NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG TRUYỀN ĐẶC ĐIỂM ĐỀ KHÁNG KHÁNG SINH CỦA PROBIOTIC SANG
VI KHUẨN KHÁC TRONG ĐIỀU KIỆN IN VITRO
Lê Văn Hoài Trân1, Vũ Thanh Thảo1, Trần Cát Đông1
TÓM TẮT
Đặt vấn đề: Một số chủng probiotic chứa gen kháng kháng sinh trên nhiễm sắc thể, có thể tiềm ẩn nguy cơ truyền gen này sang vi sinh vật khác, đặc biệt là vi sinh vật gây bệnh bằng phương thức chuyển gen theo chiều ngang.
Mục tiêu: Kiểm tra khả năng truyền gen đề kháng kháng sinh từ probiotic sang Bacillus subtilis PY79 in vitro.
Đối tượng và phương pháp: MIC của vi khuẩn probiotic và B. subtilis Y79 được xác định bằng phương pháp pha loãng kháng sinh trong thạch. ADN nhiễm sắc thể của probiotic được chiết và biến nạp vào B. subtilis PY79 bằng hóa biến nạp. Thể biến nạp được khảo sát hình thái khuẩn lạc, nhuộm Gram, xác định MIC và kiểu gen bằng rep-PCR.
Kết quả: Khi chuyển gen của vi khuẩn probiotic vào B. subtilis Y79 thu được 12 thể biến nạp có MIC với chloramphenicol cao gấp 4-32 lần so với MIC của B. subtilis PY79; 10 thể biến nạp có MIC với tetracyclin cao hơn MIC của B. subtilis PY79. Trong số 22 thể biến nạp, 4 chủng có kiểu gen tương đồng khoảng 80% với B.
subtilis PY79, không có chủng nào có kiểu gen tương đồng 100% với B. subtilis PY79, chứng tỏ kiểu gen của các thể biến nạp đã thay đổi.
Kết luận: Quá trình chuyển gen đề kháng kháng sinh theo chiều ngang có thể xảy ra từ probiotic sang B.
subtilis PY79 qua biến nạp in vitro.
Từ khóa: Đề kháng kháng sinh, Bacillus, probiotic, biến nạp, chuyển gen theo chiều ngang
ABSTRACT
STUDY ON TRANSFER OF ANTIBIOTIC-RESISTANCE
CHARACTERISTIC FROM PROBIOTICS TO OTHER BACTERIAL SPECIES IN VITRO
Le Van Hoai Tran, Vu Thanh Thao, Tran Cat Dong
* Ho Chi Minh City Journal of Medicine * Vol. 25 - No. 4 - 2021: 77 - 83 Background: Some probiotic strains possess intrinsic antibiotic-resistance genes have potential risk of spreading these genes to other bacterial species, especially in case of pathogenic bacteria by horizontal gene transfer.
Objectives: Investigate the possibility of transformation antibiotic-resistance genes from probiotics to Bacillus subtilis PY79 in vitro.
Methods: Minimal inhibitory concentration (MIC) of probiotics and B. subtilis PY79 were determined.
using agar dilution method. Genomic DNA of probiotic strains was extracted and transformed to B. subtilis PY79 via chemical transformation. Transformants were characterized colony morphology, Gram stain, determined MIC and genotype by rep-PCR.
Results: Transfer of probiotic’s D A to B. subtilis PY79 yield 12 transformants that showed MIC value for chloramphenicol 4 to 32 times higher than the value of B. subtilis PY79, 10 transformants had MIC value for tetracyclin higher than B. subtilis PY79. Among 22 transformants, there were 4 strains had approximately 80%
genotype similarity to B. subtilis PY79, none of these strains showed 100% genotype similarity to B. subtilis
1Khoa Dược, Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh
Tác giả liên lạc: DS. Lê Văn Hoài Trân ĐT: 0387861271 Email: [email protected]
PY79, indicated that genotype of transformants have changed.
Conclusions: Horizontal transfer of antibiotic-resistance genes is possible from probiotic strains to B.
subtilis PY79 through in vitro transformation.
