Nghiên cứu sinh khả dụng của viên nén Capecitabine 500 mg trên chó bằng phương pháp sắc ký lỏng khối phổ LC/MS/MS

Ngày nhận bài: 27/10/2020 Ngày phản biện: 02/12/2020 Ngày chấp nhận đăng: 16/12/2020

Nghiên cứu sinh khả dụng

của viên nén Capecitabine 500 mg trên chó bằng phương pháp sắc ký lỏng khối phổ LC/MS/MS

Nguyễn Thị Thanh Hằng¹, Hồ Anh Sơn¹, Đỗ Quyết¹ Nguyễn Văn Chuyên¹, Vũ Đình Tiến², Chử Văn Mến¹

1Học viện Quân y

2Khoa Dược, Bệnh viện K

TÓM TẮT

Trong nghiên cứu này chúng tôi đánh giá sinh khả dụng của viên nén bao phim Capecitabine 500 mg trên chó bằng máy sắc ký khối phổ siêu hiệu năng UPLC-MS/MS. Điều kiện của sắc ký khối phổ gồm cột sắc ký (C₁₈; 50 × 2,1 mm; 1,7 µm), pha động MeCN – CH₃COONH₄ 5 mM (90:10), tốc độ dòng: 0,2 mL/ phút, thể tích tiêm: 5 µL.

Phương pháp được áp dụng đánh giá dược động học của viên nén Capecitabine 500 mg trên chó thực nghiệm. Các giá trị C_max,T_max, và AUC_0-24h của viên nén Capecitabine 500 mg (thuốc thử) trên chó thực nghiệm và viên Xeloda (Capecitabine 500 mg) (thuốc chứng) đã được lưu hành trên thị trường lần lượt là 6209,90 ± 2553,31 (ng/ml), 6033,20

± 1960,53 (ng/ml); 1,69 ± 0,29 giờ; 1,63 ± 0,30 giờ; 12632,40 ± 3851,64 (ngh/ml) và 12066,87

± 3992,88 (ngh/ml). Khoảng tin cậy CI 90% của giá trị T_max, C_max, MRT và AUC_0-∞ đều nằm trong khoảng cho phép, từ 0,8 – 1,25 hay 80 đến 125 %.

Như vậy, các giá trị Cmax, MRT và AUC_0-∞ tương ứng giữa thuốc thử T và thuốc chứng R là tương đương nhau theo quy định của FDA.

Từ khóa: Capecitabine, LC/MS/MS, huyết tương chó, sinh khả dụng.

ĐẶT VẤN ĐỀ

Capecitabine là hoạt chất được nghiên cứu và phát triển bởi tập đoàn dược phẩm Hofmann-La Roche, dùng làm thuốc uống hóa trị, sử dụng trong điều trị ung thư đại trực tràng, ung thư dạ dày và ung thư vú di căn. Tỷ lệ ung thư ở Việt Nam có xu hướng tăng trong những năm gần đây, tuy nhiên giá thành của thuốc Xeloda nhập lại khá cao. Ở Việt Nam đã nghiên cứu và bào chế thành công viên nén chứa Capecitabine 500mg. Tuy nhiên, để đảm bảo hiệu quả điều trị cần phải có đánh giá so sánh với biệt dược gốc Xeloda để chứng minh thuốc đảm bảo chất lượng.Vì vậy việc nghiên cứu định lượng Capecitabine trên huyết tương có ý nghĩa quan trọng.

Sắc ký lỏng khối phổ LC-MS/MS được đánh giá là phương pháp có độ nhạy cao, phân tích nhanh, chính xác đang được ứng dụng nhiều trong phân tích, định lượng các chất trong dịch sinh học [2,3].

Trong nghiên cứu trước, chúng tôi đã xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng capecitabine trong huyết tương chó sử dụng phương pháp LC/

MS/MS cho kết quả tốt [1]. Điều kiện của khối phổ gồm cột sắc ký: (C₁₈; 50 × 2,1 cm; 1,7 µm), pha động: MeOH –CH₃COONH₄ 5 mM (90:10),

tốc độ dòng: 0,2 mL/phút, thể tích tiêm: 5µL.

