KHẢO SÁT SƠ BỘ THÀNH PHẦN HÓA HỌC MỘT SỐ CHỦNG VI NẤM PHÂN LẬP Ở VÙNG BIỂN BÁI TỬ LONG, QUẢNG NINH
Vũ Thùy Dung1, Hoàng Thị Hồng Liên2, Đoàn Thị Mai Hương3, Lưu Mạnh Hùng1, Nguyễn Văn Hùng1, Cao Đức Tuấn1
TÓM TẮT9
Mục tiêu: Nghiên cứu được thực hiện nhằm khảo sát sơ bộ thành phần hóa học các chủng vi nấm phân lập từ vùng biển ái Tử Long, Quảng Ninh bằng kỹ thuật sắc ký l ng hiệu năng cao.
Đối tượng và phương pháp nghiên cứu: ối tượng gồm 25 chủng vi nấm biển phân lập từ vùng biển vịnh ái Tử Long, Quảng Ninh năm 2019. Phương pháp nghiên cứu hóa học và sinh học thực nghiệm. Kết quả và kết luận: 25 chủng vi nấm biển nghiên cứu có thành phần hóa học sơ bộ tương tự chủng vi nấm biển Penicillium chrysogenum M612, bao gồm 7 hợp chất cylodipeptide có độ phân cực trung bình là cyclo- (L-Pro-L-Leu), cyclo-(L-Pro-L-Val), cyclo-(L- Ala-L-Pro), cyclo-(L-Pro-L-ILe), cyclo-(L-Pro- L-Phe), cyclo-(D-Pro-D-Phe) và cyclo-(L-Pro-L- Tyr). ên cạnh đó, một số chủng có các hợp chất có độ phân cực cao hơn (M401, M402, M403, M431, M447, M571 và M598). Tuy nhiên, kỹ thuật HPLC kh ng phát hiện được các hợp chất có hàm lượng nh , để nâng cao hiệu quả nghiên cứu, có thể áp dụng các phương pháp phân tích
1Trường Đại Học Y Dược Hải Phòng
2Trường Đại học Buôn Ma Thuột
3Viện Hóa Sinh Biển, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam
Chịu trách nhiệm chính: Nguyễn Văn Hùng, Cao ức Tuấn
Email:[email protected];
[email protected] Ngày nhận bài: 11.2.2022
Ngày phản biện khoa học: 19.3.2022 Ngày duyệt bài: 25.5.2022
có độ nhạy, độ đặc hiệu cao hơn như LC-MS, GC-MS.
Từ khóa: ái Tử Long, cylodipeptide, HPLC, vi nấm biển.
SUMMARY
PRELIMINARY SCREENING OF CHEMICAL CONSTITUENTS OF MARINE-DERIVED FUNGI ISOLATED
FROM BAI TU LONG SEA, QUANG NINH
Aims: The study was done to determine the preliminary chemical constituents of marine- derived fungi isolated from Bai Tu Long sea, Quang Ninh by high performance liquid chromatography. Subject and methods: The research subjects were 25 marine-derived fungi strains isolated from Bai Tu Long sea, Quang Ninh in 2019, utilizing experimental methods in chemistry and biology. Results and conclusion:
The main chemical constituents of 25 marine- derived fungi strains were similar to that of strain Penicillium chrysogenum M612, including 7 medium polarized cylodipeptides, cyclo-(L-Pro- L-Leu), cyclo-(L-Pro-L-Val), cyclo-(L-Ala-L- Pro), cyclo-(L-Pro-L-ILe), cyclo-(L-Pro-L-Phe), cyclo-(D-Pro-D-Phe) and cyclo-(L-Pro-L-Tyr).
Besides, there were several strains containing higher polarized compouds, such as M401, M402, M403, M431, M447, M571 và M598.
However, the high performance liquid chromatography technique can not detect low concentration compounds, thus, to increase the research outcomes, more sensitive and selective
methods like LC-MS, GC-MS should be applied.
Keywords: Bai Tu Long, cylodipeptide, HPLC, marine-derived fungi.
