh sản giúp giảm thiểu tác dụng phụ và rủi ro liên quan đến các hormone kích thích buồng trứng cho bệnh nhân hiếm muộn có hội chứng buồng trứng đa nang.
Dù vậy, phương pháp này không được sử dụng rộng rãi vì có hiệu quả thấp hơn so với thụ tinh ống nghiệm (TTON) cổ điển TTON(1,2). Một trong các yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến sự thành công của kỹ thuật IVM là tỷ lệ trưởng thành noãn vì chỉ số này quyết định các kết quả phôi học khác như tỷ lệ thụ tinh, tỷ lệ tạo phôi và tỷ lệ phôi tốt(3).
Sự trưởng thành noãn gồm 2 quá trình; sự tái hồi phục giảm phân hay còn gọi là trưởng thành nhân và trưởng thành tế bào chất (liên quan đến khả năng thụ tinh và phát triển phôi giai đoạn sớm). Các noãn thu được trong IVM xuất phát từ một nhóm nang noãn không đồng nhất với các đặc điểm tế bào và phân tử biểu hiện noãn chưa trưởng thành(4). Do đó, cần phát triển các hệ thống nuôi cấy in vitro giúp tăng cường đồng bộ hóa sự trưởng thành nhân và tế bào chất trước khi tái hồi phục giảm phân để tối ưu hóa hệ thống nuôi cấy IVM(4). Một hệ thống nuôi cấy IVM hai bước mới (được gọi là CAPA-IVM) gồm bước nuôi cấy tiền trưởng thành noãn bằng C- type peptide natriuretic (CNP) đã được giới thiệu trong các nghiên cứu lâm sàng trước đây.
Kết quả các nghiên cứu dẫn đường đã chứng minh có sự tăng tỷ lệ trưởng thành noãn và phôi chất lượng tốt ngày 3(5), CNP được tiết ra từ các tế bào hạt, sau đó liên kết với thụ thể Natriuretic peptide receptor 2 (NPR2) trên tế bào hạt, thúc đẩy sự tạo thành cGMP theo con đường CNP/NPPC/NPR2. cGMP đi vào noãn thông qua liên kết gap-junction và điều hòa gián tiếp nồng
độ cAMP, điều này làm cho quá trình ngừng giảm phân được duy trì(6,7) tạo điều kiện cho sự đồng bộ hóa quá trình trưởng thành nhân tế bào và tế bào chất. Bên cạnh CNP đã được chứng minh hiệu quả giúp cải thiện kết quả phôi học trên người(4), thì các nghiên cứu trên mô hình động vật còn cho thấy vai trò quan trọng của các yếu tố tăng trưởng (EGF) và các phối tử của EGF như: amphiregulin (AREG); epiregulin (EREG) và betacellulin (BTC) trong quá trình trưởng thành noãn(8). Các EGF này có vai trò là chất cảm ứng quá trình giảm phân ở noãn, trong các thí nghiệm trên noãn chuột cho thấy khi không có sự hiện diện của AREG hoặc EREG thì các noãn này phục hồi quá trình giảm phân cùng với sự giãn nở của tế bào hạt. Những con chuột không có một trong những phối tử EGF này thì chỉ biểu hiện nhẹ ở kiểu hình cho thấy các phối tử EGF này có cơ chế bù trừ cho nhau(9).
Các nghiên cứu trên động vật cho thấy việc kết hợp giữa CNP và AREG vào môi trường tiền trưởng thành noãn (CAPA) giúp cải thiện tỷ lệ trưởng thành noãn lên đến 70%. Nghiên cứu cũng ghi nhận chất lượng phôi tốt hơn, tỷ lệ phôi nguyên bội cao hơn và không ghi nhận có sự biến đổi thượng di truyền ở các phôi được tạo ra theo phương pháp này(5,10). Chúng tôi thực hiện nghiên cứu này với mục tiêu khảo sát hiệu quả của việc kết hợp AREG và CNP trong môi trường cấy trưởng thành noãn của kỹ thuật CAPA-IVM trên người.
