KHẢO SÁT MỐI TƯƠNG QUAN GIỮA TỶ LỆ HÀM LƯỢNG ctDNA VÀ MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM BỆNH HỌC CỦA UNG THƢ ĐẠI TRỰC TRÀNG
GIAI ĐOẠN SỚM
Đường Thị Hồng Diệp1, Lê Hồng Thủy2, Nguyễn Hoài Nghĩa1, Đỗ Thị Thanh Thủy3, Trần Diệp Tuấn1
TÓM TẮT
Mục tiêu: Ung thư đại trực tràng (UTĐTT) là dạng ung thư thường gặp hiện nay và đang có xu hướng trẻ hoá. Triệu chứng của UTĐTT phụ thuộc vào giai đoạn khối u, vị trí khối u, kích thước khối u, mức độ xâm lấn và mức độ di căn. Sử dụng phương pháp giải trình tự thế hệ mới trên mẫu sinh thiết lỏng giúp tìm ra các đột biến trực tiếp trong dòng máu của bệnh nhân là một hướng đi đầy tiềm năng. Nghiên cứu mối liên quan giữa tỷ lệ hàm lượng ctDNA và một số đặc điểm bệnh học của UTĐTT là nền tảng cho việc sử dụng ctDNA trong chẩn đoán sớm, điều trị và theo dõi tái phát. đặc biệt là trong ung thư giai đoạn sớm.
Đối tượng và Phương pháp: Phương pháp giải trình tự thế hệ mới được thực hiện để tìm ra các đột biến trên 20 gen có tần suất đột biến cao trên bệnh nhân ung thư đại trực tràng đã được báo cáo trên thế giới. Mẫu máu của 50 bệnh nhân ung thư đại trực tràng với các giai đoạn khác nhau: 0, I, II và III được thu thập từ 01/2021 đến 08/2021 để giả trình tự tìm đột biến và phân tích mối liên quan nếu có giữa phổ đột biến gene và các đặc điểm lâm sàng của bệnh.
Kết quả: Tỷ lệ hàm lượng ctDNA trên một số gen có xu hướng tăng theo giai đoạn, kích thước khối u, vị trí khối u, mức độ xâm lấn và di căn hạch. Nghiên cứu này có thể làm nền tảng cho việc tiếp tục nghiên cứu phát triển sử dụng ctDNA trong chẩn đoán sớm hay theo dõi điều trị ung thư đại trực tràng.
Kết luận: Kết quả nghiên cứu bước đầu cho thấy việc phát hiện ct DNA trong máu bệnh nhân ung thư đại trực tràng ở các giai đoạn khác nhau là khả thi. Có thể tiếp tục hướng nghiên cứu phát triển ctDNA thành một kỹ thuật sinh thiết lỏng trong tương lai gần để phát hiện sớm ung thư đại trực tràng, theo dõi điều trị, giúp các bác sĩ lâm sàng có thêm lựa chọn khi thực hiện đánh giá và theo dõi hiệu quả điều trị, đánh giá tế bào ung thư tồn dư và tái phát.
Từ khóa: ung thư đại trực tràng (UTĐTT), ctDNA, cfDNA
ABSTRACT
SURVEYING THE CORRELATION BETWEEN ctDNA AND PATHOLOGICAL FEATURES IN EARLY STAGE OF COLORECTAL CANCER
Duong Thi Hong Diep, Le Hong Thuy, Nguyen Hoai Nghia, Do Thi Thanh Thuy, Tran Diep Tuan
* Ho Chi Minh City Journal of Medicine * Vol. 26 - No 1 - 2022: 161-169 Objectives: Colorectal cancer is the most common form of cancer today and tends to be younger. Symptoms of colorectal cancer depend on tumor stage, tumor location, tumor size, invasion, and metastasis. Using a next generation sequencing (NGS) method to find out the tumor specific genetic mutations directly in the patient's blood samples is reliable. Study the relation between ctDNA from patients blood sample and the colorectal cancer pathological features is the necessary for the next using of ctDNA in early diagnosis, treatment, and follow-up of recurrence, especially in early-stage cancer.
1Trường Đại học Y Dược TP. Hồ Chí Minh 2Trường Đại học T}y Nguyên, Đăk Lăk
3Viện di truyền y học TP. Hồ Chí Minh
Tác giả liên lạc: TS. Đường Thị Hồng Diệp ĐT: 0989369390 Email: [email protected]
Methods: Using the New generation sequencing method (Illumina) to determine the mutations in over 20 genes with high mutation frequency reported in colorectal cancer over the world. Blood samples of 50 patients with diferent stages, such as: 0, I, II, and III were selected from January 2021 to August 2021 and subjected to sequencing, as well as data analysis to find down the potential correlation.
Results: The ctDNA of some target genes tended to increase with stage, tumor size, tumor location, invasion and lymph node metastasis. The results suggesting that ctDNA is one of the potential markers for early diagnosis, recurency and treatment monitoring of colorectal cancer.
Conclusion: The results of this study show that the dectection of ctDNA in patients blood
sample in diferent stages is realiable. The next study can be extended, to make sure that ctDNA can be properly use as a liquid biopsy marker for early diagnosis and treatment monitoring.
Key word: colorectal cancer, ctDNA, cfDNA
ĐẶT VẤN ĐỀ
Ung thư đại trực tr|ng (UTĐTT) l| loại ung thư phổ biến ở Việt Nam và trên thế giới. Theo thống kê của tổ chức Y tế thế giới WHO về tình hình ung thư ở Việt Nam năm 2020, UTĐTT đứng thứ 5 trong số các bệnh ung thư phổ biến nhất, chiếm 9% c{c trường hợp mắc mới(1). Triệu chứng của UTĐTT phụ thuộc vào giai đoạn khối u, mức độ biệt hóa, vị trí khối u, kích thước khối u, mức độ xâm lấn và mức độ di căn. Ở giai đoạn muộn, ung thư lan rộng v|o c{c cơ quan lân cận, di căn đến c{c cơ quan xa l|m người bệnh tử vong(2).
Ở Việt Nam, UTĐTT vẫn chưa có phương pháp phát hiện sớm hiệu quả. Các dấu ấn (kh{ng nguyên) ung thư có độ nhạy v| độ đặc hiệu kém. cfDNA mang đột biến hay ctDNA (circulating tumor DNA) được coi là một dấu ấn sinh học tiềm năng v| mang nét đặc trưng trong việc chẩn đo{n sớm, theo dõi điều trị và tiên lượng khả năng t{i ph{t ung thư thông qua sự thay đổi nồng độ của cfDN(3,4).
Tỷ lệ ctDNA trên tổng số cfDNA được gọi là tỷ lệ h|m lượng ctDNA hay tần suất đột biến (MAF – Mutation Alelle Fraction) trong cơ thể biến động theo mỗi c{ nh}n v| theo giai đoạn bệnh, nồng độ cfDNA tăng mạnh ở bệnh nhân ung thư, đặc biệt trong giai đoạn tái phát và xâm lấn so với người khoẻ mạnh, tuy nhiên, nồng độ này giảm dần sau qu{ trình điều trị loại bỏ khối u. Do đó, việc khảo s{t mối tương quan giữa tỷ
lệ h|m lượng ctDNA v| phổ đột biến gen với các đặc điểm bệnh học của UTĐTT l| cần thiết.
ĐỐI TƢỢNG - PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Đối tƣợng nghiên cứuCác bệnh nh}n ung thư đại trực tràng giai đoạn I, II, III (theo tiêu chuẩn của AJCC VII) ở bệnh viện Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh trong thời gian từ 01/2021 đến 08/2021.
Tiêu chuẩn chọn
Bệnh nhân tham gia nghiên cứu thỏa mãn c{c điều kiện sau: (i) bệnh nh}n đồng ý tự nguyện tham gia nghiên cứu sau khi được tư vấn rõ c{c điều kiện v| nguy cơ khi tham gia nghiên cứu; (ii) bệnh nh}n được chẩn đo{n UTĐTT giai đoạn 0 – III; (iii) bệnh nh}n chưa qua điều trị can thiệp; (iv) bệnh nhân không truyền m{u trong vòng 3 th{ng trước khi tham gia nghiên cứu.
Tiêu chí loại ra
Khi bệnh nh}n không đ{p ứng được tiêu chí chọn mẫu.
Phƣơng pháp nghiên cứu
Đầu tiên, 10 ml máu của bệnh nh}n được thu giữ trong ống BD Vacumtainer, sau đó được quay ly tâm 2 lần (1600 x g trong 10 phút tại 4oC và 16.000 x g trong 10 phút tại 40C). Huyết thanh thu được được bảo quản ở -800C. CfDNA được tách chiết bằng bộ hoá chất MagMAX Cell-Free DNA Isolation kit (Thermo Fisher, USA) theo hướng dẫn của nhà sản xuất. CfDNA tách chiết được chuẩn bị thư viện bằng bộ hoá chất Accel-
NGS 2S DNA Library Kit (Swift Biosciences, USA) theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Nồng độ của thư viện được định lượng bằng hệ thống QuantiFluor dsDNA (Promega, USA).
DNA từ mô u (FFPE) được tách chiết bằng bộ kit QiaAmp DNA FFPE kit (Qiagen), qui trình tách chiết được tiến h|nh theo hướng dẫn của bộ kit, quá trình tách chiết mẫu có xử lí với Uracil-N-Glycosilase để loại bỏ các gốc cytosine bị deamin hóa. DNA tách chiết từ mẫu FFPE được phân mảnh bằng enzyme fragmentase (NEBNext dsDNA Fragmentase). Phản ứng phân cắt được thực hiện tại 370C trong 25 phút.
Sản phẩm sau phân cắt được kiểm tra bằng điện di trên gel Agarose, kích thước sản phẩm tập trung 150bp-300bp. Sản phẩm DNA sau phân mảnh được tiến hành sửa đuôi (NEBNext FFPE DNA Repair Mix) và chuẩn bị thư viện (NEBNext Ultra II DNA Library Prep Kit for Illumina). C{c bước tiến h|nh theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
Mỗi phân tử cfDNA được tách chiết sẽ được gắn với “adaptor” thông qua phản ứng nối (ligation) được xúc tác bởi enzyme. “Adaptor”
bao gồm các thành phần: mã x{c định UID (là đoạn trình tự 8bp đặc trưng cho từng phân tử cfDNA ban đầu), trình tự mã hóa mẫu (index:
một đoạn trình tự đặc hiệu cho mỗi mẫu, cho phép giải trình tự đồng thời nhiều mẫu) và một đoạn oligonucleotide cho phép cfDNA gắn được trên giá thể giải trình tự (flow cell). Cấu trúc cfDNA-adaptor sẽ được nhân bản bằng PCR với số lượng chu kì giới hạn. Các sản phẩm từ bước tạo thư viện của mẫu sẽ được tiến hành lai với hỗn hợp mẫu dò đặc hiệu cho 20 gen mục tiêu (APC, TP53, FAT4, LRP1B, TGFBR, FAT1, BRAF, KMT2C, KMT2D, ARID1A, TRRAP, ZFHX3, TCF7L2, KRAS, PIK3CA, ACVR2A, FBXW7, RNF43, SMAD4, PREX2) - quy trình theo bộ hoá chất xGen Lockdown Reagents. Quá trình giải trình tự được thực hiện trên hệ thống Illumina NextSeq 550 với NextSeq 500/550 Mid output kits v2 (150 cycles), có độ phủ trung bình 15.000 X. Kết quả giải trình tự sẽ được phân tích bằng
phần mềm của hãng Swift Bioscience.
C{c đột biến ghi nhận sẽ được chúng tôi phân loại đột biến dựa trên cơ sở dữ liệu COSMIC chuyên biệt cho đột biến trong ung thư. Trên nền mẫu máu, nên sẽ không thể tránh khỏi tình trạng ghi nhận c{c đột biến sinh dưỡng thể khảm có nguồn gốc từ các tế bào máu. Một trong số đó l| những đột biến đến từ các dòng tế bào tạo máu (Clonal Hematopoiesis - CH). Đ}y là những đột biến sinh dưỡng được tích lũy trong các tế bào gốc hoặc tế bào tiền thân tạo máu. Các nghiên cứu trước đ}y cho thấy hiện tượng Clonal Hematopoiesis có thể tạo nên những dòng tế b|o m{u mang đột biến ung thư nhưng bị apoptosis trước khi góp phần vào quá trình sinh ung. Những tế b|o m{u mang đột biến sẽ bị apoptosis, gây phóng thích cfDNA vào máu ngoại vi, dẫn đến sự nhầm lẫn với ctDNA phóng thích từ khối u thực sự. Để chứng minh được c{c đột biến này xuất phát từ các dòng tế bào gốc tạo m{u, chúng tôi đã tiến hành giải trình tự vật liệu di truyền thu từ lớp buffy coat (chứa tế bào bạch cầu) của từng mẫu huyết tương tương ứng. Mẫu buffy coat đã được chúng tôi thu nhận khi phân lập huyết tương.
Từ đó, chúng tôi có cơ sở x{c định đột biến từ khối u mà không phải từ tế bào máu. Như vậy, đột biến xuất phát từ khối u (hay ctDNA) là các đột biến ghi nhận trên mẫu huyết tương nhưng không hiện diện trên mẫu bạch cầu, đồng thời có xuất hiện trong mẫu mô u.
Phân tích và xử lý số liệu
Các số liệu được phân tích trên các phần mềm STATA 10.
So sánh các tỉ lệ bằng test χ2, kiểm tra biến định lượng có phân phối chuẩn hay không bằng phép kiểm Kolmogosov-Smirnov khi cỡ mẫu lớn hơn 50, phép kiểm Shapiro-Wilk khi cỡ mẫu nhỏ hơn 50, so sánh các trung vị bằng phép kiểm Mann-Whitney, sử dụng phép kiểm Wilcoxon x{c định sự thay đổi có ý nghĩa c{c biến định lượng với giá trị nền tại thời điểm theo dõi bệnh nhân (p <0,05 được xem có ý nghĩa thống kê).
Y đức
Nghiên cứu đã được thông qua Hội đồng Đạo đức trong nghiên cứu Y sinh học Đại học Y Dược TP. HCM, số 952/ĐHYD-HĐĐĐ.
KẾT QUẢ
Bảng 1. Đặc điểm thông tin lâm sàng
Đặc điểm lâm sàng n=50 %
Giới tính Nam 32 64
Nữ 18 36
Tuổi (Trung vị (Tứ phân vị)) 62 (57-70)
Giai đoạn bệnh
0 2 4
I 5 10
II 20 40
III 21 42
Chưa phân loại 2 4
Mức độ xâm lấn
Niêm mạc và dưới niêm 4 8
Lớp cơ 12 24
Thanh mạc 29 58
Mô mỡ xung quanh 4 8 Cơ quan lân cận 1 2
Vị trí khối u
Đại tràng 36 72
Trực tràng 11 22
Ống hậu môn 2 22
Manh tràng 1 2
Kích thước khối u
≤ 3 cm 14 28
3 – 6 cm 22 44
≥ 6cm 13 26
Chưa xác định 1 2
Di căn hạch Có 22 44
Không 28 56
Số lượng mẫu thu l| được 50 mẫu máu có kèm mẫu FFPE của bệnh nh}n UTĐTT giai đoạn 0, I, II, III. Trong đó, bệnh nh}n có độ tuổi trung bình là 62,5 tuổi với trung vị 62 tuổi (tứ phân vị:
(57 - 70). Nam giới mắc bệnh nhiều hơn nữ giới với tỉ lệ lần lượt là 64% và 36%. Tỷ lệ nam:nữ là 1,7. Về giai đoạn bệnh, tỉ lệ bệnh nhân ở giai đoạn sớm (giai đoạn 0, I và II) chiếm 50,4%, giai đoạn III là 42%, còn lại l| chưa ph}n giai đoạn bệnh. Hầu hết các bệnh nhân tham gia nghiên cứu đều có khối u kích thước khoảng 3 – 6 cm (44%), có 14 trường hợp khối u dưới 3cm và 13 trường hợp có khối u lớn hơn 6cm, vị trí của khối u nằm chủ yếu tại đại tr|ng (72%), 1 trường hợp ở manh tr|ng (2%), 2 trường hợp có khối u
nằm tại ống hậu môn (4%), còn lại nằm tại trực tràng (22%) (Bảng 1).
Trong thời gian vừa qua, các nghiên cứu đột phá về ctDNA đã được thực hiện, tạo điều kiện thuận lợi trong nghiên cứu c{c gen ung thư v|
các ứng dụng của công nghệ giải trình tự thế hệ mới (NGS). Ngoài việc không xâm lấn, các nhà nghiên cứu đã tìm thấy rằng việc sàng lọc các tổn thương di truyền bằng cách sử dụng ctDNA có độ nhạy v| đặc hiệu cao, dựa trên ctDNA nhiều ung thư giai đoạn sớm có thể được phát hiện với độ đặc hiệu gần như tuyệt đối (99%)(5,6), do đó việc sử dụng ctDNA có thể cải thiện đ{ng kể các hệ thống chẩn đo{n khối u hiện tại, thậm chí tạo điều kiện phát hiện ung thư ở giai đoạn sớm(7). Như vậy, qua quá trình khảo sát, nghiên cứu của chúng tôi đã bước đầu tìm được mối liên quan giữa tỷ lệ h|m lượng ctDNA với một số đặc điểm bệnh học của UTĐTT.
Mặc dù cho đến thời điểm hiện tại phân tích cfDNA sẽ không thay thế được sinh thiết khối u nhưng nó có thể cung cấp thêm thông tin quan trọng có liên quan đến đột biến của khối u và di căn trong trường hợp không thể sinh thiết hoặc lặp lại sinh thiết cho l}m s|ng. Hơn nữa, cfDNA có thể bổ sung những thông tin khác của khối u khi sinh thiết đã được thực hiện, ví dụ tính không đồng nhất khối u, di căn v| trong c{c nghiên cứu theo chiều dọc(8). Do ctDNA hiện diện trong m{u v| được phóng thích từ phần lớn các tế bào trong mô u nên việc sử dụng ctDNA sẽ khắc phục được những giới hạn của sinh thiết khối u. Việc sử dụng sinh thiết lỏng (chủ yếu từ máu) trong các khối u ác tính giúp cho quá trình phát hiện sự hiện diện của c{c đột biến một cách thuận tiện v| an to|n hơn, để theo dõi phản ứng điều trị, phát hiện sớm sự tái phát v| để tiên lượng kết quả điều trị ung thư(9).
Nghiên cứu của chúng tôi cho thấy giữa tỷ lệ h|m lượng ctDNA của từng gen có mối liên quan với c{c giai đoạn ung thư. Tỷ lệ h|m lượng ctDNA ở giai đoạn III trên gen ZFHX3, LRP1B, KMT2D, KRAS lần lượt là 7,21%, 13,78%, 1,1%, 2,98% cao hơn ở giai đoạn 0 và I. Ở giai đoạn rất
sớm (giai đoạn 0 và 1), chúng tôi ghi nhận tần suất đột biến với tỷ lệ khá cao trên các gen
TCF7L2 (8,99%), ARID1A (4,92%) (Hình 1).
Hình 1. Tương quan giữa tỷ lệ hàm lượng ctDNA và các giai đoạn bệnh (n =50)
Hình 2. Tương quan giữa tỷ lệ hàm lượng ctDNA và vị trí khối u (n = 50)
Hình 3. Tỷ lệ hàm lượng ctDNA và kích thước khối u (n = 50)
Hình 4. Tỷ lệ hàm lượng ctDNA và mức độ xâm lấn của khối u (n = 50)
Hình 5. Tương quan giữa tỷ lệ hàm lượng ctDNA và mức độ di căn hạch (n = 50) Nghiên cứu của chúng tôi cho thấy mối liên
quan giữa giữa tỷ lệ h|m lượng ctDNA của từng gen và vị trí của khối u. Tỷ lệ h|m lượng ctDNA của khối u nằm ở ống hậu môn trên gen APC, ZFHX3, KRAS lần lượt là 4,25%, 3,25%, 5,65%
cao hơn khối u nằm ở đại tràng và trực tràng (Hình 2).
Nghiên cứu của chúng tôi cho thấy mối liên quan giữa giữa tỷ lệ h|m lượng ctDNA của từng gen v| kích thước của khối u. Cụ thể, tỷ lệ hàm lượng ctDNA ở khối u có kích thước trên 6 cm trên gen TCF7L2, KRAS, PIK3CA lần lượt là
8,84%, 1,63%, 1,25% cao hơn so với các khối u có kích thước dưới 3 cm (Hình 3).
Nghiên cứu của chúng tôi cho thấy mối liên quan giữa giữa tỷ lệ h|m lượng ctDNA của từng gen và vị trí của khối u. Tỷ lệ h|m lượng ctDNA của khối u nằm ở ống hậu môn trên gen APC, ZFHX3, KRAS lần lượt là 4,25%, 3,25%, 5,65%
cao hơn khối u nằm ở đại tràng và trực tràng (Hình 4).
Nghiên cứu của chúng tôi cho thấy mối liên quan giữa tỷ lệ h|m lượng ctDNA của từng gen và mức độ xâm lấn của khối u. Tỷ lệ h|m lượng
ctDNA trên gen RNF43, FAT4, KRAS, LRP1B ở các khối u xâm lấn đến lớp cơ lần lượt là 20,18%, 2,4%, 1,56%, 1,06% cao hơn c{c khối u mới xâm lấn đến lớp niêm mạc v| dưới niêm. Tần suất đột biến của gen KMT2C, ZFHX3, SMAD4 cao nhất ở khối u xâm lấn tới mô mỡ xung quanh (1,81%, 0,37%, 0,5%) (Hình 5).
BÀN LUẬN
Theo kết quả của biểu đồ 3, chúng tôi bước đầu ghi nhận tần suất đột biến của một số gen tăng dần theo giai đoạn. Cụ thể, tỷ lệ h|m lượng ctDNA ở giai đoạn III trên gen ZFHX3, LRP1B, KMT2D, KRAS lần lượt là 7,21%, 13,78%, 1,1%, 2,98% cao hơn ở giai đoạn 0 và I. Như vậy chúng ta có thể thấy ở giai đoạn càng muộn thì lượng ctDNA được giải phóng từ khối u ra càng nhiều, do đó, chúng tôi ghi nhận sự liên quan giữa ở tỷ lệ h|m lượng ctDNA v| c{c giai đoạn bệnh. Và kết quả n|y cũng phù hợp với phân tích ở trên khi chúng tôi ghi nhận phổ đột biến gen có mối liên quan với giai đoạn bệnh, càng ở giai đoạn sau thì số gen bị đột biến càng nhiều. Kết quả của chúng tôi cũng tương đồng với kết quả trong nghiên cứu của Yang YC cho thấy lượng ctDNA tăng theo giai đoạn ung thư(10). Tỷ lệ hàm lượng ctDNA ở nhóm gen quy định cấu trúc NST và nhân tố phiên mã chiếm tỷ lệ cao nhất, cụ thể ZFHX3 7.21%, KMT2D 1,1%, KRAS 2,98%. Một số gen không thấy xuất hiện ở giai đoạn 0 v| I như FAT4, PIK3CA, RNF43, FBXW7.
Tuy nhiên, do số lượng bệnh nhân tham gia nghiên cứu không đồng đều trong c{c giai đoạn nên trong nghiên cứu n|y chúng tôi chưa thể hiện rõ mối tương quan giữa các giai đoạn bệnh và tần suất đột biến trên tất cả các gen trong bảng gen đã đề ra. Trong nghiên cứu của chúng tôi cũng ghi nhận được tần suất đột biến tương đối thấp của một số gen có thể ph{t hiện được ở giai đoạn rất sớm (giai đoạn 0 v| I), cụ thể KMT2D (0,14%), KMT2C (0,4%), ZFHX3 (0,13%).
Kết quả n|y cho thấy, bằng phương ph{p giải trinh tự thế hệ mới cho phép chúng ta nhận biết được c{c đột biến ung thư có tần suất thấp khoảng từ 0,13%. Như vậy ở giai đoạn sớm thì
tìm đột biến trên các nhóm gen này có thể là một gợi ý hữu ích cho chẩn đo{n nếu nghiên cứu được làm với số lượng mẫu lớn hơn. Trong giai đoạn 0 v| I nhóm gen quy định cấu trúc nhiễm sắc thể và nhân tố phiên mã chiếm ưu thế với tần suất đột biến tương đối cao (TCF7L2 30,99%, ARID1A 4,92%, KMT2C 0,4%). Tuy nhiên ở giai đoạn II v| III nhóm gen kh{ng ung thư có tần suất đột biến cao hơn (LRP1B 13,78%, TP53 0,55%, FAT4 0,78%, PIK3CA 0,74%). Kết quả này của chúng tôi cũng tương đồng với nghiên cứu của Zhuang Y cho thấy gen PIK3CA và FAT4 có tần suất đột biến cao hơn ở nhóm giai đoạn II(11). Với ghi nhận này có thể mở ra hướng nghiên cứu xây dựng bản đồ gen phù hợp để tầm soát UTĐTT giai đoạn sớm.
Dựa theo kết quả của Hình 2, tỷ lệ hàm lượng ctDNA của khối u nằm ở ống hậu môn trên gen APC, ZFHX3, KRAS lần lượt là 4,25%, 3,25%, 5,65% cao hơn khối u nằm ở đại tràng và trực tràng. Tuy nhiên, trong nghiên cứu này chúng tôi cũng ghi nhận sự thay đổi về tần suất đột biến của c{c gen đối với các khối u ở các vị trí khác nhau. Cụ thể, đối với c{c khối u ở đại tr|ng v| trực tr|ng, các gen thuộc nhóm gen kháng ung thư đã được phát hiện với tần suất rất thấp như FAT4 (0,95%), TP53 (0,18%), TGFBR2 (0,3%), ARID1A (0,4%); trong khi đó, c{c gen nhóm này có tần suất đột biến cao hơn hẳn ở c{c khối u ở ống hậu môn APC (4,25%), TGFBR2 (3,02%), ARID1A (1,33%) ZFHX3 (3,25%). Ở ống hậu môn chỉ phát hiện được đột biến trên KMT2C, KMT2D, ZFHX3, APC, KRAS, ARID1A, FBXW7, FAT1. Như vậy, mặc dù trong nghiên cứu này chúng tôi chưa tìm thấy mối tương quan giữa tỷ lệ h|m lượng ctDNA với các khối u ở vị trí khác nhau. Nhưng kết quả n|y bước đầu cho thấy có thể định hướng cho việc ph{t hiện vị trí của khối u trong UTĐTT trong tương lai dựa v|o sự xuất hiện đột biến của c{c gen đặc trưng cho vị trí đó.