I. ĐẶT VẤN ĐỀ
Trong khu n khổ nhiệm vụ hợp tác quốc tế giữa Trường ại học Y Dược Hải Phòng và Trường ại học Dược, ại học Quốc gia Chungnam, Hàn Quốc, khu vực biển ái Tử Long, Quảng Ninh đã được phê duyệt để thu m u phục vụ nghiên cứu, sàng lọc các hợp chất có hoạt tính sinh học từ vi nấm biển [1].
ằng phương pháp lặn sâu có khí tài SCU A, từ ngày 27/8/2019 đến ngày 02/9/2019, 128 m u vật gồm 15 m u nước, 15 m u trầm tích và 98 m u sinh vật biển đã được thu thập [2]. Từ các m u biển đã thu nhận, 25 chủng vi nấm biển đã được phân lập trong phòng thí nghiệm. Sàng lọc hoạt tính kháng vi sinh vật (VSV) kiểm định cho thấy 25/25 chủng vi nấm biển đã phân lập thể hiện hoạt tính, trong đó, 4/25 chủng ức chế 4/7 chủng VSV thử nghiệm, 6/25 chủng ức chế 3/7 chủng VSV thử nghiệm [3]. ây là nguồn nguyên liệu tốt để thực hiện các nghiên cứu tiếp theo.
Chủng Penicillium chrysogenum M612 (ức chế 4/7 chủng VSV thử nghiệm, MIC:
128 – 256 µg/mL) đã được lựa chọn để tiếp tục nghiên cứu thành phần hóa học, từ đó đã phân lập được 7 hợp chất cyclodipeptide đã biết, các hợp chất này đều có hoạt tính kháng VSV [4]. Mặc dù đã đạt được những kết quả ban đầu, tuy nhiên, phương pháp tìm kiếm hợp chất mới, tiềm năng dựa trên định hướng hoạt tính sinh học có thể d n đến việc phân lập các hợp chất đã biết, gây tốn kém về thời gian, nguồn lực nghiên cứu. ể bổ sung dữ liệu phục vụ sàng lọc hiệu quả hơn, nghiên cứu này được thực hiện với mục tiêu: Khảo sát thành phần hóa học sơ bộ các chủng vi
nấm biển phân lập từ vùng biển ái Tử Long, Quảng Ninh bằng kỹ thuật sắc ký l ng hiệu năng cao (HPLC).
II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tượng và địa điểm nghiên cứu ối tượng nghiên cứu là 25 chủng vi nấm biển phân lập từ m u biển thu nhận ở vùng biển ái Tử Long, Quảng Ninh năm 2019 [2]. Nghiên cứu được thực hiện tại trường ại học Y Dược Hải Phòng; Viện Hóa Sinh iển và Viện Hóa học, viện Hàn lâm Khoa học và C ng nghệ Việt Nam.
2.2. Thiết bị và hoá chất
Các hóa chất sử dụng được cung cấp từ các hãng Hidia (Ấn ộ), Sigma-Aldrich (Mỹ), ức Giang (Việt Nam) ...
Thành phần hóa học sơ bộ được xác định bằng hệ thống HPLC Shimadzu, đầu dò UV ở bước sóng 205 nm và 254 nm, cột Phenomenex C18 150 x 4.6 mm.
2.3. Phương pháp nghiên cứu
Phương pháp nuôi cấy vi nấm biển lượng nhỏ (500 mL dịch nuôi cấy)
Ống lưu giữ các chủng vi nấm ở - 80 oC được đem rã đ ng từ từ trên đá, sau đó cấy chấm vào đĩa petri chứa m i trường tương ứng với m i trường phân lập [5], nu i tĩnh ở 28 oC trong 7 ngày. Từ đĩa petri, tiến hành nhân giống cấp 1 bằng cách cấy khuẩn lạc từ đĩa petri vào bình tam giác chứa 10 mL m i trường nu i cấy dạng l ng tương ứng, sau đó nu i lắc với tốc độ 100 vòng/ph t ở nhiệt độ 28oC trong 10 đến 14 ngày để thu được dịch nhân giống cấp 1. Từ dịch nhân giống cấp 1, tiến hành nu i cấy lượng nh bằng cách bổ sung dịch nhân giống cấp 1 vào bình tam giác chứa 500 mL m i trường nu i cấy dạng l ng tương ứng, sau đó nu i lắc với tốc độ 100 vòng/ph t ở nhiệt độ 28 oC trong 10 đến 14 ngày.