ĐỐI TƢỢNG - PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Đối tƣợng nghiên cứuCác bệnh nhân được điều trị bằng kỹ thuật trưởng thành noãn non CAPA-IVM tại Đơn vị Hỗ trợ sinh sản IVFMD, bệnh viện Mỹ Đức, TP.
Hồ Chí Minh từ tháng 04/2019 - 07/2019.
Tiêu chuẩn chọn mẫu
Bệnh nhân có hội chứng buồng trứng đa nang PCOS, <37 tuổi, có tối thiểu 25 nang (2-9 mm) trên siêu âm và được thực hiện kỹ thuật trưởng thành noãn non CAPA-IVM để điều trị hiếm muộn.
Tiêu chuẩn loại
Xin trứng, có chẩn đoán di truyền phôi.
Phƣơng pháp nghiên cứu Thiết kế nghiên cứu
Nghiên cứu đoàn hệ tiến cứu.
Cỡ mẫu và cách chọn mẫu
Chọn mẫu toàn bộ trong thời gian nghiên cứu.
Phương pháp tiến hành
Bệnh nhân được giải thích và ký đồng thuận tham gia nghiên cứu. Bệnh nhân sẽ tiêm HP-hMG với liều là 150 IU/ngày bắt đầu từ ngày 2 của chu kỳ kinh trong 2 ngày. Chọc hút noãn được tiến hành 42-46 giờ sau khi tiêm mũi HP-hMG cuối cùng.
Tất cả các phức hợp COC được nuôi cấy tiền trưởng thành trong môi trường CAPA trong 24 giờ. Sau khi nuôi cấy CAPA, các COC được chia thành 2 nhóm, cấy trong môi trường IVM có bổ sung hoặc không bổ sung AREG. Mội trường IVM của nhóm AREF chứa AREG + FSH, trong khi đó, mội trường IVM của nhóm chứng chứa FSH + hCG + GH.
Đánh giá trưởng thành noãn và tách noãn được tiến hành sau cấy IVM 30 và 32 giờ. Noãn trưởng thành được thụ tinh bằng kỹ thuật tiêm tinh trùng vào bào tương noãn (ICSI). Noãn sau đó sẽ được nuôi trong tủ cấy ở điều kiện 37oC, 5% CO2, 5% O2. Kiểm tra thụ tinh được tiến hành 16-18 giờ sau ICSI. Phôi được nuôi cấy đến ngày 3 trong môi trường (Life Global, Canada). Mỗi giọt môi trường nuôi cấy phôi có thể tích 30 µL,
chứa từ 2-3 phôi. Vào ngày 3, phôi được đánh giá hình thái và phân loại theo tiêu chuẩn của Hiệp Hội Khoa Học Y Học Sinh Sản Alpha. Các phôi đủ tiêu chuẩn sẽ được trữ lạnh lại theo phương pháp thuỷ tinh hoá sử dụng môi trường của Cryotec (Nhật Bản).
Kết cục chính của nghiên cứu là tỷ lệ trưởng thành noãn, được định nghĩa là số noãn MII trên tổng số noãn sau quá trình CAPA và IVM.
Phân tích và xử lý số liệu
Dữ liệu được quản lý và phân tích bằng phần mềm R (Phiên bản 3.3.3). Giá trị P<0,05 được xem là có ý nghĩa thống kê.
Y đức
Nghiên cứu đã được thông qua Hội đồng Đạo đức của bệnh viện Mỹ Đức, số quyết định HĐĐĐ: 04/2019/MĐ-HĐĐĐ vào ngày 03/12/2019.
KẾT QUẢ
Đặc điểm của bệnh nhân được trình bày trong Bảng 1.