Theo kết quả của Hình 3, chúng tôi ghi nhận có mối tương quan giữa tỷ lệ h|m lượng ctDNA v| kích thước của khối u ở bệnh nh}n UTĐTT, tỷ lệ h|m lượng ctDNA ở khối u có kích thước trên
6 cm trên gen TCF7L2, KRAS, PIK3CA lần lượt là 8,84%, 1,63%, 1,25% cao hơn so với các khối u có kích thước dưới 3 cm. Trong đó, tỷ lệ h|m lượng ctDNA của một số gen có sự thay đổi rõ rệt giữa c{c khối u có kích thước kh{c nhau. Cụ thể, tần suất đột biến của gen KRAS ở c{c khối u ≥6 cm cao gấp 5 lần so với tần suất đột biến của gen n|y ở c{c khối u từ 3 – 6 cm (1,63% so với 0,32%), tương tự tần suất đột biến của gen TCF7L2 ở c{c khối u ≥6 cm cao hơn so với tần suất đột biến của gen n|y ở c{c khối u nhỏ hơn 3 cm (8,84% so với 0,5%). Như vậy, với kết quả nghiên cứu n|y chúng tôi đã từng bước nhận thấy mối tương quan giữa tỷ lệ h|m lượng ctDNA v| kích thước của khối u. Điều n|y chứng tỏ khối u c|ng lớn thì ctDNA được phóng thích v|o m{u c|ng nhiều do đó tần suất đột biến cũng cao hơn, kết quả này cũng có thể là một gợi ý hữu ích trong việc phát hiện, chẩn đo{n v| điều trị UTĐTT.
Qua khảo sát chúng tôi ghi nhận các ctDNA được phát hiện chủ yếu ở các bệnh nhân có khối u đã x}m lấn qua lớp cơ v| lớp thanh mạc. Dựa theo kết quả của biểu đồ 4 cho thấy, chúng tôi chưa ghi nhận được mối liên quan giữa tỷ lệ h|m lượng ctDNA và mức độ xâm lấn của khối u trong UTĐTT. Nguyên nh}n có thể do số lượng mẫu trong nghiên cứu phân theo mức độ xâm lấn của khối u không đồng đều cho nên kết quả của nghiên cứu chưa thể hiện được sự tương quan n|y. Tuy nhiên, chúng tôi cũng ghi nhận được sự khác biệt về tần suất đột biến của các gen với mức độ xâm lấn của khối u. Cụ thể, tỷ lệ h|m lượng ctDNA trên gen RNF43, FAT4, KRAS, LRP1B ở các khối u xâm lấn đến lớp cơ lần lượt là 20,18%, 2,4%, 1,56%, 1,06% cao hơn các khối u mới xâm lấn đến lớp niêm mạc và dưới niêm. Tần suất đột biến của gen KMT2C, ZFHX3, SMAD4 cao nhất ở khối u xâm lấn tới mô mỡ xung quanh (1,81%, 0,37%, 0,5%). Trong khi ở các khối u xâm lấn qua lớp niêm mạc và dưới niêm tỷ lệ h|m lượng ctDNA của các gen APC, FBXW7, ARID1A, TP53 là cao nhất so với các khối u xâm lấn đến các vị trí khác. Trong khi, ở các khối u xâm lấn đến lớp cơ thì tần suất đột
biến của gen RNF43, TGFBR2, TCF7L2, KRAS, FAT4 là cao nhất. Ở các khối u xấm lấn đến lớp thanh mạc thì tỷ lệ h|m lượng ctDNA của gem PIK3CA là cao nhất. Như vậy, với những kết quả khảo s{t bước đầu trong nghiên cứu chúng tôi hi vọng bước đầu đưa ra c{c nhóm gen phù hợp với các mức độ xâm lấn khác nhau, từ đó có thể giúp ích cho công việc chẩn đo{n v| điều trị UTĐTT.
Trong nghiên cứu này, theo kết quả của biểu đồ 5, nhìn chung chúng tôi ghi nhận được mối liên quan giữa tỷ lệ h|m lượng ctDNA trên từng gen với mức độ di căn hạch ở các bệnh nhân UTĐTT. Tỷ lệ h|m lượng ctDNA ở các khối u có di căn hạch trên gen KMT2C, LRP1B, TGFBR2, APC lần lượt là 2,23%, 0,59%, 0,36%, 0,32% cao hơn so với các khối u chưa di căn hạch. Tuy nhiên tỷ lệ h|m lượng ctDNA của một số gen giữa hai nhóm thì gần như l| tương đương nhau như ZFHX3, KMT2D, APC, ARID1A, FAT1, SMAD4, TGFBR2, TP53, FAT4. Ở nhóm không có di căn hạch có tần suất đột biến cao ở nhóm gen con đường tín hiệu nội bào bao gồm gen KRAS (0,6% so với 0,18%), FBXW7 (0,98% so với 0,32%), PIK3CA (0,54% so với 0,32%). Như vậy, mặc dù chúng tôi chưa tìm thấy mối tương quan giữa tỷ lệ h|m lượng ctDNA và mức độ di căn hạch ở bệnh nh}n UTĐTT trong nghiên cứu này, nhưng với kết quả này có thể bước đầu định hướng x{c định nhóm gen thường xuất hiện đột biến với tần suất đột biến cao ở các bệnh nhân UTĐTT có hoặc không có sự di căn hạch, từ đó giúp ích cho quá trình chẩn đo{n v| tiên lượng bệnh.
Mức độ di căn hạch bạch huyết cũng l| một trong những yếu tố quan trọng trong việc phát hiện và theo dõi khối u trong bệnh UTĐTT. Tuy nhiên, khi so sánh về tần suất đột biến của các gen thì chúng tôi chưa ghi nhận được sự khác biệt giữa các bệnh nh}n có di căn hạch và không có di căn hạch.
KẾT LUẬN
Qua nghiên cứu khảo sát mối tương quan giữa tỷ lệ h|m lượng ctDNA v| c{c đặc điểm
bệnh học trên 50 bệnh nh}n ung thư đại trực tràng, chúng tôi ghi nhận được các kết quả sau:
Tỷ lệ h|m lượng ctDNA ở giai đoạn III trên gen ZFHX3, LRP1B, KMT2D, KRAS lần lượt là 7,21%, 13,78%, 1,1%, 2,98% cao hơn ở giai đoạn 0 và I.
Tỷ lệ h|m lượng ctDNA của khối u nằm ở ống hậu môn trên gen APC, ZFHX3, KRAS lần lượt là 4,25%, 13,25%, 5,65% cao hơn khối u nằm ở đại tràng và trực tràng. Tỷ lệ h|m lượng ctDNA ở khối u có kích thước trên 6cm trên gen TCF7L2, KRAS, PIK3CA lần lượt là 8,84%, 1,63%, 1,25%
cao hơn so với các khối u có kích thước dưới 3cm. Tỷ lệ h|m lượng ctDNA trên gen RNF43, FAT4, KRAS, LRP1B ở các khối u xâm lấn đến lớp cơ lần lượt là 20,18%, 2,4%, 1,56%, 1,06% cao hơn c{c khối u mới xâm lấn đến lớp niêm mạc v| dưới niêm. Tần suất đột biến của gen KMT2C, ZFHX3, SMAD4 cao nhất ở khối u xâm lấn tới mô mỡ xung quanh (1,81%, 0,37%, 0,5%). Tỷ lệ h|m lượng ctDNA ở các khối u có di căn hạch trên gen KMT2C, LRP1B, TGFBR2, APC lần lượt l| 2,23%, 0,59%, 0,36%, 0,32% cao hơn so với các khối u chưa di căn hạch.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Bray F, Ferlay J, Soerjomataram I, Siegel RL, Torre LA, Jemal A (2018). Global cancer statistics 2018: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA Cancer J Clin, 68(6):394-424.
2. Bray C, Bell LN, Liang H, Collins D, Yale SH (2017). Colorectal Cancer Screening. WMJ, 116 (1):27-33.
3. Spindler KL, Pallisgaard N, Andersen RF, Brandslund I, Jakobsen A (2015). Circulating free DNA as biomarker and source for mutation detection in metastatic colorectal cancer.
PLoS ONE, 10(4):e0108247.
4. Vymetalkova V, Cervena K, Bartu L, Vodicka P (2018).
Circulating Cell-Free DNA and Colorectal Cancer: A Systematic Review. Int J Mol Sci, 19(11):3356.
5. Cohen JD, Li L, Wang Y, Thoburn C, Afsari B, Danilova L, et al (2018). Detection and localization of surgically resectable cancers with a multi-analyte blood test. Science, 359(6378):926-930.
6. Phallen J, Sausen M, Adleff V, Leal A, Hruban C, White J, et al (2017). Direct detection of early-stage cancers using circulating tumor DNA. Sci Transl Med, 9(403):2415.
7. Cheng F, Su L, Qian C (2016). Circulating tumor DNA: a promising biomarker in the liquid biopsy of cancer. Oncotarget, 7(30):48832-48841.
8. Stewart CM, Tsui DWY (2018). Circulating cell-free DNA for non-invasive cancer management. Cancer Genet, 228-229:169- 179.
9. Ou SI, Nagasaka M, Zhu VW (2018). Liquid Biopsy to Identify Actionable Genomic Alterations. Am Soc Clin Oncol Educ Book, 38:978-997.
10. Yang YC, Wang D, Jin L, Yao HW, Zhang JH, Wang J, et al (2018). Circulating tumor DNA detectable in early- and late- stage colorectal cancer patients. Biosci Rep, 38(4):20180322.
11. Zhuang Y, Wang H, Jiang D, Li Y, Feng L, Tian C, et al (2021).
Multi gene mutation signatures in colorectal cancer patients:
predict for the diagnosis, pathological classification, staging and prognosis. BMC Cancer, 21(1):380.
Ngày nhận bài báo: 30/11/2021
Ngày nhận phản biện nhận xét bài báo: 10/02/2022 Ngày bài báo được đăng: 15/03/2022