Keywords: antibiotic-resistance, Bacillus, probiotic, transformation, horizontal gene transfer
ĐẶT VẤN ĐỀ
Probiotic và sản phẩm có chứa probiotic như men vi sinh hỗ trợ tiêu hóa hay sản phẩm lên men từ sữa... được chứng minh có nhiều tác động có lợi cho người sử dụng như tái cân bằng hệ vi sinh vật đường ruột, kích thích hệ thống miễn dịch của cơ thể(1). Tác động có lợi của probiotic đối với vật chủ thông qua nhiều cơ chế khác nhau như sự cạnh tranh bám dính lên đường tiêu hóa, điều hòa miễn dịch và khả năng tiết ra các chất kháng khuẩn kìm hãm sự phát triển của các vi sinh vật khác(2,3). Nhóm vi khuẩn lactic (Lactic Acid Bacteria-LAB) biểu hiện nhiều loại protein màng ngoài với vai trò trung gianh bám dính lên chất nhầy và tế bào biểu mô ruột(4). Tương tác giữa vi khuẩn và tế bào biểu mô ruột làm tăng khả năng bám dính của chúng đồng thời cũng tăng thải loại các vi khuẩn gây bệnh ra khỏi đường tiêu hóa(5). Một số vi khuẩn thuộc chi Lactobacillus trong hệ tiêu hóa người tiết bacteriocin như lactacin B từ L. acidophilus hoặc nisin từ L. casein có khả năng kìm hãm sự phát triển của các vi khuẩn khác trong cùng môi trường sống(6).
Ngoài các cơ chế nêu trên, khả năng đề kháng kháng sinh là một lợi thế nhằm tăng khả năng cạnh tranh của probiotic với vi khuẩn trong đường ruột, nhất là trong trường hợp sử dụng chung probiotic với kháng sinh trong điều trị một số bệnh lý(7). Tuy nhiên, probiotic là sản phẩm có thể dùng hằng ngày nên hệ tiêu hóa trở thành nơi tích lũy gen và probiotic đề kháng kháng sinh(8). Thông qua con đường tiếp hợp hoặc biến nạp, các gen này có thể được truyền cho vi khuẩn khác trong hệ vi sinh vật đường ruột(8). Nhiều nghiên cứu in vitro và in vivo chứng minh gen đề kháng kháng sinh từ plasmid của probiotic có khả năng truyền cho vi khuẩn khác thông qua tiếp hợp(9-11). Tuy nhiên chưa có nghiên cứu nào báo cáo về sự truyền
gen đề kháng kháng sinh có nguồn gốc từ ADN nhiễm sắc thể của probiotic qua con đường biến nạp hoặc tiếp hợp. Jose và cộng sự cho rằng các gen này không thể truyền theo chiều ngang cho các loài khác(7), Bozdogan và cộng sự(12) không thực hiện thành công việc chuyển gen kháng macrolid trên ADN của Bacillus clausii sang Enterococcus faecalis JH2-2, E. faecium HM1070 và B. subtilis UCN19 trên in vitro.
Nghiên cứu này nhằm kiểm tra rằng đặc tính đề kháng kháng sinh từ probiotic Bacillus clausii và Enterococcus faecalis Có khả năng truyền cho B.
subtilis PY79 thông qua biến nạp ở điều kiện in vitro hay không.
ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Vật liệuChủng vi sinh vật
Bacillus subtilis PY79 (Phòng thí nghiệm Vi Sinh Công Nghệ Dược, Khoa Dược, ĐH Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh-PTN); Bacillus clausii, Enterococcus faecalis phân lập từ chế phẩm probiotic chứa chủng vi khuẩn tương ứng trên thị trường.
Hóa chất, môi trường
TSA (HiMedia-Ấn Độ), TSB (HiMedia-Ấn Độ), MHA (HiMedia-Ấn Độ); Ampicillin (Sigma Aldrich), Chloramphenicol (Sigma Aldrich), Amikacin (Sigma Aldrich), Gentamycin (Sigma Aldrich), Tetracyclin (Sigma Aldrich), Erythromycin (Sigma Aldrich); Oxacillin (Fluka), Levofloxacin (Fluka). Kit định danh vi khuẩn API 20 E (bioMérieux-Pháp)
Kit chiết ADN
Wizard ® Genomic DNA Purification Kit (Promega).
Mồi cho PCR
MBO REP1 (Qiagen) (5’-
CCGCCGTTGCCGCCGTTGCCGCCG-3’).
Định danh vi khuẩn probiotic
Cấy ria hai chủng vi khuẩn probiotic trên môi trường TSA để được khuẩn lạc đơn. Định danh vi khuẩn E. feacalis bằng kit API 20E kết hợp với phản ứng lên men lactose và lên men pyruvate. Probiotic B. clausii được định danh bằng giải trình tự 16S rADN.
Xác định MIC của kháng sinh
MIC của probiotic và B. subtilis PY79 được xác định theo hướng dẫn của CLSI về thử nghiệm nhạy cảm kháng sinh cho các vi khuẩn hiếu khí bằng phương pháp pha loãng(13).
Các kháng sinh được chọn là đại diện cho nhựng nhóm kháng sinh đang sử dụng trong lâm sàng: ampicillin, oxacillin (nhóm beta lactam);
amikacin, gentamycin (nhóm aminoglycosid);
chloramphenicol (nhóm phenicol); erythromycin (nhóm macrolid); levofloxacin (nhóm quinolon);
tetracyclin (nhóm cyclin).
Chuẩn bị môi trường
Pha stock từng loại kháng sinh với nồng độ gấp 20 lần nồng độ cao nhất trong Bảng 1. Từ dung dịch stock (dung dịch số 0), pha loãng theo cấp số 2 để dược dãy 8 dung dịch (1-8) có nồng độ kháng sinh gấp 10 lần nồng độ thử nghiệm.
Pha loãng dung dịch 1-8 trong môi trường MHA với tỉ lệ 1:9 để đạt tới nồng độ thử nghiệm. Dãy nồng độ các kháng sinh được thể hiện trong Bảng 1.
Chuẩn bị huyền dịch vi khuẩn
Pha loãng trực tiếp vi khuẩn trong nước muối sinh lí, chỉnh độ đục của huyền dịch vi khuẩn về 0,5 McFarland (giá trị OD600 của huyền dịch nằm trong khoảng 0,08-0,1), sau đó pha loãng 10 lần bằng nước muối sinh lý. Huyền dịch sau khi pha loãng có mật độ vi khuẩn khoảng 107 CFU/ml(13).
Chấm khoảng 2 µl huyền dịch vi khuẩn lên môi trường MHA chứa kháng sinh, theo dãy nồng độ trong Bảng 1. Ủ môi trường ở 35± 2 °C.
Đọc kết quả sau 16 – 20 giờ. MIC là giá trị thấp nhất của nồng độ kháng sinh bổ sung vào môi trường mà tại đó vi khuẩn không phát triển
được. Từ các giá trị MIC, xác định kháng sinh làm môi trường chọn lọc cho thí nghiệm.
Bảng 1. Nồng độ các kháng sinh dùng trong thử nghiệm
STT Tên kháng sinh Khoảng nồng độ (µg/ml) 1 Ampicillin (Amp) 0,016 – 4,0
2 Oxacillin (Oxa) 0,03 – 8
3 Amikacin (Ami) 0,5 – 128
4 Gentamycin (Gen) 0,25 – 64 5 Chloramphenicol (Chl) 0,25 – 64 6 Erythromycin (Ery) 0,06 – 16 7 Levofloxacin (Lev) 0,06 – 16 8 Tetracyclin (Tet) 0,125 – 32
Biến nạp ADN nhiễm sắc thể của vi khuẩn probiotic vào B. subtilis PY79 khả nạp
Chiết ADN của probiotic
Vi khuẩn probiotic được tăng sinh trong môi trường TSB. Sau 16 giờ,thu dịch nuôi cấy và chiết ADN bằng Wizard® Genomic DNA Purification Kit (Promega).
Xác định nồng độ háng sinh cho môi trường chọn lọc
Tế bào B.subtilis PY79 khả nạp được chuẩn bị qua hai bước trong môi trường dinh dưỡng tối thiểu(14). Trải 100 µL tế bào khả nạp lên môi trường MHA có bổ sung kháng sinh với nồng độ tăng dần từ MIC của B. subtlis PY79, ủ trong 16- 20 giờ ở nhiệt độ 35 ± 2 °C. Chọn nồng độ kháng sinh bổ sung mà tại nồng độ đó tế bào khả nạp không mọc được.
Biến nạp
500 µl tế bào khả nạp B. subtilis PY79 được cho vào eppendorf 1,5 ml; thêm vào 20 µg ADN probiotic; lắc eppendorf 200 vòng/phút trong 30 phút ở 37 °C; trải 100 µl huyền dịch vi khuẩn lên môi trường MHA có chứa nồng độ kháng sinh đã được xác trước đó.
Kiểm tra kiểu hình, tính nhạy cảm kháng sinh và kiểu gen của thể biến nạp
Kiểm tra kiểu hình
Cấy ria các thể biến nạp lên môi trường TSA, sau 24 giờ quan sát hình dạng, kích thước, màu sắc của khuẩn lạc. Nhuộm Gram và quan sát thể biến nạp qua kính hiển vi với độ phóng
đại 1000X, chụp lại mẫu bằng phần mềm ToupView 2.0. Ghi nhận các đặc điểm về; kích thước, cách sắp xếp của tế bào vi khuẩn trên mẫu nhuộm Gram.
Tính nhạy cảm kháng sinh
Thể biến nạp được xác định MIC. So sánh khả năng đề kháng kháng sinh của thể biến nạp với chủng probiotic và B. subtilis PY79.
Kiểm tra sự thay đổi của kiểu gen
ADN của thể biến nạp, B. subtilis PY79 được chiết bằng Wizard® Genomic DNA Purification Kit (Promega). Thực hiện phản ứng rep-PCR (50 µl) với mồi MBO REP1 (5’- CCGCCGTTGCCGCCGTTGCCGCCG-3’)(15). Chương trình nhiệt cho phản ứng PCR như sau: biến tính ADN ở 94 °C trong 5 phút, thực hiện 32 chu kỳ với 94 °C trong 1 phút, 52 °C trong 1 phút, 72 °C trong 4 phút, kết thúc 72 °C trong 5 phút. Điện di sản phẩm rep-PCR trên gel polyacrylamide 5%. So sánh các kết quả điện di bằng phần mềm Bionumeric V3.00.
KẾT QUẢ
Định danh vi khuẩn probiotic
Dựa vào kết quả phản ứng sinh hóa theo kit API 20 E, phản ứng lên men lactose dương tính, phản ứng lên men pyruvate dương tính, xác định probiotic là E. faecalis(16).
Kết quả giải trình tự 16S rADN cho kết quả probiotic là B. clausii.
Xác định MIC của kháng sinh
MIC và biện giải của các vi khuẩn thử nghiệm được thể hiện trong Bảng 2.
Giá trị biện giải cho chi Bacillus được lấy từ tài liệu CLSI M45-A, 2006(17) và giá trị biện giải cho chi Enterococcus lấy từ CLSI M100-S23, 2013(18).
Kháng sinh được chọn bổ sung vào môi trường chọn lọc phải thỏa tiêu chí (1) B. subtilis PY79 nhạy cảm và (2) probiotic đề kháng với kháng sinh được chọn. Từ Bảng 2, oxacillin, chloramphenicol và erythromycin được dùng chọn lọc thể biến nạp từ thí nghiệm chuyển gen B. clausii; amikacin, gentamycin, tetracyclin dùng chọn lọc thể biến nạp trong chuyển gen E. faecalis.
Bảng 2. Kết quả MIC của các chủng vi khuẩn với kháng sinh thử nghiệm
Chủng vi khuẩn MIC (µg/ml)
Amp Oxa Ami Gen Chl Ery Lev Tet
B. subtilis PY79 0,12S 0,25S,a 0,5S 0,06S 2S 0,06S 0,25S 2S
B. clausii 0,5S 8R,a 0,25S 0,25S 64R 32R 0,25S 1S
E. faecalis 0,5S,a - 64R,b 16R,b 8S 4S 1S 32R
Chú thích: R: Kháng; I: Trung gian; S: Nhạy; a: Không có giá trị biện giải cho chi Bacillus, dựa theo giá trị biện giải cho S. aureus; b Biện giải theo chi Bacillus; “-“ không thực hiện
Biến nạp ADN của vi khuẩn probiotic vào tế bào khả nạp
Xác định nồng độ háng sinh cho môi trường chọn lọc
Trải 100 µl tế bào khả nạp lên môi trường MHA bổ sung kháng sinh đã được chọn với nồng độ tăng dần từ MIC của B. subtilis PY79.
Sau khảo sát, nồng độ kháng sinh bổ sung vào môi trường được thể hiện ở Bảng 3.
Tại các nồng độ kháng sinh tương ứng trong bảng trên, khi trải 100 µl tế bảo khả nạp trên môi
trường và ủ ở nhiệt độ 35 ± 2 °C. Sau 20 giờ, không có khuẩn lạc nào xuất hiện.
Bảng 3. Nồng độ kháng sinh bổ sung vào môi trường chọn lọc
Tên kháng sinh Nồng độ bổ sung (µg/ml)
Oxacillin 1
Amikacin 25
Gentamycin 7,5
Chloramphenicol 5
Erythromycin 5
Tetracyclin 7,5
Biến nạp ADN vi khuẩn probiotic
Thí nghiệm thu được 12 thể biến nạp trên môi trường có chứa kháng sinh chloramphenicol và 10 thể biến nạp trên môi trường có tetracyclin.
Trên các môi trường có kháng sinh khác không thấy xuất hiện thể biến nạp.
Kiểm tra các đặc điểm của thể biến nạp Kiểm tra sự thay đổi về kiểu hình
Đối với 12 chủng C1-C12, 4 chủng C8, C10- C12 cho hình thái khóm giống với B. subtilis PY79.
Trong số 10 chủng T1-T10, 7 chủng T3-T6, T8-T10 có hình thái khuẩn lạc tương tự Những thể biến nạp còn lại có hình thái thay đổi so với B. subtilis PY79. Hình thái khuẩn lạc có sự khác biệt rõ rệt giữa chủng T1, C9 khi so sánh với B. subtilis PY79 (Hình 1). Ở chủng T1, kích thước đa số khuẩn lạc dưới 1 mm nhỏ hơn nhiều so với B. subtilis PY79.
Đối với chủng C9, kích thước khóm nhỏ hơn và hình dạng khóm là đa giác so với khóm tròn của B. subtilis PY79. Đặc điểm khuẩn lạc của thể biến nạp được mô tả trong Bảng 4.
Hình 1. Hình thái khuẩn lạc B. subttilis PY79 (PY79) và một số thể biến nạp
Bảng 4. So sánh hình thái khuẩn lạc của các thể biến nạp với B. subtilis PY79
Chủng Hình thái khuẩn lạc
B. sutilis PY79 Dẹt bằng, bìa tròn, đường kính 3-4 mm, màu trắng ngà
C1, C2, C3, C4, C5, C6, C7
Lồi, bìa tròn, đường kính 3-4 mm màu trắng ngà
C9 Dẹt bằng, bìa đa giác, đường kính 1-3 mm, màu trắng ngà
C8, C10, C11, C12 Dẹt bằng, bìa tròn, đường kính 3-5 mm, màu trắng ngà
T1, T2, T7 Lồi, bìa tròn, đường kính 0,5-1 mm, màu trắng ngà.
T3, T4, T5, T6, T8, T9, T10,
Dẹt bằng, bìa tròn, đường kính 3-5 mm, màu trắng ngà
Nhuộm Gram và quan sát thể biến nạp trên kính hiển vi cho thấy tất cả chúng đều là trực khuẩn Gram dương, kích thước 2,4-4×0,8 µm, sắp xếp riêng lẻ hoặc thành chuỗi (Hình 2).
Không có sự khác biệt về vi thể giữa thể biến nạp và B. subtilis PY79.
Hình 2. Hình ảnh nhuộm Gram B. subtilis PY79 (PY79) và một số thể biến nạp
Tính nhạy cảm kháng sinh
Chủng C1 – C12, T1 – T10 được kiểm tra tính nhạy cảm với kháng sinh tương ứng là chloramphenicol và tetracyclin (Bảng 5). Giá trị MIC của chủng C1-C12 đối với chloramphenicol và chủng T1-T10 đối với tetracyclin của đều cao hơn so với B. subtilis PY79.
Với kháng sinh chloramphenicol, 12 thể biến nạp có giá trị MIC ở mức 16 – 64 µg/ml, trong đó có 5 chủng kháng ở mức trung gian (MIC = 16 µg/ml) và 7 chủng đề kháng (MIC ≥ 32 µg/ml). Chủng C9 có mức đề kháng ngang với probiotic B. clausii (MIC =64 µg/ml). Đối với tetracyclin, 10 thể biến nạp có giá trị MIC ở mức 16 - 64 µg/ml, 7 chủng kháng ở mức trung gian (MIC = 16 µg/ml) và 3 chủng đề kháng (MIC ≥ 32 µg/ml). Trong đó chủng T4 có mức kháng cao hơn so với probiotic E. faecalis (MIC = 32 µg/ml).
Kiểm tra sự thay đổi về kiểu gen
Theo cây phả hệ (Hình 3) của chủng C1 – C12, có hai kiểu gen chính thể hiện sự tương đồng trên 65% là A (với 7 chủng: C1, C2, C3, C5, C6, C7, C9) và B (5 chủng: C8, C10, C11,C12, B. subtilis PY79). Kết quả này còn cho thấy có sự tương quan giữa kiểu gen và kiểu hình: thể biến nạp có kiểu gen A cho khuẩn lạc lồi và kháng
chloramphenicol, trong khi đó thể biến nạp có kiểu gen B cho khuẩn lạc dẹt bằng và đề kháng ở mức trung gian với chloramphenicol.
Đối với chủng T1 – T10 (Hình 4), có sự tương đồng cao về kiểu gen của các chủng này với nhau, thể hiện ở phần trăm tương đồng của 2 nhóm chính C và D đều là 80%. Tuy nhiên, không thấy được sự tương quan giữa kiểu gen và kiểu hình của các thể biến nạp. Chủng T7 có kiểu gen tương đồng cao với T3, T4, T6, T8 nhưng hình thái khuẩn lạc có sự khác biệt; hay chủng T2 có kiểu gen gần nhất -tương đồng khoảng 86%- với B. subtilis PY79 nhưng kích thước khuẩn lạc lại có sự khác biệt nhiều (Bảng 4).
Xét trên hai cây phả hệ, không có thể biến nạp nào có kiểu gen tương đồng 100%
với B. subtilis PY79, chứng tỏ kiểu gen của thể biến nạp đều có sự khác biệt khi so sánh với B.
subtilis PY79 ban đầu.
Bảng 5. MIC của các thể biến nạp
Thể biến nạp Giá trị MIC (µg/ml) Chloramphenicol Tetracyclin C1, C2, C3, C4, C5,
C6, C7 32R -
C8, C10, C11, C12 16I -
C9 64R -
T1, T2, T5, T6, T7,
T9, T10 - 16I
T3, T8 - 32R
T4 - 64R
C, T: lần lượt là ký hiệu cho các thể biến nạp thu được trên môi trường chứa các kháng sinh tương ứng là chloramphenicol và tetracyclin; R, I, lần lượt ký hiệu cho “Kháng”, “Trung gian”, “-“ không thực hiện.
Hình 3. Cây phả hệ của thể biến nạp C1 – C12, B. subtilis PY79 (PY79) và B. clausii (A, B là kí hiệu các kiểu gen; Bên trái: cây phân loài; Bên phải: kết quả
điện di đã được xử lý b i phần mềm Bionumeric)
Hình 4. Cây phả hệ của thể biến nạp T1 – T10, B.
subtilis PY79 (PY79).(C, D là ký hiệu các kiểu gen Bên trái: cây phân loài; Bên phải: kết quả điện di đã
được xử lý b i phần mềm Bionumeric)
BÀN LUẬN
Đa số những nghiên cứu được công bố trước đây xem xét khả năng truyền gen kháng kháng sinh nằm trên plasmid của probiotic qua con đường tiếp hợp(9,10), hoặc những đoạn nhiễm sắc thể mang gen đề kháng sang loài khác(12,19). Khác với các công bố trên, nghiên cứu này xem xét khả năng biến nạp của tất các phân mảnh của bộ gen nhiễm sắc thể của probiotic sang cho một vi khuẩn khác là B. subtilis PY79. Trong điều kiện này, quá trình biến nạp xảy ra hoàn toàn ngẫu nhiên và thực tế đã thu được các thể biến nạp trên môi trường chọn lọc.
Từ kết quả MIC và các công bố trước đây(19-22), có thể dự đoán rằng ADN nhiễm sắc thể của probiotic B. clausii và E. faecalis trong nghiên cứu này mang gen kháng kháng sinh. Tuy nhiên với kích thước của đoạn gen mã hóa cho chloramphenicol acetyltransferase khoảng 2,3 kb(19) và gen kháng tetracyclin có kích thước khoảng 2 kb 83(20,21,23), khả năng biến nạp được vào B. subtilis PY79 là rất thấp(24,25). Do đó có thể dự đoán nếu các gen này hiện diện ở probiotic sẽ được chuyển vào B. subtilis PY79 qua biến nạp cùng với đoạn gen có kích thước lớn hơn. Vì vậy, ngoài khả năng gia tăng sự đề kháng với kháng sinh, thể biến nạp tạo thành còn có kiểu gen thay đổi khi so sánh với B. subtilis PY79.
Trong nghiên cứu này không xác nhận sự hiện diện của các gen đề kháng kháng sinh của
probiotic bằng các phương pháp sinh học phân tử mà dựa vào sự đề kháng của probiotic đối với kháng sinh và nhiều nghiên cứu của các tác giả khác đã công bố trước đó. Vì vậy, cần xác nhận lại gen kháng kháng sinh có trong nhiễm sắc thể của probiotic và kiểm tra sự hiện diện của gen này trong thể biến nạp bằng giải trình tự gen để có thể khẳng định quá trình biến nạp đã xảy ra trong điều kiện thử nghiệm.
KẾT LUẬN
Từ kết quả thử nghiệm tính nhạy cảm kháng sinh và so sánh kiểu gen của thể biến nạp so với chủng B. subtilis PY79, nghiên cứu cho thấy rằng đặc điểm đề kháng kháng sinh của probiotic có thể truyền sang B. subtilis PY79 bằng con đường biến nạp trong điều kiện phòng thí nghiệm.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Nguyễn Văn Thanh, Trần Cát Đông (2008). Công nghệ lên men.
In: Công Nghệ Sinh Học Dược, pp.73-88. Nhà Xuất Bản Giáo dục Việt Nam, Hà Nội.
2. Schiffrin EJ, Blum S (2002). Interactions between the microbiota and the intestinal mucosa. Eur J Clin Nutr, 56(S3):S60-64.
3. Keersmaecker SC de, Verhoeven TL, Desair J, et al (2006). Strong antimicrobial activity of Lactobacillus rhamnosus GG against Salmonella typhimurium is due to accumulation of lactic acid.
FEMS Microbiol Lett, 259(1):89-96.
4. Tassell ML van, Miller MJ (2011). Lactobacillus adhesion to mucus. Nutrients, 3(5):613-636.
5. Ouwehand AC, Salminen S, Tolkko S, et al (2002). Resected human colonic tissue: new model for characterizing adhesion of lactic acid bacteria. Clin Diagn Lab Immunol, 9(1):184-186.
6. Nielsen DS, Cho GS, Hanak A, et al (2010). The effect of bacteriocin-producing Lactobacillus plantarum strains on the intracellular pH of sessile and planktonic Listeria monocytogenes single cells. Int J Food Microbiol, 141(S1):S53-S59.
7. Jose NM, Bunt CR, Hussain MA (2015). Implications of antibiotic resistance in probiotics. Food Reviews International, 31(1):52-62.
8. Gueimonde M, Sánchez B, G de Los Reyes-Gavilán C, et al (2013). Antibiotic resistance in probiotic bacteria. Frontiers in Microbiology, 4:202-202.
9. Gevers D, Huys G, Swings J (2003). In vitro conjugal transfer of tetracycline resistance from Lactobacillus isolates to other gram- positive bacteria. FEMS Microbiol Lett, 225(1):125-130.
10. Jacobsen L, Wilcks A, Hammer K, et al (2007). Horizontal transfer of tet(M) and erm(B) resistance plasmids from food strains of Lactobacillus plantarum to Enterococcus faecalis JH2-2 in
the gastrointestinal tract of gnotobiotic rats. FEMS Microbiol Ecol, 59(1):158-166.
11. Morelli L, Sarra PG, Bottazzi V (1988). In vivo transfer of pAM beta 1 from Lactobacillus reuteri to Enterococcus faecalis. J Appl Bacteriol, 65(5):371-375.
12. Bozdogan B, Galopin S, Leclercq R (2004). Characterization of a new erm-related macrolide resistance gene present in probiotic strains of Bacillus clausii. Appl Environ Microbiol, 70(1):280-284.
13. Clinical and Laboratory Standards Institute (2012). Methods for dilution antimicrobial susceptibility tests for bacteria that grow aerobically. 9th ed. Approved Standard, USA.
14. Cutting SM, Horn V (1990). Molecular biological methods for Bacillus. Wiley, Chichester.
15. Rusenova N, Parvanov P, Stanilova S (2013). Molecular typing of Paenibacillus larvae strains isolated from Bulgarian apiaries based on repetitive element polymerase chain reaction (Rep-PCR). Curr Microbiol, 66(6):573-7.
16. Cowen S (1993). Cowan and Steel's manual for the identification of medical bacteria. 3rd ed, pp.61-63. Cambridge University Press, USA.
17. Hindler JA (2016). Methods for antimicrobial dilution and disk susceptibility testing of infrequently isolated or fastidious bacteria: Approved guideline. 3rd ed. Clinical and Laboratory Standards Institute, USA.
18. Institute CaLS (2013). Performance standards for antimicrobial susceptibility testing. V33(1), 23rd ed. Clinical and Laboratory Standards Institute, USA.
19. Galopin S, Cattoir V, Leclercq R (2009). A chromosomal chloramphenicol acetyltransferase determinant from a probiotic strain of Bacillus clausii. FEMS Microbiol Lett, 296(2):185-189.
20. Ayeni FA, Odumosu BT, Oluseyi AE, et al (2016). Identification and prevalence of tetracycline resistance in enterococci isolated from poultry in Ilishan, Ogun State, Nigeria. J Pharm Bioallied Sci, 8(1):69-73.
21. Tian Y, Yu H, Wang Z (2019). Distribution of acquired antibiotic resistance genes among Enterococcus spp. isolated from a hospital in Baotou, China. BMC Res Notes, 12(1):27.
22. Rice LB (1998). Tn916 family conjugative transposons and dissemination of antimicrobial resistance determinants.
Antimicrob Agents Chemother, 42(8):1871-1877.
23. Nishimoto Y, Kobayashi N, Alam MM, et al (2005). Analysis of the prevalence of tetracycline resistance genes in clinical isolates of Enterococcus faecalis and Enterococcus faecium in a Japanese hospital. Microb Drug Resist, 11(2):146-153.
24. Lorenz MG, Wackernagel W (1994). Bacterial gene transfer by natural genetic transformation in the environment. Microbiol Rev, 58(3):563-602.
25. Morrison DA, Guild WR (1972). Transformation and deoxyribonucleic acid size: extent of degradation on entry varies with size of donor. J Bacteriol, 112(3):1157-1168.
Ngày nhận bài báo: 15/12/2020
Ngày phản biện nhận xét bài báo: 08/03/2021 gày bài báo được đăng: 20/08/2021