Bảng 1: Đặc điểm lâm sàng của bệnh nhân
Đặc điểm N = 30
Tuổi, năm 28,6 ± 3,1
Chỉ số khối cơ thể, kg/m2 22,6 ± 3,5 Anti mullerian hormone, ng/ml 10,6 ± 4,2 Thời gian vô sinh, năm 3,3 ± 2,7 Nguyên nhân vô sinh, n (%)
Nguyên phát 23 (76,7)
Thứ phát 7 (23,3)
Số chu kỳ TTON, n, (%)
1 29 (96,7)
2 1 (3,3)
Tổng số COC thu nhận được từ 30 bệnh nhân là 671, trong đó, có 336 COC được nuôi cấy trong môi trường có bổ sung AREG và 335 COC được nuôi cấy trong môi trường không bổ sung AREG. Kết quả phôi học của noãn thu được từ 2 nhóm được trình bày trong Bảng 2.
Bảng 2: Kết quả phôi học giữa hai nhóm môi trường nuôi cấy
Nhóm AREG (N = 336) Nhóm chứng (N = 335) RR (95%CI) Giá trị P Tỷ lệ trưởng thành noãn, n (%) 210 (62,5) 185 (55,2) 1,13 (1,00– ,28) 0,06
Tỷ lệ thụ tinh, n (%) 148 (44) 130 (38,8) 1,14 (0,95–1,36) 0,18
Nhóm AREG (N = 336) Nhóm chứng (N = 335) RR (95%CI) Giá trị P
Tỷ lệ tạo phôi, n (%) 96 (28,6) 81 (24,2) 1,18 (0,91–1,52) 0,22
Tỷ lệ phôi tốt, n (%) 66 (19,6) 49 (14,6) 1,34 (0,96–1,88) 0,10
Bảng 3: Kết quả phôi học giữa hai nhóm môi trường nuôi cấy theo kích thước COC <6 mm và ≥6 mm
COCs <6 mm
Giá trị P
COCs ≥6 mm
Giá trị P Nhóm AREG
(N = 314)
Nhóm chứng (N = 316)
Nhóm AREG (N = 22)
Nhóm chứng (N = 19) Tỷ lệ trưởng thành
noãn (MII), n (%) 193 (61,5) 176 (55,7) 0,15 17 (77,3) 9 (47,4) 0,06
Tỷ lệ thụ tinh, n (%) 135 (43) 123 (38,9) 0,33 13 (59,1) 7 (36,8) 0,21
Tỷ lệ tạo phôi, n (%) 87 (27,7) 78 (24,7) 0,42 9 (40,9) 3 (15,8) 0,10
Tỷ lệ phôi tốt, n (%) 60 (19,1) 46 (14,6) 0,14 6 (27,3) 3 (15,8) 0,47
Trong nhóm AREG có tổng cộng 314 nang có kích thước <6 mm (chiếm 93%) và 22 nang có kích thước ≥6 mm (chiếm 7%). Nhóm chứng có tổng cộng 316 nang có kích thước <6 mm (chiếm 94%) và 19 nang có kích thước ≥6 mm (chiếm 6%). Phân tích dưới nhóm về kết quả phôi học giữa 2 nhóm theo kích thước nang được mô tả trong Bảng 3.
BÀN LUẬN
Đây là nghiên cứu dẫn đường đầu tiên trên người đánh giá vai trò của AREG kết hợp với CNP trong môi trường trưởng thành noãn của kỹ thuật CAPA-IVM. Cơ sở khoa học của CAPA-IVM là ngăn chặn quá trình giảm phân tự nhiên của tế bào noãn sau khi được lấy ra khỏi nang noãn, từ đó, tạo điều kiện cho quá trình hoàn thiện tế bào chất của noãn, đồng bộ hóa quá trình phát triển noãn non trong ống nghiệm.
