NGHIÊN CỨU ĐÁP ỨNG VỚI THUỐC ĐIỀU TRỊ SỐT RÉT CỦA PLASMODIUM FALCIPARUM TỪ BỆNH NHÂN Ở HUYỆN HƯỚNG
HOÁ, TỈNH QUẢNG TRỊ
Nhóm nghiên cứu:ThS.BS.Phan Thị Hằng Giang1, ThS.BS.Ngô Thị Minh Châu1, TS.BS.Tôn Nữ Phương Anh1,
TS.BS. Lê Văn An3,GS.TS.Huỳnh Đình Chiến2, Maria Carmina Paul4,GS.TS.Francesco Turrini5. (1) Bộ môn Ký Sinh Trùng, Trường Đại học Y Dược Huế - ĐHH. (2) Viện Y Sinh Học, Đại học Y Dược Huế - ĐHH. (3) Trung tâm Carlo Urbani, Bộ môn Vi Sinh, Trường Đại học Y Dược Huế - ĐHH. (4) Nghiên cứu sinh, Đại học Verona, Verona, Italia. (5) Khoa Ung bướu, Đại học Turin, Turin, Italia.
TÓM TẮT
Tổng quan: Sốt rét vẫn là một bệnh phổ biến, mỗi năm gây tử vong cho khoảng 1,5 triệu người trên thế giới, phần lớn tử vong đều do P.falciparum. Sự xuất hiện và lan rộng đa kháng thuốc của P.falciparum đã gây khó khăn cho điều trị. Hiện nay, việc đánh giá hiệu quả của thuốc đang dùng và nghiên cứu các thuốc điều trị sốt rét mới như chất ức chế Syk cho một số kết quả hứa hẹn, đóng góp đáng kể vào việc ngăn chặn bệnh sốt rét. Chất ức chế Syk ức chế Syk kinase trên màng hồng cầu ngăn chặn việc phá vỡ màng hồng cầu xảy ra, ngăn cản giải phóng mảnh trùng (merozoites) của ký sinh trùng sốt rét từ hồng cầu ký sinh để xâm nhập hồng cầu mới nên có tác dụng tiêu diệt KSTSR. Mục tiêu: Đánh giá kết quả chậm sạch KSTSR sau điều trị 3 ngày với phác đồ dihydroartemisinin + piperaquin phosphate (DHA- PPQ) trên bệnh nhân sốt rét P.falciparum không biến chứng ở huyện Hướng Hoá, tỉnh Quảng Trị và đánh giá hiệu quả ex vivo của chất ức chế Syk trên chủng P.falciparum có hoặc không có đề kháng với artemisinin. Phương pháp: Nghiên cứu thử nghiệm lâm sàng không đối chứng trên 84 bệnh nhân sốt rét chưa biến chứng do P.falalciparum, điều trị DHA-PPQ 3 ngày, xác định còn KST ở ngày thứ 3 (D3) bằng nhuộm giemsa và realtime-PCR. Nghiên cứu thực nghiệm ex vivo đánh giá hiệu quả chất ức chế Syk trên chủng P.falciparum có hoặc không có đề kháng với artemisinin. Kết quả: Tỷ lệ ký sinh trùng chậm sạch trong máu (DPC) sau 3 ngày điều trị với DHA-PPQ là 26,2% khi xác định bằng kính hiển vi và 39,3% xác định bằng Real time PCR. IC50 trung bình của chất ức chế Syk là 0.30µM. Kết luận: Có dấu hiệu Plasmodium falciparum trên bệnh nhân ở Hướng hóa, Quảng Trị kháng artemisinin. Chất ức chế Syk có hiệu quả với Plasmodium falciparum cả chủng nhạy và kháng artemisinin.
Từ khoá: Plasmodium falciparum, Artemisinin, chậm sạch KSTSR, chất ức chế Syk.
ABSTRACT
Study on response to treatment of uncomplicated P. falciparummalaria patients in Huong Hoa district, Quang Tri province.
Background: Malaria is remains a public health disease, each it year causes the death of about 1.5 million people worldwide, and almost all deaths are caused by P. falciparum malaria. The emergence and spread of multidrug-resistant P. falciparum has made it difficult to treat. Currently evaluating the effectiveness of antimalarial drugs were used and the research of new drugs such as Syk inhibitor for some promising results contributing significantly to the prevention of malaria. Syk inhibitors inhibit Syk kinase in human erythrocyte membrane prevents red blood cell membranes break occurred, is effective to prevent the liberation of the merozoites from erythrocyte to invade new red blood cells, Syk inhibitor effect destroy Plasmodium. Research Objective: To assesst the rate of delayed parasite clearance (DPC) of parasites after 3 days treatment with dihydroartemisinin plus piperaquin phosphate (DHA- PPQ) in patients with P.falciparum malaria uncomplicated in Huong Hoa district, Quang Tri province and evaluate the ex vivo efficiency of Syk inhibitor on field isolates of Plasmodium falciparum with or without resistance to artemisinin.
Research methods: Research clinical trials uncontrolled on 84 uncomplicated Plasmodium falciparum patients, DHA-PPQ treatment for 3 days, determined also the parasite in the
blood on day 3 by Giemsa staining and real time-PCR. Ex vivo experimental studied evaluating the effectiveness Syk inhibitor on P. falciparum strains with or without resistance to artemisinin. Results: The rate of delayed parasite clearance (DPC) after 3 days of treatment with DHA-PPQ was determined 26.2% by microscopy and 39.3% by Real time PCR. The average IC50 of Syk inhibitor is 0.30µM. Conclusion: There were signs of resistance to artemisinin in Plasmodium falciparum malaria patients in Huong Hoa district, Quang Tri province. Syk inhibitor is effective for all strains of Plasmodium falciparum with or without resistance to artemisinin.
Key words: Plasmodium falciparum, Artemisinin, delayed parasite clearance, Syk inhibitor.
1. ĐẶT VẤN ĐỀ
Sốt rét là một đơn bào ký sinh nội bào, bệnh lây truyền bởi muỗi Anopheles. Sốt rét vẫn còn là một bệnh phổ biến có mức lưu hành cao, mỗi năm gây tử vong cho khoảng 1,5 triệu người trên thế giới, phần lớn tử vong đều do P.falciparum. Sự xuất hiện và lan rộng đa kháng thuốc của P.falciparum đã và đang làm hầu hết các thuốc điều trị sốt rét kinh điển thường dùng đã không còn hiệu quả. Cũng như các thuốc chống sốt rét khác, kháng artemisinin đã và đang là một vấn đề lớn ở Đông Nam Á, bắt đầu với báo cáo đầu tiên vào năm 2008 ở tỉnh Battambang [14] và 2009 ở tỉnh Pailin [7] ở phía tây Campuchia, sau đó được báo cáo lan rộng khắp đất nước Campuchia[1; 2], phía tây Thái Lan[17], phía nam Mianma[12], phía nam Việt Nam [10]. Ở huyện Hướng Hoá tỉnh Quảng Trị phác đồ dihydroartemisinin + piperaquin phosphate (DHA- PPQ) đã và đang được sử dụng với chế phẩm CV artecan (40 mg dihydroartemisinin+320 mg piperaquin phosphate) của công ty Cổ phần dược phẩm OPC.
Hiện nay, việc xác định kháng artemisinin đang gặp nhiều khó khăn, các định nghĩa của kháng artemisinin dựa trên dữ liệu phòng thí nghiệm và lâm sàng.
Theo định nghĩa kháng artemisinin của WHO, 2014: Nghi ngờ kháng khi xuất hiện sự chậm làm sạch ký sinh trùng trong máu sau điều trị thuốc kháng sốt rét, bằng chứng là có hơn 10%
các trường hợp ký sinh trùng thể vô tính còn được phát hiện trong máu vào ngày thứ 3 sau khi điều trị bằng thuốc [7; 19]. Xác định kháng khi hoặc thất bại điều trị sau khi điều trị đơn trị liệu artemisinins bằng đường uống với nồng độ thuốc chống sốt rét trong máu thích hợp với bằng chứng là sự tồn tại ký sinh trùng trong 7 ngày, hoặc sự có mặt ký sinh trùng vào ngày thứ 3 và tái phát trong vòng 28 hoặc 42 ngày [21]. Bên cạnh việc đánh giá hiệu quả của thuốc sốt rét đang được sử dụng, nghiên cứu thuốc điều trị sốt rét mới đang là một đóng góp đáng kể vào việc ngăn chặn bệnh sốt rét.
Syk kinase thường có trong hồng cầu người, được kích hoạt bởi sự thiếu oxy trong hồng cầu do ký sinh trùng sốt rét ký sinh. Sự kích hoạt của Syk kinase có vai trò chủ đạo trong việc phá vỡ màng hồng cầu xảy ra trong giai đoạn cuối của chu kỳ, giai đoạn cần thiết để giải phóng mảnh trùng (merozoites) của ký sinh trùng sốt rét từ tế bào hồng cầu ký sinh xâm nhập hồng cầu mới khác. Các chất ức chế Syk làm ngừng chu kỳ này của ký sinh trùng sốt rét một cách rất hiệu quả. Việc chứng minh rằng hoạt tính của chất ức chế Syk như một chất cắt đứt chu kỳ nội hồng cầu của KSTSR là tiền đề cho việc nghiên cứu thuốc điều trị sốt rét theo cơ chế mới.
Vì vậy, chúng tôi thực hiện nghiên cứu này với mục tiêu:
1. Đánh giá kết quả chậm sạch KSTSR sau điều trị 3 ngày với phác đồ dihydroartemisinin + piperaquin phosphate (DHA- PPQ) trên bệnh nhân sốt rét P.falciparum không biến chứng ở huyện Hướng Hoá, tỉnh Quảng Trị và đánh giá hiệu quả ex vivo của chất ức chế Syk trên chủng P.falciparum có hoặc không có kháng với artemisinin.
2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tượng nghiên cứu: Nghiên cứu của chúng tôi gồm có 84 bệnh nhân sốt rét P.falciparum không biến chứng ở vùng dịch tễ sốt rét huyện Hướng Hoá, tỉnh Quảng Trị để đánh giá kết quả chậm sạch KSTSR trong máu sau điều trị 3 ngày với phác đồ dihydroartemisinin + piperaquin phosphate (DHA- PPQ) và 6 bệnh nhân sốt rét P.falciparum không biến chứng khác để thực nghiệm đánh giá hiệu quả ex vivo của chất ức chế Syk trên chủng P.falciparum có hoặc không có kháng với artemisinin.
2.1.1. Tiêu chuẩn chọn bệnh (WHO 2009):
Tuổi từ 6 tháng đến dưới 70 tuổi, không phụ thuộc giới tính. Nhiễm đơn thuần P.falciparum không biến chứng được chẩn đoán dựa vào khám lâm sàng và soi lam máu. Có sốt: nhiệt độ cơ thể ≥ 37,5 độ C hoặc tiền sử có cơn sốt trong vòng 24 giờ trước đó. Bệnh nhân có khả năng nuốt và uống thuốc. Chưa dùng bất kỳ loại thuốc chống sốt rét nào trước khi điều trị với DHA-PPQ. Bệnh nhân và/hoặc gia đình (trong các trường hợp trẻ em) đồng ý tham gia nghiên cứu. Có khả năng và sẵn sàng tham gia nghiên cứu trong suốt thời gian nghiên cứu.
2.1.2. Tiêu chuẩn loại trừ (WHO 2009): Sự hiện diện của dấu hiệu nguy hiểm hoặc có dấu hiệu của bệnh sốt rét P.falciparum nặng (ví dụ: hôn mê, co giật…). Có bệnh khác: Bệnh nhân suy dinh dưỡng nặng, hoặc sốt do các bệnh khác ngoài bệnh sốt rét (nhiễm trùng đường hô hấp dưới cấp tính, tiêu chảy nặng) hoặc đang mắc các bệnh mãn tính hoặc nghiêm trọng tiềm ẩn, nôn nặng, hoặc rối loạn tâm lý. Có tiền sử phản ứng quá mẫn hoặc chống chỉ định với bất kỳ các thành phần nào của thuốc trong phác đồ DHA-PPQ được sử dụng. Phụ nữ mang thai hoặc phụ nữ đang cho con bú.
2.1.3. Địa điểm: Vùng lưu hành sốt rét huyện Hướng Hoá, Quảng Trị. Trung tâm Carlo Urbani, Bộ môn Vi Sinh, Đại học Y Dược Huế. Khoa Sinh Y học, Đại học Sassari, Italia.
Thời gian: 09/2013-12/2014.
2.1.4. Vật liệu nghiên cứu: Phác đồ dihydroartemisinin + piperaquin phosphate (DHA- PPQ) với chế phẩm CV artecan (40 mg dihydroartemisinin+320 mg piperaquin phosphate) của công ty Cổ phần dược phẩm OPC, thuốc mới (chất ức chế Syk). Hoá chất dụng cụ, máy móc chính:
kính hiển vi, máy Real time – PCR, máy ly tâm, tủ cấy CO2.
2.2. Phương pháp nghiên cứu:
- Thiết kế nghiên cứu: Thử nghiệm lâm sàng không đối chứng và nghiên cứu thực nghiệm.
- Khám lâm sàng, hỏi bệnh, thu thập các thông tin cần thiết liên quan vấn đề nghiên cứu.
-Thu thập mẫu máu toàn phần và lam máu của bệnh nhân trước điều trị (D0) và sau điều trị 3 ngày (D3) với phát đồ DHA-PPQ để xác định tỷ lệ chậm sạch KSTSR sau điều trị bằng soi kính hiển vi và Real time PCR và thử nghiệm ex vivo.
- Soi kính hiển vi: Lam máu được nhuộm Giemsa và soi KHV xác định số lượng KSTSR theo công thức tính số lượng KSTSR trên giọt dày của WHO (1991).
- Real time PCR: Mẫu máu toàn phần của bệnh nhân thu thập ngày D0 và D3 được tách chiết DNA và chạy Real time PCR với đoạn mồi đặc hiệu của P.falciparum (primer Forward 5’ -
ATTGCTTTTGAGAGGTTTTGTTACTTT - 3’, primer Reverse 5’-
GCTGTAGTATTCAAACACAATGAACTCAA - 3’) xác định mật độ KSTSR ngày D0 và D3.
- Thử nghiệm Ex vivo:
Chuẩn bị thuốc thử: Nồng độ khác nhau của thuốc Syk inhibitor (10 µM, 5 µM, 2.5 µM, 1.25 µM, 0.625 µM, 0.312 µM, 0.15 µM) được làm khô trong 7 giếng của đĩa elisa 24 giếng [6] và 1 giếng trống không gắn thuốc.
Chuẩn bị hồng cầu nhiễm KST: Hồng cầu nhiễm P. falciparum của tất cả bệnh nhân thu thập được rửa 3 lần với RPMI 1640 (Sigma, USA) ủ vớivới môi trường nuôi cấy (RPMI 1640, 2mM glutamine, 10% huyết thanh, 20 mM HEPES (pH 7.6), 10mM glucose, SAGM 2ml/100ml, 80 mg/ml gentamicin) với hematocrit 2%, cho 1500µl vào mỗi giếng ủ 44-48 giờ, 37°C, 5% CO2. Đánh giá: Phần trăm KSTSR sau 44-48 giờ được xác định bằng phương pháp nhuộm giemsa và Real time PCR. IC50 được xác định bằng phần mềm Icestimator 1.2.
- Thử nghiệm in vitro: Tất cả các bước đã được thử nghiệm tương tự như ex vivo, nhưng sử dụng Plasmodium falciparum đã được nuôi cấy trong phòng thí nghiệm để thử nghiệm thay vì Plasmodium falciparum trong máu của bệnh nhân.
Xử lý số liệu: Theo phương pháp thống kê y sinh học bằng các phần mềm Microsoft Excel 2010 và Icestimator 1.2 software, CFX 96 software.
3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.1. Đặc điểm mẫu nghiên cứu theo giới tính, độ tuổi và tiền sử bệnh Bảng 1: Tỷ lệ mẫu nghiên cứu theo giới tính, độ tuổi và tiền sử bệnh
Theo bảng 1 có 32/84(38.1%) bệnh nhân duới 15 tuổi, 52(61.9%) bệnh nhân từ 15 tuổi trở lên, tỷ lệ nam giới cao hơn nữ giới với 51 nam (60.7%) so với 33 nữ (39.3%). Bệnh nhân có tiền sử bệnh sốt rét là 21 người (25%).
3.2. Tỷ lệ chậm sạch ký sinh trùng trong máu (DPC) sau 3 ngày điều trị DHA-PPQ xác định bằng kỹ thuật soi kính hiển vi
Trước điều trị Sau điều trị Hình 1: Xác định DPC bằng soi kính hiển vi
Số lượng bệnh nhân chậm sạch KSTSR sau điều trị 3 ngày với phác đồ DHA-PPQ xác định bằng kỹ thuật soi kính hiển vi là 22/84 bệnh nhân chiếm tỷ lệ 26,2%
3.3. Tỷ lệ chậm sạch ký sinh trùng trong máu (DPC) sau 3 ngày điều trị DHA-PPQ xác định bằng kỹ thuật Real time PCR
Bảng 2: Tỷ lệ bệnh nhân còn KSTSR ở D3 Hình 2: Mẫu vẫn còn KSTSR ở D3
xác định bằng Real time PCR (n=84). xác định bằng Real time PCR
Số lượng bệnh nhân chậm sạch KSTSR sau điều trị 3 ngày với phác đồ DHA-PPQ là 33/84 chiếm tỷ lệ 39,3% xác định bằng kỹ thuật Real time PCR.
3.4. Kết quả thực nghiệm in vitro:
Syk inhibitors IC50 = 0.32 µM (0.17- 0.49 µM)
Hình 3: Kết quả thử nghiệm in vitro
Thử nghiệm in vitro với nồng độ chất ức chế Syk tương tự trong thử nghiệm ex vivo được nhóm nghiên cứu chúng tôi đã thực hiện ở các phòng nghiên cứu ở Italia và Việt nam. Có một sự gia tăng mạnh mẽ của KSTSR (7%) sau 48 giờ ở giếng không được gắn thuốc điều trị.
Đặc điểm Số lượng Phần trăm (%)
Nhóm tuổi 84 100
< 15 tuổi 32 38,1
>= 15 tuổi 52 61,9
Giới tính 84 100
Nam 51 60,7
Nữ 33 39,3
Tiền sử sốt rét 84 100
Có 21 25
Không 63 75
DPC xác định bằng Real time PCR
Số lượng Tỷ lệ phần trăm (%)
33 39,3
Nhưng ở các giếng gắn chất ức chế Syk 10 mM có sự giảm mạnh mẽ của KSTSR(<1%). Qua các thí nghiệm in vitro, chỉ số trung bình của IC50 là 0,32 mM (0.17- 0.49 mM).
3.5. Kết quả thực nghiệm ex vivo:
3.5.1. IC50 trung bình của thuốc mới (chất ức chế Syk) Bảng 3: Kết quả IC50 của mẫu nghiên cứu
Hình 4: Đĩa elisa sau 44h trong ex vivo
Trong tất cả 6 mẫu thử nghiệm ex vivo với chất ức chế Syk ở nồng độ khác nhau để đo IC50.
Do vấn đề vận chuyển mẫu máu từ Quảng trị đến Huế không thuận lợi nên mẫu máu bệnh nhân thứ 4, 7 bị hỏng. Tuy nhiên với 4 mẫu còn lại, mức trung bình của IC50 thu được là 0,30 mM, tương tự kết quả in vitro của chúng tôi.
3.5.2. Tỷ lệ KSTSR trước - sau điều trị DHA-PPQ 7 ngày xác định bằng Real time PCR Bảng 4: Đáp ứng điều trị DHA-PPQ của 6 bệnh nhân tham gia thực nghiệm ex vivo.
Điều kiện thời tiết bất lợi, chỉ có 3 trong 6 mẫu sau điều trị DHA-PPQ được thu thập sau 7 ngày điều trị với DHA-PPQ cho thấy KST còn lại (<0,01%) trong máu sau 7 ngày điều trị.
4. BÀN LUẬN
4.1. Đặc điểm mẫu nghiên cứu theo giới tính, độ tuổi và tiền sử bệnh
Huyện Hướng Hoá, tỉnh Quảng Trị là vùng dịch tễ sốt rét chủ yếu cho loài P. falciparum.
Theo Trung tâm Y tế dự phòng huyện Hướng Hóa, ở 8 xã biên giới này người bị sốt rét chiếm trên 70% tổng dân số. Về độ tuổi và giới tính của bệnh nhân, kết quả nghiên cứu của chúng tôi cho thấy nhóm bệnh nhân nam giới 15 tuổi trở lên là chủ yếu. Vì dân cư ở đây chủ yếu là dân tộc thiểu số, nam giới trưởng thành (15 tuổi trở lên) là lực lượng lao động chính của gia đình và xã hội,họ thường đi ra ngoài làm việc, trong thời gian thu hoạch mùa màng họ thường ngủ qua đêm trong nương rẩy gần rừng nên họ là nhóm có nguy cơ mắc bệnh cao.
4.2.Tỷ lệ chậm sạch KSTSR trong máu (DPC) sau điều trị 3 ngày với phác đồ DHA-PPQ xác định bằng kỹ thuật soi kính hiển vi (KHV) và Real time PCR
Như các nước khác trong khu vực tiểu vùng Mekong, kháng thuốc điều trị sốt rét ở Việt Nam đã xảy ra với các thuốc trước đây. Nhưng DHA-PPQ đã được triển khai có hiệu quả cho P.
falciparum theo khuyến cáo của WHO, và DHA-PPQ là một phác đồ chống sốt rét có hiệu quả cao trong điều trị bệnh sốt rét P. falciparum và phù hợp để sử dụng trong nhiều vùng dịch tễ sốt rét ở Việt Nam trong đó có tỉnh Quảng Trị.
Mặc dù vậy kết quả nghiên cứu của chúng tôi có tỷ lệ chậm sạch KSTSR ở D3 xác định bằng Real time PCR (39,3%) và soi KHV (26,2%). Kết quả này phù hợp vì Real time PCR là một kỹ thuật có độ nhạy và đặc hiệu cao, Real time PCR tăng độ nhạy phát hiện KSTSR trong máu trong trường hợp ký sinh trùng quá thấp mà KHV không phát hiện được [18]. Nghiên cứu của chúng tôi sử kỹ thuật Real time PCR để so sánh đối chiếu với kết quả KHV đồng thời để đánh giá tỷ lệ KSTSR trong máu ở mức thấp trong thử nghiệm ex vivo. Tuy nhiên, trong
Mẫu KST của Bệnh nhân IC50 ( µM)
1 0.5
3 0.25
4 --?
5 0.31
6 0.15
7 --?
IC50Trung bình 0.30
Bệnh nhân % KSTSR trước điều trị DHA-PPQ
(D0)
% KSTSR sau điều trị DHA-
PPQ (D7)
1 0.1% < 0.01%
3 < 0.1% Không có mẫu
4 Không có mẫu < 0.01%
5 0.1% < 0.01%
6 0.1% Không có mẫu
7 1% Không có mẫu
một số trường hợp KSTSR có thể đã chết hay vỡ ra nhưng vẫn chưa bị các tế bào dọn dẹp thì kết quả Real time PCR vẫn dương tính. Hiện nay KHV vẫn là một phương pháp được sử dụng như một tiêu chuẩn vàng để chẩn đoán sốt rét và kết quả của chúng tôi tỷ lệ chậm sạch KSTSR xác định bằng soi KHV là 26,2% [4; 13; 15; 16]. Dựa vào định nghĩa kháng artemisinin của WHO, nghi ngờ kháng artemisinin khi có 10% bệnh nhân vẫn còn KSTSR trong máu sau 72 giờ (3 ngày) điều trị, như vậy kết quả nghiên cứu của chúng tôi có ý nghĩa trong vấn đề báo nghi ngờ kháng artemisinin xảy ra ở huyện Hướng Hoá, tỉnh Quảng Trị.
Tuy nhiên, vấn đề đặt ra là kháng artemisinin là thật hay không? Và vai trò của các yếu tố góp phần vào sự chậm sạch KST trong máu. Định nghĩa về kháng thuốc của P.falciparum hiện nay vẫn chưa thật sự rõ ràng. Người ta chỉ dựa vào sự sạch KSTSR trong máu sau 72 giờ điều trị nhưng có rất nhiều yếu tố ảnh hưởng đến kết quả này: chức năng lách của bệnh nhân, bệnh của hồng cầu HbE, vai trò của marker K13-propeller…[5][22]. Hơn nữa, có nhiều nghiên cứu gần đây báo cáo vai trò của thuốc phối hợp trong vấn đề làm chậm thời gian sạch KSTSR ở trong máu [8]. Như vậy trong tương lai cần có nhiều hơn các nghiên cứu liên quan khác để góp phần vào việc xác định kháng artemisinin ở Việt Nam cũng như các vùng dịch tễ khác đang báo kháng thuốc trên thế giới.
4.3. Kết quả thử nghiệm ex vivo:
Trong thử nghiệm ex vivo để đo IC50 với nồng độ khác nhau của thuốc mới (chất ức chế Syk), tất cả 6 mẫu có mức trung bình của IC50 thu được là 0.30µM, kết quả này tương tự với kết quả in vitro của chúng tôi. Có 3 trong 6 mẫu máu bệnh nhân tham gia thử nghiệm ex vivo được phân tích sau 7 ngày điều trị với DHA-PPQ để đối chiếu với thuốc mới (chất ức chế Syk) cho thấy ký sinh trùng còn lại trong máu rất thấp (<0,01%). Như vậy, kết quả của chúng tôi bước đầu cho thấy chất ức chế Syk mặc dù đang được sử dụng như thuốc chống viêm trong điều trị viêm khớp dạng thấp và an toàn trong các thử nghiệm lâm sàng liên quan đến hàng trăm bệnh nhân điều trị lâu dài, rất hiệu quả trong việc ức chế chu kỳ nội hồng cầu của các ký sinh trùng sốt rét P. falciparum. Bình thường cấu trúc màng hồng cầu bị biến đổi hình dạng, độ kết dính, độ thẩm thấu…[9; 11; 20; 23]trong quá trình P. falciparum ký sinh, kết quả ký sinh trùng phá vỡ hồng cầu ở pha cuối giai đoạn phân liệt để ra khỏi hồng cầu tiếp tục phát triển[3]. Chất ức chế Syk có khả năng chặn pha đi ra của ký sinh trùng. Vì vậy chúng tôi quyết định đánh giá chất ức chế Syk như là một thuốc điều trị sốt rét. Từ nghiên cứu ban đầu của chúng tôi cho thấy thuốc mới này có khả năng ức chế men Syk kinase nên có thể tiếp tục nghiên cứu để trở thành thuốc mới điều trị bệnh sốt rét theo cơ chế hoàn toàn khác với các thuốc điều trị sốt rét truyền thống. Điều này sẽ góp phần ngăn chặn hiện tượng KSTSR kháng thuốc.
5. KẾT LUẬN
1. Tỷ lệ chậm sạch ký sinh trùng trong máu sau điều trị 3 ngày với phác đồ DHA-PPQ là 26.2% (22/84 mẫu) xác định bằng soi kính hiển vi và 39.3% (33/84 mẫu) xác định bằng Real time PCR. Chất ức chế Syk có IC50 trung bình là 0.30µM. Hiệu quả của thuốc chống sốt rét mới (chất ức chế Syk) trên chủng P.falciparum có hoặc không có sức đề kháng với artemisinin bước đầu có hiệu quả trên các thực nghiệm ex vivo vì trên cùng 6 bệnh nhân thì chất ức chế Syk có hiệu quả và có một tỷ lệ KSTSR còn tồn tại trong máu sau 7 ngày điều trị với phác đồ DHA-PPQ..
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Amaratunga C, M. S., et al. (2013). Slow parasite clearance rates in response to artemether in patients with severe malaria. Lancet Infect Dis; 13: 113-14.
2. Amaratunga C, S. S., et al. (2012). Artemisinin-resistant Plasmodium falciparum in Pursat province, western Cambodia: a parasite clearance rate study. Lancet Infect Dis;
12: 851-58.
3. Antonella Pantaleo, E. F., et al. (2010). Analysis of changes in tyrosine and serine phosphorylation of red cell membrane proteins induced by P. falciparum growth.
Proteomic, 10: 3469-3479.
4. Boonma P, C. P., et al. (2007). Comparison of three molecular methods for the detection and speciation of Plasmodium vivax and Plasmodium falciparum. Malar J, 6:124.
5. Chotivanich K, U. R., et al. (2002). Central role of the spleen in malaria parasite clearance. J Infect Dis 185: 1538-1541.
6. Desjardins RE, C. C., et al. (1979). Quantitative assessment of antimalarial activity in vitro by a semiautomated microdilution technique. Antimicrob Agents Chemother, 16:
710-718.
7. Dondorp AM, N. F., et al. (2009). Artemisinin resistance in Plasmodium falciparum malaria N Engl J Med; 361: 455-67.
8. Eziefula AC, B. T., et al. (2014). Single dose primaquine for clearance of Plasmodium falciparum gametocytes in children with uncomplicated malaria in Uganda: a randomised, controlled, double-blind, dose-ranging trial. Lancet Infect Dis; 14: 130- 39.
9. Glenister, F. K., et al. (2002). Contribution of parasite proteins to alteredmechanical properties of malaria-infected red blood cells. Blood, 99, 106-1063.
10. Hien TT, T.-N. N., et al. (2012). In vivo susceptibility of Plasmodium falciparum to artesunate in Binh Phuoc Province, Vietnam. Malar J; 11: 355.
11. Kalfa, T. A., et al. (2006). Rac GTPases regulate the morphology and deformability of the erythrocyte cytoskeleton. Blood, 108, 3637-3645.
12. Kyaw MP, N. M., et al. (2013). Reduced susceptibility of Plasmodium falciparum to artesunate in southern Myanmar. PLoS One; 8: e57689.
13. Mens P, S. N., et al. (2007). Is molecular biology the best alternative for diagnosis of malaria to microscopy ? A comparison between microscopy, antigen detection and molecular tests in rural Kenya and Urban Tanzania. Trop Med Int Health, 12:238-244.
14. Noedl H, S. Y., et al. (2008). Evidence of artemisinin-resistant malaria in western Cambodia. N Engl J Med; 359: 2619-20.
15. Ohrt C, S. M., et al. (2012). Impact of microscopy error on estimates of protective efficacy in malaria-prevention trials. J Infect Dis, 186:540-546.
16. Perandin F, M. N., et al. (2004). Development of a real- time PCR assay for detection of Plasmodium falciparum, Plasmodium vivax, and Plasmodium ovale for routine clinical diagnosis. J Clin Microbiol, 42:1214-1219.
17. Phyo AP, N. S., et al. (2012). Emergence of artemisinin-resistant malaria on the western border of Thailand: a longitudinal study. Lancet; 379: 1960-66.
18. RS, P. (2001). Current status of malaria and potential for control. Clin Microbiol Rev, 14:208-226.
19. Stepniewska K, A. E., et al. (2010). In vivo parasitological measures of artemisinin susceptibility. J Infect Dis 201: 570-579.
20. Turrini, F., et al. (1992). Phagocytosis of Plasmodium falciparum-infected human red blood cells by human monocytes: involvement of immune and nonimmune determinants and dependence on parasite developmental stage. Blood, 80, 801-808.
21. WHO. (2012). Update on artemisinin resistance, April 2012. Geneva: World Health Organization, 2012. http://www.who.int/entity/malaria/publications/atoz/
arupdate042012.pdf (accessed Oct 25).
22. WHO. (2014). Updated December 2014, Representative Office Viet Nam (http://www.wpro.who.int/vietnam/topics/malaria/factsheet/vi/).
23. Winograd, E., et al. (1989). Characterization of a modified red cell membrane protein expressed on erythrocytes infected with the human malaria parasite Plasmodium falciparum: possible role as a cytoadherent mediating protein. J. Cell. Biol., 108, 23- 30.
