KHẢO SÁT PHỔ ĐỘT BIẾN Ở BỆNH NHÂN UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG GIAI ĐOẠN SỚM BẰNG KỸ THUẬT GIẢI TRÌNH TỰ THẾ HỆ MỚI

Chuyên Đề Chẩn Đoán Hình Ảnh - Sinh Học Phân Tử

118

KHẢO SÁT PHỔ ĐỘT BIẾN Ở BỆNH NHÂN UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG GIAI ĐOẠN SỚM BẰNG KỸ THUẬT GIẢI TRÌNH TỰ THẾ HỆ MỚI

Lê Gia Hoàng Linh¹, Lương Bắc An¹, Hồ Quốc Chương¹, Ngô Quốc Đạt², Nguyễn Hữu Thịnh², Nguyễn Thị Quỳnh Thơ², Nguyễn Hoài Nghĩa¹, Giang Hoa³, Trần Diệp Tuấn², Đỗ Thị Thanh Thủy³

TÓM TẮT

Mục tiêu: Ung thư đại trực tràng (UTĐTT) là một trong số ít bệnh lý ác tính có tiên lượng khá tốt nếu được phát hiện và điều trị sớm. Thời gian sống của bệnh nhân phụ thuộc chủ yếu vào giai đoạn bệnh ở thời điểm được chẩn đoán. Ở giai đoạn I, II hầu hết bệnh nhân có thể sống thêm 5 năm. Tỷ lệ này chỉ còn 60% ở giai đoạn III và 5-15% ở giai đoạn IV. Chính vì vậy việc chẩn đoán sớm rất quan trọng giúp cải thiện tỉ lệ khỏi bệnh, thời gian sống còn cũng như chất lượng sống của bệnh nhân. Hiện nay, ứng dụng công nghệ giải trình tự gen thế hệ mới, nhiều bảng gen khác nhau được sử dụng trong khảo sát đột biến gen của UTĐTT. Trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng bảng 20 gen, dựa trên mục tiêu khảo sát các gen có khả năng biểu hiện kiểu hình cao (high penetrance) gây mẫn cảm với UTĐTT và các gen liên quan đến tiên lượng hoặc tiên đoán đáp ứng với điều trị nhắm trúng đích phân tử.

Đối tượng và phương pháp: 20 đối tượng được chẩn đoán UTĐTT ở giai đoạn I, II, III được thu mẫu FFPE và giải trình tự bảng 20 gen bằng phương pháp giải trình tự thế hệ mới.

Kết quả: Chúng tôi phát hiện 12/20 bệnh nhân mang đột biến trên các gen thuộc panel gen đã thiết kế.

Trong đó đột biến phát hiện ở gen TP53, APC chiếm tần suất >25%; các gen KRAS, PIK3CA chiếm 11,5%;

BRAF, FBXW7, KMT2D chiếm 3,8%.

Kết luận: Chuẩn bị thành công thư viện giải trình tự và lai-bắt giữ được trình tự 20 gen mục tiêu đã thiết kế, bước đầu khảo sát được các đột biến gen trên bệnh nhân ung thư trực tràng giai đoạn sớm.

Từ khóa: ung thư đại trực tràng, giải trình tự thế hệ mới, đột biến sinh ung, phổ đột biến

ABSTRACT

INVESTIGATION OF MUTATION IN EARLY STAGE COLORECTAL CANCER WITH NEXT- GENERATION SEQUENCING

Le Gia Hoàng Linh, Luong Bac An, Ho Quoc Chuong, Ngo Quoc Dat, Nguyen Huu Thinh, Nguyen Thi Quynh Tho, Nguyen Hoai Nghia, Giang Hoa, Tran Diep Tuan, Do Thi Thanh Thuy

* Ho Chi Minh City Journal of Medicine * Vol. 25 - No 1 - 2021: 118-125 Objectives: Colorectal cancer is one of the few malignancies that has a fairly good prognosis if detected and treated early. The patient's life time depends mainly on the stage of the disease at the time of diagnosis. In stage I and II, patients can live for 5 years. This rate is only 60% in stage III and 5-15% in stage IV. Therefore, early diagnosis is very important to help improve the cure rate, survival time as well as the patient's quality of life.

Currently, applying next-generation sequencing technology, many different gene panel are used in the survey of genetic mutations of colorectal cancer. In this study, we use a panel of 20 genes, based on the goal of examining genes with high penetrance expression susceptibility to colorectal cancer and genes related to prognosis or predictive response with molecular targeting therapy.