Phương pháp của chúng tôi đã trình bày kết quả khả quan về độ nhạy, độ chính xác và độ thu hồi của Capecitabine phân tích định lượng trong huyết tương. Phương pháp nhanh chóng, độ tin cậy và lặp lại tốt có thể phân tích chính xác Capecitabine trong các nghiên cứu dược động học. Phương pháp này có thể ứng dụng trong nghiên cứu sinh khả dụng và tương đương sinh học cho các chế phẩm có chứa Capecitabine[1]. Trong nghiên cứu này, chúng tôi áp dụng phương pháp xây dựng được để đánh giá sinh khả dụng, so sánh các thông số dược động học của viên nén Capecitabine 500 mg do Việt Nam sản xuất và chế phẩm Xeloda (Capecitabine 500 mg) của Roche sản xuất trên chó thực nghiệm. Kết quả này sẽ bước đầu đánh giá được chất lượng chế phẩm viên nén Capecitabine do Việt Nam sản xuất.

NGUYÊN VẬT LIỆU, ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Nguyên liệu, thiết bị và động vật nghiên cứu - Nguyên vật liệu:

Mẫu trắng: Huyết tương chó - Ban Động vật, Học viện Quân y.

Chất chuẩn: Capecitabine chuẩn do Công ty TNHH dịch vụ thương mại Phạm Nguyễn cung cấp. Hãng SX: U.S Pharmacopeia, Số lô SX:

R014M0, HSD: 30/04/2021; Độ tinh khiết: 100%.

Chuẩn nội Felodipin (99,30%) được cung cấp bởi Viện kiểm nghiệm thuốc Trung ương.

Thuốc thử (T): viên nén Capecitabine 500 mg; Nơi SX: Công ty CP Dược - TTB Y tế Bình Định (BIDIPHAR); Số lô SX: 0118; Ngày SX:

26/09/2018; HSD: 3 năm.

Thuốc đối chứng (R): viên nén bao phim Xeloda hàm lượng Capecitabine 500 mg; Nơi SX: Roche, Thụy Sỹ; Số đăng ký: VN- 17939-14;

Số lô SX: X4893B03; NSX: 06/07/2017; HSD:

06/07/2020.

Các dung môi bao gồm Methanol, Isopropanol, Ethylacetat, Acid formic…đạt độ tinh khiết theo tiêu chuẩn của LC-MS được mua từ công ty Merk (Đức).

- Thiết bị: Hệ thống sắc ký lỏng khối phổ LC- MS Xevo TQD (Water – Mỹ), Cân phân tích MS 205 DU (Mettler Toledo – Thụy Sĩ), Thiết bị dung môi có cấp khí N₂ (Thermo – Mỹ), Máy sinh khí nitơ (PEAK – Mỹ), Máy lắc vortex (IKAlabdancer, Đức); Máy lắc ngang (IKA HS 260 basic, Đức). Tất cả các thiết bị và dụng cụ phân tích được hiệu chuẩn theo quy định của ISO/IEC 17025 và GLP.

- Động vật thí nghiệm: chó giống đực, khỏe mạnh, cân nặng 10 - 12 kg.

Phương pháp nghiên cứu Điều kiện sắc ký:

Thiết bị phân tích: Hệ thống sắc ký lỏng khối phổ Xevo TQD Water, CBIC/EQm.01.01, cột sắc ký: (C₁₈; 50 × 2,1 mm; 1,7 µm), pha động: MeCN – CH₃COONH₄ 5 mM (90:10), tốc độ dòng: 0,2 mL/phút, thể tích tiêm: 5 µL. Điều kiện khối phổ được trình bày ở bảng 1.