Kết quả nghiên cứu
Trong nghiên cứu này chúng tôi tiến hành so sánh môi trường trưởng thành noãn có bổ sung AREG hay không bổ sung AREG. Kết quả cho thấy tỷ lệ trưởng thành của noãn trong môi trường có AREG cao hơn môi trường không bổ sung, tuy nhiên, sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê. Bên cạnh đó các chỉ số khác như tỷ lệ thụ tinh, tỷ lệ tạo phôi, tỷ lệ phôi tốt đều có xu hướng cao hơn ở nhóm có bổ sung AREG. Kết quả cũng tương tự khi chúng tôi tiến hành phân tích dưới nhóm kết quả theo kích thước của khối COC <6 mm và COC ≥6 mm, nhóm có bổ sung AREG cho kết quả tốt hơn nhưng không có ý nghĩa thống kê.
Tỷ lệ trưởng thành noãn trong nghiên cứu của chúng tôi cũng tương tự với nghiên cứu của Sanchez F, cũng như các nghiên cứu trước đây trên động vật, với tỷ lệ xấp xỉ 70%(5).
Cách tiếp cận được sử dụng trong nghiên cứu này dựa trên các kiến thức thu được trên mô hình động vật hàng thập kỷ qua, các bằng chứng đều khẳng định lợi ích của quá trình tiền trưởng thành IVM đặc biệt trên những động vật không sử dụng hoặc sử dụng tối thiểu FSH để kích thích buồng trứng(6,10). Hệ thống CAPA-IVM đầu tiên được phát triển cho IVM không kích thích buồng trứng ở chuột với các thành phần quan trọng trong giai đoạn tiền IVM như CNP, estradiol, insulin và FSH liều thấp(11). CNP là chất ức chế mạnh quá trình giảm phân, với vai trò là phối tử giúp liên kết tế bào granulosa/tế bào hạt và tế bào trứng và là natriuretic peptide receptor 2 (NPR2)(7). Sự kích hoạt CNP của NPR2 tạo ra GMP vòng (cGMP). cGMP là chất đối kháng tự nhiên đối với phosphodiesterase loại 3A (PDE3A) của tế bào noãn, do đó ngăn cản quá trình giảm phân của tế bào noãn trong in- vivo hoặc in-vitro(11). Bên cạnh các nhân tố trên thì việc bổ sung AREG trong nghiên cứu của chúng tôi đóng vai trò như một phối tử của EGF. Bằng chứng đầu tiên cho thấy các phối tử của EGF liên quan đến chức năng của tế bào hạt được báo cáo bởi Dekel N và Sherizly I(12) và Downs SM(13). Gần đây, các nghiên cứu đều cho thấy nhóm các phối tử của EGF đóng vai trò quan trọng, kiểm soát quá trình trưởng thành noãn thông qua con đường tín hiệu của LH(8).
Mặc dù kết quả phôi học của nhóm AREG
không khác biệt có ý nghĩa thống kê so với nhóm chứng không bổ sung AREG trong môi trường trưởng thành noãn nhưng các kết quả có xu hướng cao hơn ở nhóm AREG. Đây có thể là bằng chứng sơ khởi về hiệu quả của các phối tử EGF trong kỹ thuật CAPA-IVM tạo cơ sở cho các nghiên cứu tiếp theo.
Điểm mạnh và hạn chế của nghiên cứu
Nghiên cứu thực hiện đầu tiên khảo sát hiệu quả của bổ sung AREG vào CAPA-IVM trên người. Nghiên cứu thực hiện chia số noãn của mỗi bệnh nhân vào 2 nhóm, do đó, loại trừ tác động gây nhiễu của đặc điểm nền và lâm sàng của bệnh nhân trên kết quả phôi học. Hạn chế của đề tài là kết cục thai kỳ sau chuyển phôi được nuôi cấy trong môi trường IVM có AREG hay không AREG không được ghi nhận vì đây mới thật sự là kết cục mong muốn của bệnh nhân khi điều trị hiếm muộn với kỹ thuật CAPA-IVM.