Phương pháp tạo cặn chiết
Sau thời gian nu i cấy, tiến hành thu nhận dịch nu i cấy (500 mL) các chủng vi nấm biển. Dịch nu i cấy đầu tiên được lọc qua màng lọc, sau đó được chiết với dung m i ethyl acetate (EtOAc; 300 mL x 5 lần). Dịch chiết sau đó được làm kh dưới áp suất giảm thu được cặn chiết tương ứng.
Phương pháp xác định sơ bộ thành phần hóa học bằng HPLC
Cặn chiết các chủng vi nấm được hòa tan trong dung m i MeOH ở nồng độ 5 mg/mL, lọc bằng màng lọc (0,45µm). 10 µL m u được đưa lệ hệ thống HPLC Shimadzu, cột Phenomenex C18 150 × 4.6 mm, thực hiện phân tích theo quy trình ( ảng 1) với pha động MeOH/nước, tốc độ dòng 1 mL/ph t.
Sắc ký đồ được ghi nhận ở bước sóng 205nm.
Phương pháp này c ng được sử dụng để xác định thời gian lưu đối với một số chất đối chứng (các hợp chất cyclodipeptide phân lập được từ chủng vi nấm biển M612 [4]).
Bảng 1. Chương trình chạy phân tích bằng HPLC
TT Thời gian Tỷ lệ MeOH (%)
1 0 5
2 40 100
3 50 100
4 51 5
5 60 5
III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.1. Kết quả nuôi cấy, tạo cặn chiết các chủng vi nấm biển vùng Bái Tử Long
ầu tiên, các chủng vi nấm biển được hoạt hóa và nu i cấy ở quy m 500 mL theo phương pháp đã m tả. Dịch nu i cấy được chiết bằng dung m i EtOAc, loại dung m i dưới áp suất giảm thu được cặn chiết tương ứng. Thử nghiệm hoạt tính kháng vi sinh vật cho thấy các m u cặn chiết có hoạt tính ức chế ít nhất 1 chủng vi sinh vật kiểm định thử nghiệm ( ảng 2).
Bảng 2. Kết quả nuôi cấy và tạo cặn chiết các chủng vi nấm biển Bái Tử Long TT Mẫu
Môi trường
nuôi
Cặn EtOAc
(g)
TT Mẫu
Môi trường
nuôi
Cặn EtOAc
(g)
TT Mẫu
Môi trường
nuôi
Cặn EtOAc
(g) 1 M401 CZ 0,7256 10 M447 ISP2 0,6772 19 M581 A1 0,2944 2 M402 PDA 0,3684 11 M448 MEA 0,1981 20 M583 MEA 0,1996 3 M403 SWA 0,5799 12 M501 ISP2 0,7775 21 M584 ISP2 0,1160 4 M404 PDA 0,6394 13 M508 A1 0,7102 22 M586 PDA 0,2443 5 M406 A1 0,4139 14 M516 A1 0,1687 23 M598 ISP2 0,8900 6 M425 ISP2 0,5644 15 M520 PMDA 0,9134 24 M601 PDA 0,4571 7 M428 CZ 0,8121 16 M561 PMDA 0,1979 25 M612 MEA 0,3740 8 M431 ISP2 0,1328 17 M571 MEA 0,5808
9 M432 PMDA 0,8284 18 M574 A1 0,6913
3.2. Kết quả xác định thành phần hóa học sơ bộ các chủng vi nấm biển Bái Tử Long Thành phần hóa học sơ bộ của các chủng vi nấm biển được xác định bằng HPLC theo phương pháp đã m tả. Trên sắc ký đồ của 25 chủng nghiên cứu cho thấy các pic ở thời gian lưu tương tự nhau (Hình 1 và 2), do đó, các chủng có thành phần hóa học tương đối giống nhau.