Bảng 1. Thông số của detector khối phổ Chất phân tích

Thông số Capecitabine IS

(Felodipin) Chế độ ion hoá ESI (+) ESI (+)

Thế mao quản (kV) 4 4

Thế Cone (V) 24 20

Nhiệt độ khử solvat (^oC) 350 350 Tốc độ khí khử solvat

(L/H) 850 850

Tốc độ khí Cone (L/H) 60 60

Năng lượng va chạm (V) 12 10

Ion mẹ (Dalton) 360,5 384,10

Ion con (Dalton) 244,02 352,18

Phương pháp xử lý mẫu

Lấy 0,5 mL mẫu huyết tương sau khi để rã đông, thêm 20 µL dung dịch chuẩn nội làm việc. Lắc xoáy.

Thêm hỗn hợp ethyl acetat. Lắc trong 5 phút. Ly tâm với tốc độ 3000 vòng/phút trong 5 phút. Hút 2,2 mL lớp dịch trong phía trên, bốc hơi dung môi dưới dòng khí nitơ ở 400C, hòa tan cắn trong 0,5mL pha động, tiêm sắc ký.

Thiết kế nghiên cứu - Bố trí thí nghiệm

Tiến hành nghiên cứu: thực hiện trên 24 cá thể chó đực, khỏe mạnh được chia ngẫu nhiên thành 2 nhóm, mỗi nhóm 12 con. Bố trí thí nghiệm theo phương pháp chéo đôi, ngẫu nhiên, đơn liều, 2 giai đoạn, bố 2 đợt cách nhau 3 ngày (do thời gian bán thải của Capecitabine là 0,55-2,0 h, nên khoảng thời gian thuốc được coi đào thải hoàn toàn khỏi cơ thể là 10 giờ).

Động vật

thí nghiệm Giai đoạn 1 Giai đoạn 2 Nhóm 1 Thuốc thử T Thuốc đối chiếu R Nhóm 2 Thuốc đối chiếu R Thuốc thử T + Chọn cá thể chó đực khỏe mạnh, cân nặng 10 - 12 kg/con, được theo dõi trước khi tiến hành thí nghiệm 1 tuần. Bữa tối trước ngày dùng thuốc, cho chó ăn nhẹ trước đêm. Ngày dùng thuốc, không cho chó ăn sáng, cho chó uống 1 viên thuốc còn nguyên vẹn với 50 ml nước trong tình trạng không gây mê và cho chó ăn vào thời điểm 8 giờ kể từ sau khi uống thuốc.

+ Lấy máu và bảo quản mẫu huyết tương: Dùng kim vô khuẩn lấy máu tĩnh mạch cẳng chân sau của chó, mỗi lần lấy khoảng 3ml máu. Lấy máu chó cho vào các ống ly tâm sạch đã đánh số có chứa các chất chống đông. Mẫu máu được lấy ngay trước khi cho chó uống thuốc (0 giờ) và sau khi uống thuốc vào các khoảng thời gian 10 phút; 20 phút; 30 phút; 40 phút; 50 phút; 60 phút; 65 phút; 90 phút; 105 phút;

100 phút; 140 phút, 160 phút, 3h, 3,5 h, 4h, 4,5h, 5h, 5,5h, 6h, 8h và 9h sau khi uống thuốc. Sau mỗi lần lấy máu cho chó uống khoảng 10ml nước hoặc dung dịch glucose 5%. Sau khi lấy máu, mẫu máu được ly tâm tách huyết tương với tốc độ 5000 vòng/

phút trong 10 phút ở nhiệt độ phòng. Huyết tương được bảo quản lạnh -40^oC cho đến khi tiến hành phân tích. Thời gian bảo quản huyết tương không quá 29 ngày. Thời gian giữa 2 đợt thử thuốc cách nhau 3 ngày.