KẾT LUẬN
Không có bằng chứng rõ ràng về hiệu quả của việc bổ sung AREG giúp cải thiện kết quả phôi học của kỹ thuật CAPA-IVM trên người.
Lời cảm ơn: Nghiên cứu này được tài trợ bởi Quỹ Phát triển khoa học và công nghệ Quốc gia (NAFOSTED) trong đề tài mã số FWO.106- YS.2017.02
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Child TJ, Abdul-Jalil AK, Gulekli B, Tan SL (2001). In vitro maturation and fertilization of oocytes from unstimulated normal ovaries, polycystic ovaries, and women with polycystic ovary syndrome. Fertility and Sterility, 76(5):936–942.
2. Child TJ, Phillips SJ, Abdul-Jalil AK, Gulekli B, Tan SL (2002).
A comparison of in vitro maturation and in vitro fertilization for women with polycystic ovaries. Obstetrics & Gynecology, 100(4):665–670.
3. Luciano AM, Sirard MA (2018). Successful in vitro maturation of oocytes: a matter of follicular differentiation. Biology of Reproduction, 98(2):162–169.
4. Sánchez F, Romero S, De Vos M, Verheyen G, Smitz J (2015).
Human cumulus-enclosed germinal vesicle oocytes from early antral follicles reveal heterogeneous cellular and molecular features associated with in vitro maturation capacity. Human Reproduction, 30(6):1396–1409.
5. Sánchez F, Lolicato F, Romero S, De Vos M, Van Ranst H, Verheyen G, Anckaert E, Smitz JEJ (2017). An improved IVM method for cumulus-oocyte complexes from small follicles in polycystic ovary syndrome patients enhances oocyte competence and embryo yield. Human Reproduction, 32(10):2056–2068.
6. Gilchrist RB (2011). Recent insights into oocyte - follicle cell interactions provide opportunities for the development of new approaches to in vitro maturation. Reproduction, Fertility and Development, 23(1):23-31.
7. Zhang M, Su YQ, Sugiura K, Xia G, Eppig JJ (2010). Granulosa Cell Ligand NPPC and Its Receptor NPR2 Maintain Meiotic Arrest in Mouse Oocytes. Science, 330(6002):366–369.
8. Freimann S, Ben-Ami I, Dantes A, Ron-El R, Amsterdam A (2004). EGF-like factor epiregulin and amphiregulin expression is regulated by gonadotropins/cAMP in human ovarian follicular cells. Biochemical and Biophysical Research Communications, 324(2):829–834.
9. Hsieh M, Lee D, Panigone S, Horner K, Chen R, Theologis A, Lee DC, Threadgill DW, Conti M (2007). Luteinizing Hormone- Dependent Activation of the Epidermal Growth Factor Network Is Essential for Ovulation. Molecular and Cellular Biology, 27(5):1914–1924.
10. Gilchrist RB, Luciano AM, Richani D, Zeng HT, Wang X, Vos MD, Sugimura S, Smitz J, Richard FJ, Thompson JG (2016).
Oocyte maturation and quality: role of cyclic nucleotides.
Reproduction, 152(5):R143–R157.
11. Vaccari S, Weeks JL, Hsieh M, Menniti FS, Conti M (2009).
Cyclic GMP Signaling Is Involved in the Luteinizing Hormone- Dependent Meiotic Maturation of Mouse Oocytes. Biology of Reproduction, 81(3):595–604.
12. Dekel N, Sherizly I (1985). Epidermal Growth Factor Induces Maturation of Rat Follicle-Enclosed Oocytes. Endocrinology, 116(1):406–409.
13. Downs SM (1989). Specificity of Epidermal Growth Factor Action on Maturation of the Murine Oocyte and Cumulus Oophorus in Vitro1. Biology of Reproduction, 41(2):371–379.
Ngày nhận bài báo: 10/11/2020
Ngày nhận phản biện nhận xét bài báo: 06/02/2021 Ngày bài báo được đăng: 10/03/2021