Hình 1. Sắc ký đồ (205 nm) cặn chiết chủng vi nấm biển số 1 đến 13 Thành phần hóa học sơ bộ của 25 chủng
vi nấm biển nghiên cứu c ng được so sánh với 7 hợp chất phân đã phân lập từ chủng vi nấm biển M612 (Hình 3) [4]. ối chiếu sắc ký đồ của 7 hợp chất này với các sắc ký đồ của các chủng vi nấm phân lập từ vùng biển ái Tử Long (Hình 4) cho phép xác định sơ bộ thành phần chủ yếu của các chủng vi nấm nghiên cứu là cyclodipeptide có độ phân cực
trung bình: cyclo-(L-Pro-L-Leu), cyclo-(L- Pro-L-Val), cyclo-(L-Ala-L-Pro), cyclo-(L- Pro-L-ILe), cyclo-(L-Pro-L-Phe), cyclo-(D- Pro-D-Phe) và cyclo-(L-Pro-L-Tyr). Bên cạnh đó, sắc ký đồ một số chủng có pic xuất hiện ở thời gian lưu 22-32 ph t, tương ứng với các hợp chất có độ phân cực cao hơn, bao gồm: M401, M402, M403, M431, M447, M571 và M598.
Hình 2. Sắc ký đồ (205 nm) cặn chiết chủng vi nấm biển số 14 đến 25
Hình 3. Cấu trúc 7 hợp chất phân lập từ chủng vi nấm biển M612 [4].
Hình 4. Sắc ký đồ (205 nm) cặn chiết chủng vi nấm biển M612 và 7 hợp chất phân lập từ chủng vi nấm M612
IV. BÀN LUẬN
Kết quả của nghiên cứu cho thấy, mặc dù 25 chủng vi nấm biển ái Tử Long có hoạt tính kháng VSV khác nhau, các chủng vi nấm này có thành phần hóa học sơ bộ tương đối giống nhau, đặc biệt là các hợp chất có độ phân cực trung bình (được rửa giải ra kh i cột sắc ký trong khoảng 5-17 ph t, tương ứng với 10-40% MeOH trong H2O). Dựa trên đặc điểm sắc ký đồ các chủng vi nấm biển nghiên cứu, so sánh với thời gian lưu của 7 hợp chất cyclodipeptide phân lập từ chủng M612 cho phép dự đoán, trong thành phần hóa học của một số chủng nghiên cứu còn có các hợp chất có độ phân cực cao hơn.
Kết quả này c ng phù hợp với nghiên cứu của nhóm về 5 chủng vi nấm biển phân lập
từ m u trầm tích biển Cát à [6].
Tuy nhiên, phương pháp xác định thành phần hóa học sơ bộ bằng kỹ thuật HPLC đã m tả chỉ được thực hiện đối với cặn chiết từ 500 mL dịch nu i cấy. Phương pháp này có hạn chế là chưa phát hiện được các chất có hàm lượng nh , do tín hiệu tương ứng với các chất này có cường độ thấp, dễ l n với tạp chất hay đường nền trong sắc ký đồ. Nhận định này đã được kiểm chứng đối với chủng vi nấm biển Aspergillus sp. M445 (có thành phần hóa học sơ bộ tương đối giống chủng M612) [6]. Trong quá trình phân lập, chủng M445 đã được nu i cấy ở quy m 20L dịch nu i cấy, kết hợp với b qua các phân đoạn có chứa 7 hợp chất cyclodipeptide phân lập từ chủng vi nấm biển M612, đã phát hiện
được 6 hợp chất, bao gồm hợp chất có hoạt tính kháng sinh tốt là germicidine A [7]. Mặc dù chưa tìm được chất mới có hoạt tính nhưng việc tìm ra hợp chất germicidine A từ chủng M445 là một khẳng định quan trọng về ưu/nhược điểm của phương pháp xác định thành phần hóa học sơ bộ bằng kỹ thuật HPLC.