+ Xác định các thông số dược động học và đánh giá kết quả: Định lượng Capecitabine trong các mẫu huyết tương chó sau khi uống thuốc bằng phương pháp phân tích đã được thẩm định. Phân tích mẫu được bắt đầu ngay sau khi lấy đủ các mẫu. Toàn bộ lượng mẫu (mẫu thuốc thử/thuốc chứng) được phân tích trong cùng một ngày. Quá trình phân tích tuân thủ theo hướng dẫn về phân tích mẫu trong học của USA – FDA. Từ nồng đã định lượng được trong các mẫu huyết tương, vẽ đường cong nồng độ thuốc – thời gian của từng cá thể. Xác định các thông số dược động học (DĐH) của thuốc thử và thuốc chứng: C_max và T_max xác định trực tiếp từ các số liệu thực nghiệm thu được. AUC_0-tn xác định gần đúng bằng phương pháp hình thang, tính từ thời điểm 0 đến thời điểm t_n (điểm cuối cùng có thể xác định được bằng nồng độ thuốc trong huyết tương của từng cá thể) theo công thức:

[ ]

∑

^{− ( ) ( )}

=

+

+ × −

= ¹ +

0

1

0 12

n i

i i i

t Ci C t t

AUC

Với C_i là nồng độ Capecitabine tại thời điểm lấy mẫu t_i.

AUC_0-∞ = AUC_0-tn + C_n /K_e. Với C_n là nồng độ Capecitabine tại thời điểm lấy mẫu cuối cùng và K_e: Hằng số tốc độ thải trừ.

Đánh giá tương đương sinh học: Đánh giá SKD viên nén bao Capecitabine bào chế được với viên đối chứng thông qua so sánh các thông số DĐH

như: C_max, AUC_0-∞, MRT và T_max theo quy định.

Hai chế phẩm được coi là tương đương sinh học nếu khoảng tin cậy CI 95% của tỷ lệ các giá trị trung bình của C_maxvà AUC_0-∞ (đã chuyển logarit) giữa thuốc thử và thuốc chứng nằm trong khoảng từ 0,8 – 1,25 và T_max khác nhau không có ý nghĩa thống kê.

Phương pháp xử lý số liệu

Giá trị trung bình, độ lệch chuẩn, độ lệch chuẩn tương đối, phương trình hồi quy, hệ số tương quan hồi quy được xác định bằng phần mềm Microsoft Excel 2010.

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

Kết quả định lượng Capecitabine trong huyết tương chó sau khi uống thuốc thử và thuốc đối chứng

Tiến hành xác định nồng độ thuốc tại các thời điểm trước khi cho chó uống thuốc (0 giờ) và sau khi uống thuốc vào các khoảng thời gian 15 phút, 30 phút; 60 phút; 90 phút; 120 phút; 3h, 4h, 5h, 6h, 8h, 10h, 12h và 24 h. Kết quả biến thiên nồng độ Capecitabine trong huyết tương chó được thể hiện ở hình 1.

Time (h)

0 2 4 6 8 10 12

Plasma concentration (ng/mL)

0 2000 4000 6000 8000

VTB1LTB1

Hình 1. Đường cong nồng độ thuốc trung bình theo thời gian của 24 cá thể chó sau khi uống thuốc thử T và thuốc chứng

Nhận xét:

- Đường cong biểu diễn nồng độ thuốc – thời gian của thuốc thử và thuốc chứng có các điểm lấy mẫu phân bố đều và phù hợp. Nồng độ Capecit- abine trong máu nhóm chó uống thuốc thử hầu hết đều thấp hơn so với chó uống thuốc chứng.

Tại thời điểm 0,25 giờ, nồng độ Capecitabine đã định lượng được trong hầu hết các mẫu huyết tương chó.

Từ thời điểm 0,25-10 giờ, nồng độ Capecitabine trung bình trong huyết tương chó uống thuốc thử thấp hơn thuốc đối chứng không đáng kể và từ 10

giờ đến trước 24 giờ, nồng độ Capecitabine trong huyết tương chó uống thuốc đối thuốc thử thấp hơn rõ rệt.

Tại mỗi thời lấy mẫu, có sự dao động nhỏ giữa các cá thể, cả khi uống chế phẩm thử cũng như chế phẩm đối chứng.