1Trung tâm Y Sinh Học Phân Tử, ĐH Y Dược TP. Hồ Chí Minh

2Khoa Y, ĐH Y Dược TP. Hồ Chí Minh ³Viện Di truyền Y học TP. Hồ Chí Minh Tác giả liên lạc: BS. Đỗ Thị Thanh Thủy ĐT: 0908 487 425 Email: thuydo@gmail.com

Methods: 20 patients diagnosed with colorectal cancer in stage I, II and III were collected FFPE samples and panel of 20 genes using next-generation sequencing method.

Results: From 20 FFPE samples, we detected mutations in 12 samples (60%). The frequency of mutation in APC was 26.9%; in TP53 was 38.5%; in KRAS and PIK3CA was 11.5%; in BRAF, FBXW7, KMT2D was 3.8%

Conclusion: We successful preparation of sequencing library and hybrid-capture sequence of 20 designed target genes, initially investigating genetic mutations in early stage colorectal cancer patients

Keywords: colorectal cancer, next-generation sequencing, carcinoma, mutation

ĐẶT VẤN ĐỀ

Ung thư đại trực tràng (UTĐTT) là loại ung thư được chẩn đoán phổ biến thứ ba ở nam giới và thứ hai ở nữ giới, với ước tính 1,4 triệu trường hợp bệnh mới phát hiện và 0,7 triệu bệnh nhân tử vong trong năm 2018⁽¹⁾. Tỷ lệ này ở nam giới cao hơn nữ giới trong hầu hết các nghiên cứu trên toàn cầu. Khoảng 5% đến 10% những người bị UTĐTT có mang đột biến gen di truyền gây ra các hội chứng ung thư gia đình. Các hội chứng di truyền phổ biến nhất có liên quan đến UTĐTT là hội chứng đa polyp tuyến gia đình (FAP) và hội chứng Lynch; nhưng các hội chứng hiếm gặp khác cũng có thể làm tăng nguy cơ UTĐTT.

Phần lớn UTĐTT là thể bệnh ngẫu nhiên đơn lẻ (sporadic), không có bằng chứng rõ ràng về rối loạn có tính di truyền. Khoảng 25% bệnh nhân còn lại có bệnh sử UTĐTT trong gia đình, cho thấy có sự đóng góp của nguyên nhân di truyền, của sự phơi nhiễm với yếu tố nguy cơ chung của các thành viên trong gia đình, hoặc kết hợp cả hai. Các đột biến gen di truyền đã được xác định là nguyên nhân gây ra nguy cơ ung thư di truyền ở một số gia đình UTĐTT; các đột biến gây bệnh này chiếm khoảng 5% đến 6% tổng số trường hợp UTĐTT. Các trường hợp còn lại rất có thể các gen chưa được phát hiện khác, kết hợp với các yếu tố nguy cơ không di truyền, đóng góp vào sự phát sinh UTĐTT gia đình.

Các gen được xem là gen liên quan UTĐTT khi chúng là các yếu tố cần và đủ để gây bệnh, trên những gen này có mang những đột biến gây bệnh quan trọng⁽²⁾. Chức năng của các gen liên quan UTĐTT chính đã được mô tả chi tiết trong thập niên vừa qua. Ba nhóm gen ung thư được đề xuất là nhóm gen ức chế khối u, nhóm gen

sinh ung và nhóm gen sửa chữa DNA. Nhóm gen ức chế khối u tạo thành nhóm gen quan trọng nhất chịu trách nhiệm cho các hội chứng ung thư di truyền và là đại diện cho nhóm gen gây ra bệnh đa polyp tuyến gia đình (FAP - familial adenomatous polyposis), hội chứng đa polyp vị thành niên (JPS - juvenile polyposis syndrome) và nhiều hội chứng khác. Các đột biến dòng mầm gây bệnh trên gen sinh ung không phải là nguyên nhân di truyền quan trọng trong UTĐTT, mặc dù một số đột biến sinh dưỡng của chúng có mặt trong hầu hết các dạng của ung thư đường tiêu hoá. Các gen ổn định, đặc biệt là các gen sửa chữa lỗi bắt cặp sai (MMR – mismatch repair genes) khi bị đột biến sẽ gây ra hội chứng Lynch (còn được gọi là UTĐTT không đa polyp gia đình: HNPCC - hereditary nonpolyposis colorectal cancer), chiếm một phần đáng kể của UTĐTT di truyền⁽³⁾. MUTYH là một ví dụ quan trọng khác của gen ổn định dẫn đến nguy cơ UTĐTT dựa vào sự sai sót trong khả năng sửa chữa lỗi sai⁽⁴⁾.