Như vậy, hiệu quả sàng lọc c ng như xác định thành phần hóa học trong nghiên cứu tìm kiếm các hợp chất mới, tiềm năng từ tự nhiên có thể được nâng cao nhờ áp dụng đồng thời nhiều phương pháp: (1) sàng lọc theo định hướng hoạt tính sinh học, sử dụng các phép thử trên tế bào, mà kh ng quan tâm đến đích tác dụng của chất thử. Dựa vào kết quả thử nghiệm hoạt tính lựa chọn đối tượng nghiên cứu tiềm năng. Phương pháp này còn được gọi là phát triển thuốc bề mặt (phenotyping drug discovery). (2) Xác định thành phần hóa học sơ bộ bằng kỹ thuật HPLC. (3) Sử dụng các kỹ thuật/phương pháp phân tích có độ nhạy, độ đặc hiệu cao hơn để xác định sơ bộ thành phần hóa học trên các đối tượng nghiên cứu tiềm năng: Sắc ký l ng ghép nối khối phổ (LC-MS), sắc ký khí ghép nối khối phổ (GC-MS)
V. KẾT LUẬN
ã xác định được thành phần hóa học sơ bộ của 25 chủng vi nấm phân lập từ m u biển thu nhận ở vùng biển ái Tử Long, Quảng Ninh, trong đó, thành phần hóa học chính là 7 hợp chất cycodipeptide có độ phân cực trung bình là cyclo-(L-Pro-L-Leu), cyclo-(L-Pro-L-Val), cyclo-(L-Ala-L-Pro), cyclo-(L-Pro-L-ILe), cyclo-(L-Pro-L-Phe), cyclo-(D-Pro-D-Phe) và cyclo-(L-Pro-L- Tyr). ên cạnh đó, một số chủng có các hợp chất có độ phân cực cao hơn (M401, M402, M403, M431, M447, M571 và M598). Tuy
nhiên, do kỹ thuật HPLC kh ng phát hiện được các hợp chất có hàm lượng trong m u nh , để nâng cao hiệu quả nghiên cứu, trong quá trình khảo sát nên áp dụng thêm các phương pháp phân tích có độ nhạy, độ đặc hiệu cao hơn như LC-MS, GC-MS.
Lời cảm ơn: Nghiên cứu này được hoàn thành với sự tài trợ kinh phí từ đề tài mã số HNQT/SP P/11.19 của ộ Khoa học và C ng nghệ Việt Nam và đề tài mã số HPMU/CS/22.164 của Trường ại học Y Dược Hải Phòng.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Bộ Khoa học và Công nghệ, Quyết định số 975/Q - KHCN ngày 25/4/2019, Phê duyệt tổ chức chủ trì, cá nhân chủ nhiệm, kinh phí, phương thức khoán chi và thời gian thực hiện nhiệm vụ KH&CN thuộc Chương trình hợp tác nghiên cứu song phương và đa phương về KH&CN đến năm 2020.
2. Đỗ Anh Duy, Cao Đức Tuấn và cộng sự, Nghiên cứu phân lập một số chủng vi nấm biển có hoạt tính kháng viêm từ vùng biển ái Tử Long. Tạp chí N ng nghiệp và Phát triển Nông thôn, 2021. Tháng 11-2021: p. 112-122.
3. Cao Đức Tuấn, Hoàng Thị Hồng Liên, Lê Thị Hồng Minh và cộng sự, Sàng lọc và định danh các chủng vi nấm biển có hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định từ các m u trầm tích và sinh vật biển thu thập thuộc vùng biển ái Tử Long, Việt Nam. Tạp chí C ng nghệ Sinh học, 2021. 19(4): p. 237-242.