Tất cả các mẫu huyết tương của chó uống thuốc đều có nồng độ Capecitabine nằm trong khoảng tuyến tính khảo sát, không điểm nào nằm ngoài đường chuẩn. Như vậy, phương pháp đã xây dựng là phù hợp với thực tế trong thử nghiệm đánh giá SKD.

Kết quả phân tích DĐH và so sánh SKD giữa thuốc thử và thuốc đối chứng.

- Xác định các thông số dược động học

Từ kết quả định lượng nồng độ Capecitabine

trong huyết tương chó và dựa vào phương pháp xác định các thông số DĐH đã ghi ở phần phương pháp, xác định được một số thông số DĐH cơ bản của Capecitabine. Kết quả được trình bày ở bảng 2.

Bảng 2. Tóm tắt số liệu so sánh sinh khả dụng thuốc Thử so với thuốc Chứng Thông số Giá trị trung bình

thuốc Thử

Giá trị trung bình thuốc Chứng

Tỷ lệ giá trị trung bình

thuốc Thử/Chứng (%) Khoảng tin cậy 90%

C_max 6209,90 6013,20 102,9 100,9 – 103,5

AUC_0-t 12632,4 12066,9 104,7 100,2 – 100,8

AUC_0-∞ 12632,6 12067,0 104,7 100,2 – 100,8

Kết quả ở bảng 2 cho thấy:

Giá trị C_max trong huyết tương chó trung bình khi uống thuốc thử là 6209,90 ± 2553,31 (ng/ml) và thuốc chứng là 6033,20 ± 1960,53 (ng/ml).

Như vậy, C_max dao động nhỏ giữa nhóm chó uống thuốc thử (CV = 41,12 %) và nhóm chó uống thuốc chứng (CV = 32,50%). Sự khác biệt giữa 2 nhóm không có ý nghĩa thống kê.

Giá trị AUC_0-24 khi uống thuốc thử là 12632,40

± 3851,64 (ng.h/ml), khi uống thuốc chứng là 12066,87 ± 3992,88 (ng.h/ml). Như vậy, giá trị AUC_0-24 có sự dao động. Giá trị CV của AUC_0-24 của nhóm uống thuốc thử và thuốc chứng lần lượt là 30,49 % và 33,09%. Tỷ lệ (%) giữa AUC_0-24/AUC_0-∞

trung bình đạt trên 99%. Như vậy, thời gian lấy mẫu cuối cùng (24 giờ) đã thoả mãn yêu cầu về đánh SKD theo quy định của FDA.

Thời gian để đạt nồng độ cực đại trong huyết tương chó T_max trung bình khi uống thuốc thử và thuốc chứng lần lượt là 1,69 ± 0,29 giờ và 1,63 ± 0,30 giờ. T_max của thuốc thử và thuốc chứng đều dao động từ 1 đến 2 giờ. Từ kết quả các thông số DĐH cho thấy: Các chó lựa chọn cho thí nghiệm tương đối đồng đều nhau, có sự dao động nhỏ giữa các cá thể.

Ảnh hưởng của sự khác nhau giữa trình tự thử,

giữa các nhóm và các cá thể chó lựa chọn ngẫu nhiên để nghiên cứu, giữa mẫu thuốc thử và mẫu thuốc chứng, giữa các giai đoạn thử thuốc đến các biến phụ thuộc ln[AUC_0-∞], ln[C_max] và ln[MRT]

là khác nhau không có ý nghĩa thống kê với giá trị p

> 0,05. Nghĩa là, mức độ hấp thu Capecitabine vào máu, nồng độ cực đại trong máu chó thực nghiệm và thời gian lưu trú trung bình của Capecitabine khi uống thuốc thử (T) và thuốc chứng (R) là tương đương nhau, khác nhau không có ý nghĩa thống kê.

Khoảng tin cậy CI 90% của giá trị Tmax, C_max, MRT và AUC_0-∞ đều nằm trong khoảng cho phép, từ 0,8 – 1,25 hay 80 đến 125 %. Như vậy, các giá trị C_max, MRT và AUC_0-∞ tương ứng giữa thuốc thử (T) và thuốc chứng (R) là tương đương nhau theo qui định của FDA.

KẾT LUẬN

Trong nghiên cứu này chúng tôi đánh giá sinh khả dụng của viên nén bao phim Capecitabine 500 mg trên chó bằng máy sắc ký khối phổ siêu hiệu năng UPLC-MS/MS. Phương pháp được áp dụng đánh giá dược học của viên nén Capecitabine 500 mg trên chó thực nghiệm. Các giá trị C_max,T_max, và AUC_0-24h của viên nén Capecitabine 500 mg (thuốc thử) trên 24 chó thực nghiệm và viên

Xeloda (Capecitabine 500 mg) (thuốc chứng) đã được lưu hành trên thị trường lần lượt là 6209,90 ± 2553,31; 6033,20 ± 1960,53 (ng/ml); 1,69 ± 0,29;

1,63 ± 0,30 giờ; 12632,40 ± 3851,64 và 12066,87

± 3992,88 (ngh/ml). Khoảng tin cậy CI 90% của

giá trị T_max, C_max, MRT và AUC_0-∞ đều nằm trong khoảng cho phép, từ 0,8 – 1,25 hay 80 đến 125 %.

Các giá trị Cmax, MRT và AUC_0-∞ tương ứng giữa thuốc thử (T) và thuốc chứng (R) là tương đương nhau theo quy định của FDA.

ABSTRACT

Assessment of the bioavailability of capecitabine 500 mg tablet in canines using LC/MS/MS method In this study, we evaluated the bioavailability of a 500 mg Capecitabine film-coated tablet in canines using LC/MS/MS method. Conditions of liquid chromatography-mass spectrometry include chromatographic column: (C₁₈; 50 × 2.1 mm; 1.7 µm), mobile phase: MeCN - CH₃COONH₄ 5 mM (90:10), flow: 0.2 mL / min, injection volume: 5µL. The method was applied on pharmacokinetic assessment of Capecitabine tablets 500 mg in canines. C_max, T_max, and AUC_0-24h values of Capecitabine 500 mg tablets (T) in canines and Xeloda tablets (Capecitabine 500 mg-R) that have been circulated in the market are 6209.90 ± 2553.31(ng/

ml), 6033.20 ± 1960.53 (ng/ml); 1.69 ± 0.29 hours; 1.63 ± 0.30 hours; 12632.40 ± 3851.64 (ng / ml) and 12066.87 ± 3992.88 (ng / ml), respectively. Confident interval of 90% of T_max, C_max, MRT and AUC_0-∞

values are within the allowed range, from 0.8 to 1.25 or 80 to 125%. Thus, the values of T_max, C_max, MRT and AUC_0-∞, respectively between T and R group are equivalent according to FDA regulations.

Keywords: Capecitabine, LC/MS/MS, canine plasma, bioavailability.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Chử Văn Mến, Vũ Đình Tiến (2020), “Nghiên cứu xây dựng quy trình định lượng capecitabine trong huyết tương chó bằng phương pháp sắc ký lỏng khối phổ”, số 1&2 tháng 1, năm 2020, trang 120-124.

2. Xiumei Lu., Lingyun Chen., Dong Wang., Juan Liu., Yanjuan Wang., Famei Li (2008),

“Quantification of Clarithromycin in Human Plasma by UPLC - MS - MS”, Shenyang Pharmaceutical University, June 2008.

3. Syed N. Alvi., Saleh Al Dgither and Muhamad M. Hammami (2016), “Rapid Determination of Clarithromycin in Human Plasma by LCMS/MS Assay”, Pharmaceutical Analytical Chemistry Open Access, pp 2471 - 2695.

4. Guidance for industry - Bioanalytical method validation, FDA 2018.

5. Guidance on Bioanalytical method validation, EMA 2012.