Giải trình tự gen thế hệ mới (NGS: Next generation sequencing) là công nghệ giải trình tự gen tiên tiến, cho phép giải trình tự đồng thời hàng triệu phân mảnh DNA trong một phản ứng, vì vậy giúp giảm giá thành giải trình tự xuống đáng kể, có thể đạt đến $0,1 cho mỗi 1 triệu nucleotide so với mức giá $2.400 của phương pháp giải trình tự Sanger truyền thống.

Việc giải trình tự đồng thời hàng triệu phân mảnh DNA cho phép hàng trăm gen có thể được giải trình tự chỉ trong một phản ứng. Đây chính là tiền đề cho sự phát triển của y học cá thể hóa (personalized medicine) trong điều trị và chẩn đoán ung thư. Hiện nay phương pháp giải trình tự trúng đích (targeted sequencing) thay vì giải

Chuyên Đề Chẩn Đoán Hình Ảnh - Sinh Học Phân Tử

120

trình tự cả bộ gen (whole genome sequencing:

WGS) được sử dụng phổ biến trong giải trình tự các gen mục tiêu⁽⁵⁾. Trong phương pháp giải trình tự trúng đích, các phân mảnh DNA từ gen mục tiêu sẽ được làm giàu thông qua bước nhân bản bằng PCR hoặc bằng các mẫu dò đặc hiệu gắn biotin trước khi giải trình tự. Ưu điểm của phương pháp này là giảm lượng gen giải trình tự do chỉ giải trình tự những vùng gen mục tiêu được làm giàu. Giải trình tự toàn thể bộ gen (WGS) và giải trình tự toàn bộ exon (WES) hiện đang được sử dụng để tìm các đột biến sinh dưỡng của khối u giúp tiên lượng và/hoặc tìm kiếm các phương pháp điều trị trúng đích, cũng như xác định các đột biến dòng mầm gây nguy cơ ung thư. Hiện nay, ứng dụng công nghệ giải trình tự gen thế hệ mới, nhiều bảng gen khác nhau được sử dụng trong khảo sát đột biến gen của UTĐTT. Do đột biến ung thư đa dạng, nên việc lựa chọn tổ hợp gen khảo sát (bao gồm số lượng gen và gen nào) để nhận dạng được đột biến trên mẫu mô u là một trong những yếu tố quan trọng quyết định độ nhạy của phương pháp phát hiện ung thư giai đoạn sớm⁽6⁾. Để lựa chọn các gen khảo sát, chúng tôi dựa trên các gen có tần suất đột biến cao nhất trong UTĐTT và tổng 20 gen được lựa chọn sẽ chiếm ít nhất 80% tổng tần suất đột biến xuất hiện trong UTĐTT. Do hiện nay các cơ sở dữ liệu di truyền về phổ đột biến ung thư của người Việt chưa đầy đủ, các gen được lựa chọn để khảo sát trong nghiên cứu này sẽ dựa trên các công bố trước đây và cơ sở dữ liệu COSMIC (Catalogue of Somatic Mutation in Cancer). Trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng bảng 20 gen chia làm 5 phân nhóm chính: nhóm các gen kháng ung thư (APC, TP53, FAT4, LRP1B, TGFBR, FAT1);

nhóm gen gây ung thư (BRAF); nhóm quy định cấu trúc NST (KMT2C, KMT2D, ARID1A, TRRAP); nhóm nhân tố phiên mã (ZFHX3, TCF7L2); nhóm gen liên quan đến con đường tín hiệu nội bào (KRAS, PIK3CA, ACVR2A, FBXW7, RNF43, SMAD4, PREX2). Theo bảng gen này, dựa trên mục tiêu khảo sát các gen có

khả năng biểu hiện kiểu hình cao (high penetrance) gây mẫn cảm với UTĐTT và các gen liên quan đến tiên lượng hoặc tiên đoán đáp ứng với điều trị nhắm trúng đích phân tử.

ĐỐI TƯỢNG- PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Đối tượng nghiên cứu

Mẫu được sử dụng trong nghiên cứu là mẫu mô u của 20 bệnh nhân UTĐTT giai đoạn I, II và III tại bệnh viện Đại học Y Dược TP. Hồ Chí Minh trong thời gian từ tháng 09/2019 đến tháng 10/2020.

Tiêu chuẩn chọn mẫu

Được chẩn đoán xác định UTĐTT giai đoạn I, II, III (theo tiêu chuẩn của AJCC VII)

Có đầy đủ thông tin hành chính, tiền căn, giai đoạn bệnh, kết quả giải phẫu bệnh.

Đồng ý tham gia nghiên cứu.

Tiêu chuẩn loại trừ

UTĐTT giai đoạn IV hoặc đã di căn.

Không đồng ý tham gia nghiên cứu.

Phương pháp nghiên cứu Thiết kế nghiên cứu

Nghiên cứu mô tả cắt ngang.

Phương pháp thực hiện

Tách chiết DNA từ mô u (FFPE) và kiểm tra nồng độ dsDNA

DNA từ mô u (FFPE) được tách chiết bằng bộ kit QiaAmp DNA FFPE kit (Qiagen). Quy trình tách chiết được tiến hành theo hướng dẫn của bộ kit. Các mẫu DNA được tiến hành kiểm tra nồng độ và lưu trữ tại -30^oC.

Hệ thống QFX Fluorometer (Denovix, USA) dựa trên nguyên lí định lượng các phân tử DNA được gắn chèn chất nhuộm huỳnh quang. Nồng độ DNA được phản ánh thông qua chỉ số mật độ huỳnh quang đo được. Bộ kít Denovix dsDNA HS (High Sensitivity) assay có độ chọn lọc cao đối với mạch đôi DNA (dsDNA) và định lượng chính xác mẫu DNA có nồng độ ban đầu từ 5pg/µl đến 25 ng/µl.

Kết quả nồng độ DNA thu được sau tách

chiết được ghi nhận lại. Quy trình thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

Tạo thư viện giải trình tự

DNA tách chiết từ mẫu FFPE được phân mảnh bằng enzyme fragmentase (NEBNext dsDNA Fragmentase).

Phản ứng phân cắt được thực hiện tại 37⁰C trong 24 phút.

Sản phẩm sau phân cắt được kiểm tra bằng điện di trên gel Agarose, kích thước sản phẩm tập trung 150bp-300bp.

Sản phẩm DNA sau phân mảnh được tiến hành sửa đuôi (NEBNext FFPE DNA Repair Mix) và chuẩn bị thư viện (NEBNext Ultra II DNA Library Prep Kit for Illumina).

Các bước tiến hành theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

Giải trình tự trên hệ thống giải trình tự NextSeq 550 Các mẫu thư viện được gộp chung (pooling) và được biến tính (denatured) với dung dịch NaOH 0,2N để thư viện tách mạch tạo chuỗi đơn. Thư viện sau đó được pha loãng về nồng độ 1,5pM (đối với kít giải trình tự NextSeq550 Mid Output 150 Cycles) trước khi nạp vào cartridge. Quá trình giải trình tự trải qua 2 bước chính: tạo cụm (clustering) và giải trình tự (sequencing).

Trong nghiên cứu này, để đảm bảo được khả năng phát hiện được các đột biến có tần suất thấp rất thấp, chúng tôi sử dụng bộ hóa chất NextSeq Mid output kit (150 cycles) tại độ sâu

~1.000X. Thông tin giải trình tự được hiển thị qua các thông số:

- Quality Scores: Tiêu chuẩn Q30 (nghĩa là độ chính xác của giải trình tự cho mỗi nucleotide là 99,9%) phải lớn hơn 90%.

- Cluster Density: Mật độ cụm được tạo trên mm2 (tối ưu với kít Mid Output 150 cycles: 170- 220K/mm²).

- Clusters Passing Filter (%): Thể hiện phần trăm số cụm vượt qua được các yêu cầu về chất lượng base giải trình tự (Q30) và tín hiệu ở các cụm không bị chồng lên nhau. Thông thường,

chất lượng giải trình tự tối ưu khi cluster passing filter đạt >90%.

- Estimated Yield: Khối lượng dữ liệu dự kiến thu được.

Phân tích dữ liệu giải trình tự

Dữ liệu giải trình tự được xuất dưới định dạng base call file (bcl), các cặp trình tự (pair-end reads - PE) của các mẫu khác nhau được phân nhóm (demultiplex) thông qua trình tự nhận diện 8-bp (barcode) có trên trình tự index P7 và P5 dưới định dạng fastq bằng công cụ bcl2fastq (Illumina). Các cặp trình tự (PE reads) được sắp xếp (align/map) lên trình tự bộ gen của người phiên bản số 19 (human genome version hg19) bằng thuật toán BWA 0.7.1 (Burrows Wheeler Aligner). Những cặp trình tự sắp xếp duy nhất lên một vị trí trên bộ gen (uniquely mapped pair-end reads) sẽ được sử dụng để xác định đột biến di truyền.

Đột biến điểm và đột biến mất/thêm đoạn ngắn được xác định bằng quy trình tính toán VarScan 2 qua nhiều bước kiểm tra để tăng độ tin cậy của mỗi đột biến được tìm thấy.

Đột biến chuyển đoạn và dung hợp đoạn được xác định bằng quy trình FACTERA qua các bước: 1) xác định những cặp trình tự sắp xếp bất hợp lý trên trình tự bộ gen người (discordant reads) - đây là những trình tự bao phủ vùng chuyển đoạn và dung hợp đoạn nên sẽ có chiều dài chèn bất thường, hay được sắp xếp trên 2 nhiễm sắc thể khác nhau, những cặp trình tự này được dùng xác lập những vùng gen có nhiều khả năng chuyển đoạn hay dung hợp đoạn; 2) xác định vị trí chuyển đoạn/dung hợp đoạn ở mức độ từng nucleotide - những vùng gen có nhiều khả năng chuyển đoạn hay dung hợp đoạn sẽ được xếp hạng dựa trên độ sâu tại vị trí chuyển đoạn hay dung hợp đoạn (tối thiểu là 2X), sau đó những cặp trình tự sắp xếp đúng ở gần những vùng này sẽ được sử dụng để xác định chính xác vị trí nucleotide mà hiện tượng chuyển đoạn/dung hợp đoạn đã xảy ra; 3) kiểm tra đột biến chuyển đoạn/dung hợp đoạn bằng phương pháp giả lập trên máy tính - tạo ra

Chuyên Đề Chẩn Đoán Hình Ảnh - Sinh Học Phân Tử

122

những trình tự giả lập ở từng đột biến chuyển đoạn/dung hợp đoạn và tái sắp xếp những cặp trình tự lên trình tự giả lập này để kiểm tra mức độ định vị của những cặp trình tự. Tỉ lệ định vị cao (quality alignment) thể hiện độ chính xác của việc xác định đột biến chuyển đoạn/dung hợp đoạn. Tần suất của từng đột biến điểm và đột biến mất/thêm đoạn được tính toán dựa trên tỉ lệ từng loại nucleotide tại vị trí đột biến bằng phần mềm SAMtools.

Xử lý số liệu

Số liệu được chúng tôi nhập vào lưu trữ bằng phần mềm Microsorf Excel (phiên bản 15.30). Về phân tích số liệu, chúng tôi sử dụng phần mềm R (phiên bản 4.0.0). Giá trị p <0,05 được xem là có ý nghĩa thống kê. Biểu đồ được chúng tôi xây dựng bằng gói đồ thị (packages) ggplot2 trong phần mềm R.

Y đức

Nghiên cứu này được thông qua bởi Hội đồng Đạo đức trong nghiên cứu Y sinh học Đại học Y Dược TP. HCM, số 383/HĐĐĐ-ĐHYD, ngày 30/7/2019.

KẾT QUẢ

Trong thời gian từ tháng 12/2019 đến tháng 06/2020, chúng tôi đã tiến hành thu mẫu tại bệnh viện Đại học Y Dược TP. Hồ Chí Minh. Số lượng mẫu thu là được 20 mẫu mẫu mô u được đúc sáp (FFPE) của bệnh nhân UTĐTT giai đoạn I, II, III và cùng với các thông tin về độ tuổi, giới tính, giai đoạn ung thư, vị trí khối u, kích thước khối u, phân loại mô học, độ biệt hoá và tình trạng di căn hạch và các thông tin khác của bệnh nhân UTĐTT tham gia nghiên cứu.

Bảng 1: Đặc tính lâm sàng của 20 bệnh nhân UTĐTT tham gia nghiên cứu

Đặc điểm lâm sàng n=20 %

Giới tính Nam 13 65%

Nữ 7 35%

Tuổi >40 20 100%

≤ 40 0 0%

Giai đoạn bệnh

0 1 5%

I 1 5%

II 6 30%

Đặc điểm lâm sàng n=20 %

III 8 40%

IV 1

Không thỏa tiêu chuẩn chọn mẫu nên loại khỏi

nghiên cứu Chưa phân loại 3

Không thỏa tiêu chuẩn chọn mẫu nên loại khỏi

nghiên cứu Mô học

Carcinôm tuyến 19 95%

Carcinôm tế bào

thần kinh nội tiết 1 5%

Vị trí khối u

Đại tràng 14 70%

Trực tràng 5 25%

Ống hậu môn 1 5%

Dựa vào kết quả mô học, phần lớn các bệnh nhân UTĐTT tham gia nghiên cứu tập trung vào giai đoạn I và II. Trong đó, giai đoạn 0 là 1 (5%) trường hợp, giai đoạn I có 1 (5%) trường hợp và giai đoạn II có 6 (30%) trường hợp. Phần lớn số lượng bệnh nhân giai đoạn sớm (chiếm 35% số mẫu thu được), do đó đặc tính mẫu nghiên cứu có thể đảm bảo đáp ứng được yêu cầu phát hiện giai đoạn UTĐTT của đề tài (Bảng 1).

Phần lớn khối u nằm tại đại tràng 14 trường hợp chiếm 70%, 5 trường hợp khối u tại trực tràng chiếm 25% và 1 trường hợp khối u tại ống hậu môn chiếm 5%. Nghiên cứu của chúng tôi tương đồng với nghiên cứu của Phipps và cộng sự, khi khảo sát 3284 trường hợp cho thấy phần lớn khối u nằm tại phần đại tràng chiếm 66% và trực tràng chiếm 34%.

Trong 20 mẫu FFPE thu được, chúng tôi ghi nhận được 12 trường hợp có mang đột biến.

Như vậy, độ nhạy của quy trình là số mẫu UTĐTT mang đột biến trong tổng số mẫu bệnh nhân UTĐTT tham gia nghiên cứu: 12/20= 60%

(Bảng 2).

Bảng 2: Kết quả giải trình tự trên 20 mẫu FFPE ở bệnh nhân UTĐTT

Tên mẫu Giai đoạn Đột biến Tần suất

CRCB02 I TP53 (R175H) 26,3%

KMT2D (Q3934_Q3939del) 10,6%

CRCB03 II

PIK3CA (R88Q) 59,9%

APC(S439*) 25,6%

APC (S143fs) 24,1%

APC(R1432*); 30,5%

TP53(R213*). 18,6%

FBXW7 (R479L) 22,9%

Tên mẫu Giai đoạn Đột biến Tần suất

CRCB04 0 KRAS(G12V) 37,8%

CRCB06 II APC (E1228*) 33,3%

TP53 (R213*) 21,7%

CRCB09 III BRAF (V600E) 8,3%

KRAS (G12V) 30%

CRCB14 III APC (I1557*fs) 32,2%

TP53 (R342*) 25%

CRCB15 II PIK3CA (Q546R) 22,9%

CRCB16 III

APC (R564*) 23,2%

TP53 (R210*) 32,4%

TP53 (R342*) 9,6%

CRCB17 III TP53(R213*) 60,7%

CRCB18 II (-)

CRCB19 III TP53 (R248Q) 15,4%

CRCB20 II APC(R1432*) 4%

TP53 (R282G) 8,6%

CRCB22 II (-)

CRCB23 III (-)

CRCB25 III (-)

CRCB28 III

PIK3CA (R88Q) 26,6%

KRAS (G12V) 29,6%

TP53 (c.993+1G>C) 34,3%

CRCB29 II (-)

Phần lớn các đột biến xuất hiện trên 2 gen là TP53 và APC lần lượt chiếm tỉ lệ 38,5% và 26,9%.

Phần còn lại là các đột biến trên gen PIK3CA, KRAS và FBXW7, BRAF, KMT2D. Thống kê phổ đột biến được thể hiện bằng Hình 1.

Hình 1: Phổ đột biến từ 12 mẫu FFPE của bệnh nhân UTĐTT giai đoạn sớm

BÀN LUẬN

Việt Nam là nước có tỉ lệ UTĐTT tương đối cao, đứng hàng thứ hai trong các bệnh lý ác tính

đường tiêu hoá và là vấn đề lớn đối với sức khoẻ cộng đồng. Theo báo cáo của tổ chức Y tế Thế giới thực hiện năm 2018 tại Việt Nam thì tỉ lệ UTĐTT là 11,47/100.000 dân đối với nam, đứng thứ tư sau ung thư phổi, ung thư gan, ung thư dạ dày; tỉ lệ này ở nữ là 6,11/100.000 dân, đứng thứ năm sau ung thư phổi, ung thư gan, ung thư vú và ung thư dạ dày⁽⁸⁾. Có rất nhiều số liệu khác nhau về phân bố ung thư biểu mô tuyến trên khung đại tràng theo từng quốc qua và chủng tộc. Nhìn chung các số liệu đều thống nhất là UTĐTT xảy ra ở bên trái nhiều hơn bên phải, và nhiều nhất là ở trực tràng. Một nghiên cứu tại bệnh viện Đại học Y Dược TP. Hồ Chí Minh cho tỉ lệ ung thư trực tràng 39,2%, đại tràng chậu hông 18,75%, đại tràng xuống 14,77%, đại tràng ngang 5,11%, đại tràng lên 12,5% và manh tràng 9,65%⁽⁹⁾. Đặc điểm này tương đồng với lâm sàng của nghiên cứu, tỷ lệ vị trí khối u ở đại tràng là 70%, trực tràng là 25%.

UTĐTT nguyên phát phần lớn là ung thư biểu mô tuyến (adenocarcinôm), chiếm khoảng 90-95%. Ngoài ra các loại sarcôm ít gặp: phát sinh từ mô cơ trơn (leiomyosarcoma), mô mỡ (liposarcoma), mạch máu (hemangiosarcoma), bạch mạch (lymphangio-sarcoma), mô lưới (reticulosarcoma), mô lymphô (lymphosarcoma).

Về mặt đại thể có các dạng chồi sùi, thể loét, thể thâm nhiễm và dạng vòng nhẫn. Tuy nhiên, kết hợp của các thể này với nhau cũng rất thường gặp. Trong đó, thể chồi sùi là dạng thường gặp nhất⁽¹⁰⁾.

Theo Hình 1, phần lớn các đột biến xuất hiện trên 2 gen là TP53 và APC, chiếm tỉ lệ 38,5% và 26,9%. Do đối tượng nghiên cứu của chúng tôi là bệnh nhân UTĐTT giai đoạn sớm nên giải thích được phổ đột biến xuất hiện nhiều đối với gen APC và TP53. Vai trò của APC và TP53 đã được ghi nhận nhiều trong các nghiên cứu trước đây về UTĐTT. UTĐTT là một bệnh không đồng nhất, tiên lượng được gắn liền với việc phân chia giai đoạn lâm sàng trong nhiều thập niên đã qua. Gần đây, trong một nghiên cứu giải trình tự exon đích của 1.321 gen liên quan đến ung thư

Chuyên Đề Chẩn Đoán Hình Ảnh - Sinh Học Phân Tử

124

từ 468 mẫu khối u, Schell MJ xác định được một nhóm gồm 17 gen giúp phân loại UTĐTT tốt nhất, trong đó APC đóng vai trò trung tâm trong dự đoán sống còn toàn bộ⁽¹¹⁾. Gen APC có thể mang 0, 1 hoặc 2 đột biến cắt cụt protein (truncating mutation), mỗi dạng có một tác động rất khác nhau đến sự sống còn. Các khối u không có đột biến nào của APC có tiên lượng xấu hơn so với các khối u chỉ mang một đột biến APC; tuy nhiên, những khối u mang hai đột biến APC kèm với đột biến KRAS và TP53 lại có tiên lượng xấu nhất. Sự tăng sinh tế bào quá mức do những đột biến trên gen APC tạo ra các polyp đại tràng. Mặc dù hầu hết những người mang đột biến trên gen APC sẽ phát sinh UTĐTT, nhưng số lượng những polyp và khoảng thời gian chúng trở nên ác tính phụ thuộc vào vị trí đột biến trên gen.

Đột biến gen KRAS gặp trong khoảng 36 - 40% UTĐTT, ở nghiên cứu này đột biến KRAS chiếm 11,5%. Phần lớn đột biến xảy ra ở các codon 12, 13 và 61 của gen KRAS. Các đột biến này tạo nên tình trạng kích hoạt liên tục của đường dẫn truyền tín hiệu KRAS. Đột biến KRAS làm cho tế bào kháng với điều trị bằng kháng thể đơn dòng chống EGFR^(12,13). Bệnh nhân UTĐTT mang đột biến gen KRAS có tiên lượng kém hơn vì các thuốc điều trị nhắm trúng đích sẽ không hoạt động trên khối u. Các đột biến của gen RAS và PI3K cũng làm tăng khả năng di căn của các tế bào ung thư⁽¹⁴⁾. Trong nghiên cứu này đột biến gen PIK3CA chiếm 11,5%, các đột biến sinh dưỡng của gen PIK3CA đã được phát hiện trong 10 - 30% UTĐTT, những đột biến này thường xảy ra ở exon 9 và exon 20, gây kháng với điều trị bằng kháng thể đơn dòng chống EGFR⁽¹⁵⁾.

Các đột biến gen BRAF làm cho tế bào ung thư ác tính hơn. Vì thế những người có tế bào ung thư mang đột biến gen BRAF có tiên lượng xấu hơn. Khoảng 8 - 15% UTĐTT có mang đột biến BRAF^(16,17). Đột biến BRAF có liên quan với UTĐTT ở bên phải và làm giảm tỷ lệ sống còn toàn bộ. Bệnh nhân UTĐTT mang các đột biến

BRAF không đáp ứng với thuốc kháng thể đơn dòng chống EGFR như cetuximab hoặc panitumumab. Đột biến BRAF được báo cáo nhiều nhất là đột biến V600E. Đột biến các gen BRAF, KMT2D, FBXW7 chiếm tỷ lệ 3,8% trong nghiên cứu.

KẾT LUẬN

Bước đầu khảo sát được phổ đột biến của bệnh nhân UTĐTT giai đoạn sớm trên mẫu FFPE. Ở các giai đoạn tiếp theo của nghiên cứu, chúng tôi sẽ thu thập cỡ mẫu lớn hơn để có thể thống kê được các vị trí đột biến “nóng” (hot- spot mutation). Trong tương lai, chúng tôi sẽ có đủ thông tin để đưa ra cái nhìn tổng quát hơn về các vị trí “hot-spot” của các trên các gen được khảo sát.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Delman K A (2020). Introducing the "Virtual Tumor Board"

series in CA: A Cancer Journal for Clinicians. CA Cancer J Clin, 70(2):77.

2. Markowitz SD, Bertagnolli MM (2009). Molecular origins of cancer: Molecular basis of colorectal cancer. New England Journal of Medicine, 361(25):2449-2460.

3. Win AK, Jenkins MA, Buchanan DD, Clendenning M, Young JP, Giles GG, et al (2011). Determining the frequency of de novo germline mutations in DNA mismatch repair genes. Journal of Medical Genetics, 48(8):530-534.

4. Wang L, Baudhuin LM, Boardman LA, Steenblock KJ, Petersen GM, Halling KC, et al (2004). MYH mutations in patients with attenuated and classic polyposis and with young-onset colorectal cancer without polyps. Gastroenterology, 127(1):9-16.

5. Johnson B, Cooke L, Mahadevan D (2017). Next generation sequencing identifies 'interactome' signatures in relapsed and refractory metastatic colorectal cancer. Journal of Gastrointestinal Oncology, 8(1):20-31.

6. Zhang J, Zhang S (2017). Discovery of cancer common and specific driver gene sets. Nucleic Acids Research, 45(10):e86.

7. Phipps AI, Lindor NM, Jenkins MA, Baron JA, Win AK, Gallinger S, et al (2013). Colon and rectal cancer survival by tumor location and microsatellite instability: the Colon Cancer Family Registry. Diseases of the Colon and Rectum, 56(8):937-944.

8. Ferlay J, Soerjomataram I, Dikshit R, Eser S, Mathers C, Rebelo M, et al (2015). Cancer incidence and mortality worldwide:

sources, methods and major patterns in GLOBOCAN 2012.

International Journal of Cancer, 136(5):E359-E386.

9. Nguyễn Thúy Oanh, Lê Quang Nghĩa (2003). Kết quả chẩn đoán 176 trường hợp ung thư qua nội soi đại tràng bằng ống soi mềm. Y học Thành phố Hồ Chí Minh, 7(1):148-154.

10. Quách Trọng Đức, Nguyễn Trường Kỳ (2015). Đặc điểm nội soi và mô bệnh học của ung thư đại trực tràng: nghiên cứu loạt ca trên 1.033 trường hợp. Y học Thành phố Hồ Chí Minh, 19(1):114- 119.

11. Schell MJ, Yang M, Teer JK, Lo FY, Madan A, Coppola D, et al (2016). A multigene mutation classification of 468 colorectal cancers reveals a prognostic role for APC. Nature Communications, doi: 10.1038/ncomms11743.

12. Amado RG, Wolf M, Peeters M, Van Cutsem E, Siena S, Freeman DJ, et al (2008). Wild-type KRAS is required for panitumumab efficacy in patients with metastatic colorectal cancer. Journal of Clinical Oncology, 26(10):1626-1634.

13. Tan C, Du X (2012). KRAS mutation testing in metastatic colorectal cancer. WJG, 18(37):5171-5180.

14. Lan YT, Jen-Kou L, Lin CH, Yang SH, Lin CC, Wang HS, et al (2015). Mutations in the RAS and PI3K pathways are associated with metastatic location in colorectal cancers. Journal of Surgical Oncology, 111(7):905-910.

15. Normanno N, Rachiglio A, Lambiase M, Martinelli E, Fenizia F, Esposito C, et al (2015). Heterogeneity of KRAS, NRAS, BRAF and PIK3CA mutations in metastatic colorectal cancer and

potential effects on therapy in the CAPRI GOIM trial. Annals of Oncology, 26(8):1710-1714.

16. Bamford S, Dawson E, Forbes S, Clements J, Pettett R, Dogan A, et al (2004). The COSMIC (Catalogue of Somatic Mutations in Cancer) database and website. British Journal of Cancer, 91(2):355- 358.

17. Iacopetta B, Li W, Grieu F, Ruszkiewicz A, Kawakami K (2006).

BRAF mutation and gene methylation frequencies of colorectal tumours with microsatellite instability increase markedly with patient age. Gut, 55(8):1213-1214.

Ngày nhận bài báo: 10/12/2020

Ngày nhận phản biện nhận xét bài báo: 20/02/2021 Ngày bài báo được đăng: 10/03/2021