4. Bach Thi Nhu Quynh, Cao Duc Tuan, et al.
Cyclodipeptides Isolated From a Marine- derived Fungus Penicillium chrysogenum M612 of Bai Tu Long Sea, Quang Ninh, Vietnam In: Van Toi, V., Nguyen, TH., Long, V.B., Huong, H.T.T. (eds) 8th International Conference on the Development of Biomedical Engineering in Vietnam. BME
2020. IFMBE Proceedings, vol 85. Springer, Cham. https://doi.org/10.1007/978-3-030- 75506-5_45.
5. Cao Đức Tuấn và cộng sự, Nghiên cứu phân lập vi nấm biển từ trầm tích khu vực biển Cát à, thành phố Hải Phòng, Việt nam. Tạp chí Y học Việt Nam, 2019. 484: p. 570-576.
6. Bùi Hải Ninh, Cao Đức Tuấn và cộng sự, Nghiên cứu ứng dụng sắc ký l ng hiệu năng
cao (HPLC) để xác định sơ bộ thành phần hóa học của vi nấm biển. Tạp chí Y học Việt Nam, 2021. 503(Tháng 6): p. 271-277.
7. Cao Đức Tuấn và cộng sự, Một số hợp chất có hoạt tính kháng sinh phân lập từ chủng vi nấm biển Cát à, Hải Phòng, Việt Nam. Tạp chí Y học Việt Nam, 2021. 509(Tháng 12): p.
201-208.
MỘT SỐ YẾU TỐ LIÊN QUAN ĐẾN BỆNH PHỔI TẮC NGHẼN MẠN TÍNH ĐIỀU TRỊ NGOẠI TRÚ TẠI BỆNH VIỆN PHỔI HẢI DƯƠNG NĂM 2021
Phạm Thị Ngọc1, Cáp Minh Đức1, Phan Thị Hoài Thu2, Nguyễn Thế Anh3, Phạm Văn Thức1, Chu Khắc Tân1
TÓM TẮT10
Mục tiêu: M tả một số yếu tố liên quan đến bệnh phổi tắc nghẽn mạn tính ( PTNMT) của bệnh nhân. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu: Nghiên cứu m tả cắt ngang tiến hành tại khoa khám bệnh, ệnh viện Phổi Hải Dương, trong thời gian từ tháng 1 đến tháng 8 năm 2021 trêm 365 bệnh nhân PTNMT và 420 bệnh nhân bệnh phổi mạn tính khác. Kết quả: Các yếu tố liên quan đến PTNMT bao gồm: Tuổi từ 60 trở lên (OR = 4,73; 95%CI: 2,14 - 4,78); nam giới (OR = 1,32; 95%CI: 1,21 - 1,80); sống ở thành thị (OR = 1,17; 95%CI: 1,76 - 2,47); h t thuốc lá/thuốc lào (OR = 5,24; 95%CI: 2,54 - 4,71);
tiếp x c khói/bụi (OR = 4,12; 95%CI: 2,02 -
1Trường Đại học Y Dược Hải Phòng
2Bệnh viện Phổi Hải Dương
3Bệnh viện Hữu Nghị, Hà Nội
Chịu trách nhiệm chính: Cáp Minh ức Email: [email protected] Ngày nhận bài: 11.01.22
Ngày phản biện khoa học: 25.3.22 Ngày duyệt bài: 29.5.22
3,67); có bệnh đồng mắc (OR = 1,48; 95%CI:
1,06 - 2,15). Kết luận và kiến nghị: ệnh viện cần đẩy mạnh c ng tác tuyên truyền giáo dục sức kh e cho người dân về PTNMT để người dân tránh xa các tác nhân gây bệnh c ng như phòng ngừa các yếu tố nguy cơ, có lối sống lành mạnh để dự phòng PTNMT.
Từ khóa: Yếu tố liên quan, ệnh phổi tắc nghẽn mạn tính; ệnh viện Phổi Hải Dương.
SUMMARY
MANAGEMENT SITUATION OF TYPE 2 DIABETES PATIENTS AT GIA LOC
MEDICAL CENTER, HAI DUONG IN 2021
Objectives: Describe some factors related to chronic obstructive pulmonary disease (COPD) of patients. Subjects and research methods: A cross-sectional descriptive study was conducted at the medical examination department, Hai Duong Hospital of Lung Disease from January to August 2021 on 365 COPD patients and 420 other chronic lung disease patients. Results:
