Preliminary data of the biodiversity in the area

(1)

1

Original Article

Development of Real-time PCR Kit for Detection and Quantitation of Six Common Mutations A3243G,

G3380A, A8344G, T8993G, T8993C, G11778A of Human Mitochondrial Genome

Nguyen Thi Hong Loan

¹

, Phung Bao Khanh

¹

, Le Ngoc Anh

¹

, Cao Vu Hung

²

, Pham Van Anh

²

, Phan Tuan Nghia

^1,*

1VNU University of Science, Hanoi, 334 Nguyen Trai, Thanh Xuan, Hanoi, Vietnam

2Vietnam National Children' Hospital, 18/879 La Thanh, Dong Da, Hanoi, Vietnam Received 01 August 2021

Revised 11 September 2021; Accepted 13 Septerber 2021

Abstract: A procedure for the production of a real-time PCR kit for detection and quantitation of six common mitochondrial genome mutations including A3243G, G3380A, A8344G, T8993G, T8993C, G11778A using fluorescent locked nucleic acid (LNA) Taqman probes was reported. The procedure consists of designing specific primers and LNA probes, selection of master mixture components, and real-time PCR thermal conditions. The produced kit had a specificity of 100%

and sensitivity ≥ 1% and remained fully active after 7 days of storage at 25 ôC or 20 days at 4 ôC or 6 months at –20 ôC. The kit was used to analyze A3243G, G3380A, A8344G, T8993G, T8993C, G11778A mutations from 69 patients tentatively diagnosed with mitochondrial diseases and 3 cases of A3243G carriers (4.34%) was found. In these cases, the A3243G mutation was heteroplasmic, maternally inherited, and the heteroplasmy level was shown to be related to the symptom expression.

Keywords: A3243G, G3380A, A8344G, T8993G, T8993C, G11778A, real-time PCR.

D^*

_______

* Corresponding author.

E-mail address: [email protected] https://doi.org/10.25073/2588-1140/vnunst.5285

(2)

Tạo bộ kit phát hiện và định lượng 6 đột biến gen ty thể A3243G, G3380A, A8344G, T8993G, T8993C

và G11778A của người bằng real-time PCR

Nguyễn Thị Hồng Loan

¹

, Phùng Bảo Khánh

¹

, Lê Ngọc Anh

¹

, Cao Vũ Hùng

²

, Phạm Vân Anh

²

, Phan Tuấn Nghĩa

^1,*

1Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội, 334 Nguyễn Trãi, Thanh Xuân, Hà Nội, Việt Nam

2Bệnh viện Nhi Trung ương, 18/879 La Thành, Đống Đa, Hà Nội, Việt Nam Nhận ngày 01 tháng 8 năm 2021

Chỉnh sửa ngày 11 tháng 9 năm 2021; Chấp nhận đăng ngày 13 tháng 9 năm 2021

Tóm tắt: Trong nghiên cứu này, quy trình sản xuất bộ kit phát hiện và định lượng 6 đột biến gen ty thể của người phổ biến là A3243G, G3380A, A8344G, T8993G, T8993C, G11778A bằng real-time PCR sử dụng mẫu dò huỳnh quang dạng cầu khóa axit nucleic (LNA) được thiết lập. Quy trình bao gồm việc thiết kế các cặp mồi đặc hiệu, các mẫu dò dạng huỳnh quang cầu khóa LNA, lựa chọn dung dịch master mix và chu kỳ nhiệt. Bộ kit có độ đặc hiệu là 100% và độ nhạy ≥ 1%, khi được bảo quản trong 7 ngày ở 25 ôC hoặc ở 4 ôC trong 20 ngày và 6 tháng ở –20 ôC vẫn cho kết quả phát hiện và định lượng các đột biến tin cậy. Bộ kit đã được sử dụng để điều tra sự có mặt các đột biến A3243G, G3380A, A8344G, T8993G, T8993C, G11778A ở 69 bệnh nhân nghi bị bệnh ty thể và 3 trường hợp mang đột biến A3243G (chiếm 4,34%) đã được phát hiện. Các thành viên gia đình của 3 bệnh nhân mang đột biến A3243G cũng được phân tích về sự có mặt và tỷ lệ đột biến, kết quả cho thấy đột biến A3243G ở các bệnh nhân này được di truyền từ mẹ sang con và tồn tại ở dạng không đồng nhất trong tế bào, tỷ lệ đột biến có tương quan với biểu hiện lâm sàng của bệnh.

Từ khóa: A3243G, G3380A, A8344G, T8993G, T8993C, G11778A.

1. Mở đầu^*

Ty thể là bào quan có mặt trong hầu hết các tế bào nhân chuẩn với chức năng chính là sản xuất năng lượng dưới dạng ATP cho các hoạt động của tế bào. Hệ gen ty thể (mtDNA) của người có cấu trúc sợi đôi, DNA mạch vòng với kích thước 16,569 bp, gồm 37 gen mã hóa cho 13 protein, 22 RNA vận chuyển (tRNA) và 2 RNA ribosome ty thể (rRNA). Những sai hỏng trong DNA của ty thể có thể gây ra sự rối loạn đa hệ thống, ảnh hưởng đến nhiều loại tế bào, mô và tổ chức khác nhau chủ yếu tập trung ở _______

* Tác giả liên hệ.

Địa chỉ email: [email protected] https://doi.org/10.25073/2588-1140/vnunst.5285

cơ, thần kinh và chức năng chuyển hóa của cơ thể [1].

Giống như tất cả DNA ngoài nhân, phần lớn mtDNA được di truyền theo dòng mẹ [2].

Tuy nhiên, tỷ lệ số bản sao mang đột biến ở mẹ và con lại khác nhau, vì vậy, mức độ biểu hiện bệnh ở mẹ và các người con có thể rất khác nhau. Các tế bào thường chứa nhiều bản sao mtDNA, do đó, khi xuất hiện đột biến thì trong cùng một tế bào có thể có cả mtDNA bình thường và mtDNA đột biến. Đặc điểm này được gọi là tính không đồng nhất (heteroplasmy) của mtDNA, còn nếu tất cả các bản sao của mtDNA giống nhau thì gọi là tính đồng nhất (homoplasmy) [3, 4]. Hiện nay, hơn 300 đột biến trong hệ gen ty thể người (chủ yếu là đột biến điểm) đã được phát hiện, trong đó có

(3)

hơn 200 đột biến gây bệnh, chủ yếu tập trung vào cơ, thần kinh, chức năng chuyển hoá của cơ thể [5]. Mặt khác, bệnh do đột biến gen ty thể có tác động lâm sàng phức tạp nên rất khó để phát hiện thông qua việc chẩn đoán lâm sàng.

Cho đến nay, phân tích DNA là phương pháp hiện cho phép phát hiện nhanh chóng và chính xác các đột biến gây bệnh.

Các đột biến điểm chủ yếu gây ra các hội chứng MELAS (mitochondrial encephalopathy, lactic acidosis and stroke-like episodes), hội chứng MERRF (myoclonic epilepsy with ragged-red fibres), hội chứng Leigh (do nhà khoa học Leigh tìm ra), hội chứng LHON (Leber’s herteditary optic neuropathy). MELAS là hội chứng não giật cơ, tăng acid lactic máu và giả tai biến mạch, có tần suất xuất hiện 1:15.000 và là một trong các bệnh thần kinh di truyền phổ biến nhất, có tỷ lệ tử vong cao [6, 7].

Nguyên nhân của hội chứng MELAS là do một trong các loại đột biến điểm trên gen MTTL1 mã hóa cho tRNA^Leu hoặc trên gen MTND5 mã hóa cho ND5 ubiquinone oxidoreductase của phức hợp I. Trong đó, đột biến A thay thế G ở vị trí 3243 (A3243G) trên gen MTTL1 làm thay đổi cấu trúc, rối loạn chức năng của tRNA^Leu(UUR)là phổ biến nhất ở tất cả chủng tộc, chiếm đến 80% số ca mang hội chứng MELAS [8-12]. Bên cạnh đó, đột biến G3380A trên gen MTND1, mã hóa cho phân tử RNA vận chuyển leucine (tRNA^Leu) thường tồn tại ở dạng không đồng nhất cũng thường được tìm thấy trên bệnh nhân bị hội chứng MELAS [13]. MERRF là hội chứng động kinh giật cơ với các sợi cơ đỏ xé rách có thể kèm theo mất trí, điếc, bệnh cơ, teo dây thần kinh thị giác, tổn thương hô hấp và tim; nguyên nhân phổ biến là do đột biến A8344G, T8356C và G8363A nằm trên gen MTTK mã hóa cho tRNA^Lys gây ra. Trong số các đột biến này, đột biến A8344G là phổ biến nhất, chiếm 80-90% số ca mang hội chứng MERRF [14]. Leigh là hội chứng với triệu chứng điển hình thoái hóa thần kinh tiến triển ở trẻ, có thể dẫn đến tử vong trong vài tháng hoặc vài năm [15]. Đa số các đột biến gen ty thể gây ra hội chứng Leigh nằm trên gen MTATP6 mã

hoá cho ATPase 6 ở phức hệ V của chuỗi hô hấp, đặc biệt các đột biến đổi T thành G hoặc C tại vị trí 8993 chiếm tỷ lệ cao nhất (khoảng 20% bệnh nhân mang hội chứng Leigh có biến đổi này) [16]. Bệnh nhân Leigh có tỷ lệ đột biến rất cao; khi lượng đột biến từ 60 - 90% thì thể hiện triệu chứng rối loạn thần kinh, mất điều hòa vận động và viêm võng mạc [14, 17].

LHON là hội chứng liệt thần kinh thị giác di truyền theo Leber, tác động chủ yếu đến võng mạc, gây ra chứng teo dây thần kinh thị giác, làm mất khả năng nhìn thấy ở cả hai mắt. Khoảng 95% trường hợp LHON gây ra bởi các đột biến liên quan đến các tiểu đơn vị của phức hệ I, bao gồm đột biến G11778A trên gen ND4 (50 - 70%

trường hợp), đột biến G3460A trên gen ND1 (15% trường hợp) và đột biến T14484C trên gen ND6 (10% trường hợp). Trong đó, đột biến G11778A là nguyên nhân phổ biến nhất của LHON. Ngoài ra, còn có các đột biến hiếm khác liên quan đến gen ND5 và ND6 [18].

Kỹ thuật real-time PCR cũng đã được sử dụng để phát hiện và định lượng các đột biến gen ty thể thuộc các hội chứng điển hình như Leigh [17], MELAS [20] hay LHON [22]. Tuy nhiên, các nghiên cứu này chỉ dừng lại ở việc nghiên cứu từng đột biến riêng lẻ; và cho đên nay, chưa có kit thương mại để phát hiện và định lượng đồng thời một số đột biến trên gen ty thể.

Nghiên cứu này báo cáo kết quả phát triển bộ kit phát hiện và định lượng đồng thời 6 đột biến điểm phổ biến trong hệ gen ty thể, bao gồm:

A3243G, G3380A (đột biến phổ biến gây ra hội chứng MELAS), A8344G (đột biến phổ biến gây hội chứng MERRF), T8993G, T8993C (đột biến phổ biến gây hội chứng Leigh) và G11778A (đột biến phổ biến gây hội chứng LHON).

2. Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu

2.1. Nguyên liệu

Mẫu máu ngoại vi của 69 bệnh nhân nghi bị bệnh ty thể và mẫu máu của bố mẹ và người thân của gia đình có bệnh nhân mang đột biến được lấy từ Bệnh viện Nhi Trung ương đã được

(4)

sử dụng để tách DNA cho phân tích đột biến gen ty thể. Kế hoạch nghiên cứu đã được thông qua bởi Hội đồng đạo đức của Bệnh viện Nhi Trung ương (ngày 15/6/2016) và được thực hiện trên cơ sở tuân thủ chặt chẽ các tiêu quy định mà Hội đồng đã duyệt. Đối tượng cung cấp mẫu điều tra đột biến gen ty thể (bệnh nhân và thành viên gia đình) có bản chấp thuận tự nguyện tham gia vào nghiên cứu.

Các plasmid tái tổ hợp mang các đoạn gen ty thể bình thường hay không có đột biến (3243A, 3380G, 8344A, 8993T, 11778G) và có đột biến (3243G, 3380A, 8344G, 8993C, 8993G, 11778A) là sản phẩm của đề tài KC.04.10/11-15.

2.2. Phương pháp nghiên cứu 2.2.1. Tách chiết DNA tổng số

DNA tổng số từ mẫu bệnh phẩm được tách bằng kit của Qiagen (Hoa Kỳ). Nồng độ DNA được định lượng bằng cách đo độ hấp thụ ở bước sóng 260 nm (A260) bằng NanoDrop ND2000 (Thermo Scientific, Đức).

2.2.2. Kỹ thuật real-time PCR sử dụng mẫu dò huỳnh quang dạng khóa cầu acid nucleic

Các đột biến gen ty thể được phát hiện và định lượng bằng kỹ thuật real-time PCR (qPCR) sử dụng mẫu dò huỳnh quang dạng khóa cầu acid nucleic (LNA) theo phương pháp được Truong và cộng sự [19] thiết lập, sử dụng các plasmid mang đoạn gen không có đột biến 3243A, 3380G, 8344A, 8993T, 11778G và có đột biến (3243G, 3380A, 8344G, 8993C, 8993G, 11778A) làm mẫu chuẩn. Các cặp mồi được thiết kế để nhân lên các đoạn gen đích kích thước từ 70–114 bp ở vùng có chứa đột biến cần nghiên cứu. Mẫu dò huỳnh quang Taqman có trình tự bổ sung với một phần trình tự trên đoạn gen đích, dài 12–15 nucleotide, có một số nucleotide dạng LNA, đặc biệt nucleotide LNA ở vị trí bổ sung với điểm đột biến là có tính bắt buộc để mẫu dò không bặt cặp với DNA khuôn dạng không đột biến trong khoảng nhiệt độ chọn gắn mồi. Đầu 5’ của mẫu dò có gắn chất phát huỳnh quang (reporter) HEX (Ex/Em = 535/556 nm) cho mẫu dò đặc

hiệu với trình tự không đột biến và FAM (Ex/Em = 495/520 nm) cho mẫu dò đặc hiệu với trình tự đột biến, còn đầu 3’ của mẫu dò có gắn chất hấp phụ huỳnh quang (quencher) là IBFQ (Iowa black fluorescence quencher).

Theo cách thiết kế này, khi chạy real-time PCR, nếu chỉ tín hiệu HEX gia tăng chứng tỏ mẫu DNA khuôn không mang đột biến. Ngược lại, nếu chỉ tín hiệu FAM gia tăng chứng tỏ DNA khuôn mang đột biến ở dạng đồng nhất và nếu cả hai loại tín hiệu FAM và HEX đều gia tăng thì chứng tỏ mẫu DNA khuôn mang đột biến ở dạng không đồng nhất. Dựa trên số lượng bản sao đã biết của mẫu chuẩn, số lượng bản sao đột biến và không đột biến của mẫu cần phân tích được tính ra; đồng thời thiết bị real-time PCR cũng chỉ ra các thông số hiệu suất PCR (E), hệ số tương quan tuyến tính giữa chu kì ngưỡng và số bản sao ban đầu (R²).

Dựa trên kết quả số bản sao đột biến và không đột biến của mẫu cần phân tích hiển thị trên máy tính, tỷ lệ đột biến của mẫu bệnh phẩm được tính theo công thức: % đột biến = Số bản sao đột biến (FAM)/(Số bản sao đột biến (FAM) + Số bản sao không đột biến (HEX)).

2.2.3. Xác định độ nhạy và đặc hiệu

Độ nhạy của phương pháp hay bộ kit được định nghĩa là giới hạn nồng độ thấp nhất mà phương pháp hay bộ kit vẫn cho phép phát hiện và định lượng chính xác.

Độ đặc hiệu của phương pháp hay bộ kit được đánh giá trên cơ sở tỷ lệ mẫu dương tính phát hiện được /Số mẫu dương thực và tỷ lệ mẫu âm tính phát hiện được /Số mẫu âm tính thực. Trong đó, các loại DNA khác nhau đã được sử dụng.

DNA được tách từ một mẫu bệnh phẩm không mang bất kì đột biến nào trong số 6 đột biến nghiên cứu (đã được xác định trước đó bằng PCR-RFLP và giải trình tự) được sử dụng là mẫu dương tính giả. Mẫu bệnh phẩm của bệnh nhân mang đột biến A3243G (đã được phân tích trước đó) được sử dụng làm mẫu dương tính thật. Ngoài ra, để kiểm tra khả năng bắt cặp đặc hiệu của master mix trên các vùng gen khác nhau của ty thể, chúng tôi đã sử dụng hỗn hợp

(5)

10 plasmid chứa các đoạn gen ty thể khác nhau nhưng không chứa trình tự trùng với trình tự của mẫu dò và mồi được thiết kế để làm mẫu âm tính.

Các thí nghiệm định lượng tỷ lệ đột biến được lặp lại 3 lần, số liệu được xử lý bằng phương pháp thống kê để tính giá trị trung bình của mẫu và độ lệch chuẩn theo phần mềm Excel.

3. Kết quả nghiên cứu và thảo luận

3.1. Xác định điều kiện real-time PCR để phát hiện và định lượng 6 đột biến gen ty thể A3243G, G3380A, A8344G, T8993C, T8993G, G11778A

Sau các lần thử nghiệm, chúng tôi đã xác định được thành phần thích hợp của master mix bao gồm: hỗn hợp 2X (sẵn có Taq DNA polymerase, đệm, dNTP, dUTP, MgCl2, Uracyl-N-glucosylase), bổ sung 10 pmol mồi xuôi, 10 pmol mồi ngược, 2 pmol mẫu dò đột biến, 2 pmol mẫu dò không đột biến, bổ sung đệm TE 1X đến thể tích cuối cùng là 15 µL. Master mix sử dụng cho real-time PCR trong nghiên cứu này đã được thay đổi về nồng độ mẫu dò và bổ sung

thêm dUTP, Uracyl-N-glucosylase (UNG) để loại khả năng có kết quả dương tính.

Trên cơ sở nhiệt độ Tm của mồi, mẫu dò và thăm dò điều kiện nhiệt độ cho các bước phản ứng, chúng tôi đã chọn ra chế độ nhiệt là: 50 ôC trong 4 phút để UNG loại bỏ gốc uracyl ra khỏi các sản phẩm PCR (của lần thí nghiệm trước đó) có thể lẫn vào hỗn hợp phản ứng, 95 ôC trong 10 phút cho biến tính DNA ban đầu, đồng thời bất hoạt UNG, tiếp theo là 40 chu kì bao gồm 95 ôC trong 15 giây để biến tính DNA, 60

oC trong 30 giây cho gắn mồi và kéo dài chuỗi.

Tiếp theo, master mix được thử nghiệm để xác định điều kiện thích hợp cho việc định lượng đột biến thông qua xây dựng các đường chuẩn. Kết quả cho thấy có sự tương quan tuyến tính giữa giá trị chu kỳ ngưỡng và logarit số bản sao với cả kênh HEX (không đột biến) và kênh FAM (có đột biến) (Hình 1).

Giá trị hiệu suất PCR (E) của các phản ứng nằm trong khoảng 90 - 110%, hệ số tương quan tuyến tính R²cả hai kênh đều lớn hơn 0,99 (Bảng 1) khẳng định master mix cho phép định lượng các đột biến nêu trên với độ tin cậy cao.

Hình 1. Biểu đồ tương quan tuyến tính giữa chu kì ngưỡng và số bản sao ban đầu của các đột biến.

A: Đột biến A3243G, B: đột biến G3380A, C: Đột biến A8344G, D: Đột biến T8993G, E: Đột biến T8993C, F: Đột biến G11778A. Đường màu đỏ là đường chuẩn của kênh đột biến (FAM),

đường màu xanh là đường chuẩn của kênh không mang đột biến (HEX).

A B C

D E F

(6)

Bảng 1. Hiệu suất real-time PCR và hệ số tương quan tuyến tính của đường chuẩn các đột biến A3243G, G3380A, A8344G, T8993G/C và G11778A

Đột biến

Tín hiệu FAM (Đột biến) Tín hiệu HEX (Không đột biến) Hiệu suất real-time PCR (E) % R² Hiệu suất real-time

PCR (E) % R²

A3243G 110 0,998 91 1,000

G3380A 91 0,996 110 0,991

A8344G 90 0,999 91 1,000

T8993G 96 0,993 100 0,997

T8993C 94 0,994 98 0,996

G11778A 98 0.999 94 0,999

Trên cơ sở dung dịch master mix tạo được, chúng tôi đã tạo bộ kit (100 phản ứng/bộ) phát hiện và định lượng từng đột biến A3243G, G3380A, A8344G, T8993C, T8993G, G11778A gồm có các thành phần sau: i) Master mix (Mix):

3 ống x 0,5 mL; ii) Mẫu chuẩn (PC) nồng độ DNA 5.10³ - 5.10⁶: 4 ống x 50 µL/ống; iii) Đối chứng âm (NC): 1 ống x 0,2 ml (4 pg/µL);

iv) H2O cất loại ion: 1,2 mL.

Mẫu chuẩn hay đối chứng dương bao gồm plasmid mang đoạn gen ty thể tương ứng có đột biến và không đột biến đã trộn sẵn theo tỷ lệ 1:1 với 4 nồng độ từ 5x10³, 5x10⁴, 5x10⁵ và 5x10⁶ của từng đột biến A3243G, T8993G, G11778A, G3380A, A8344G, T8993C. Đối chứng âm là plasmid mang đoạn gen ty thể tương ứng không có đột biến.

3.2. Xác định độ nhạy, độ đặc hiệu và các điều kiện bảo quản của bộ kit

3.2.1. Xác định độ nhạy của bộ kit

Việc đánh giá độ nhạy của bộ kit tạo ra bằng cách sử dụng các mẫu chuẩn là hỗn hợp plasmid mang đoạn gen ty thể có đột biến và

không có đột biến với các tỷ lệ plasmid mang đoạn gen đột biến khác nhau.

Biểu đồ đường cong khuếch đại sau khi kết thúc real-time PCR (Hình 2) cho thấy với cả 6 mẫu phân tích đều có sự gia tăng tín hiệu của cả hai kênh đột biến (FAM) và không đột biến (HEX), tức là có sự nhân lên của đoạn gen đích đột biến và không đột biến, chứng tỏ bộ kit cho phép phát hiện đột biến ở tỷ lệ 1% (và không cho kết quả ở tỷ lệ đột biến thấp hơn). Trong khi đó, ở tỷ lệ đột biến ≤ 0,1% đã không phát hiện được gia tăng tín hiệu của kênh đột biến.

Độ nhạy của một số phương pháp real-time PCR có thể tới 0,1% đột biến [19, 20], thậm chí tới 0,01% [21] và có thể chỉ ở mức 5% [22] tùy thuộc vào việc thiết kế mẫu dò. So với các phương pháp khác như kỹ thuật pyrosequencing [23] và phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao biến tính có độ nhạy 1% [24], bộ kit tạo ra trong nghiên cứu này có đủ độ nhạy trong việc phát hiện và định lượng các đột biến gen ty thể phổ biến.

Hình 2. Biểu đồ đường cong khuếch đại phản ứng realtime PCR khi sử dụng khuôn là 1% tỷ lệ đột biến.

A: Đột biến A3243G, B: Đột biến G3380A, C: Đột biến A8344G, D: Đột biến T8993G, E: Đột biến G11778A, F: Đột biến T8993C. Mẫu dò huỳnh quang mang HEX, đặc hiệu cho mẫu không đột biến,

mẫu dò huỳnh quang mang FAM, đặc hiệu cho mẫu đột biến.

(7)

3.2.2. Xác định độ đặc hiệu của bộ kit Kết quả thu được với mẫu dương tính giả, tín hiệu nhân bản chỉ xuất hiện ở kênh HEX đặc hiệu cho mẫu không đột biến mà không xuất hiện tín hiệu nhân bản ở kênh FAM đặc hiệu cho mẫu có đột biến (Hình 3A). Ngược lại, với mẫu DNA được tách từ mẫu bệnh phẩm của bệnh nhân có đột biến A3243G, bộ kit A3243G cho thấy sự gia tăng tín hiệu ở cả kênh đột biến (3243FAM) và không đột biến (3243HEX), phù hợp với tính toán lý thuyết ban đầu là bệnh nhân mang đột biến ở dạng không đồng nhất (Hình 3B). Trong khi đó, khi sử dụng các khuôn là hỗn hợp plasmid chứa đoạn gen ty thể không thuộc vùng mang đột biến quan tâm thì không có mẫu nào cho thấy có sự gia tăng tín hiệu của cả hai kênh đột biến và không đột biến (Hình 3B). Các kết quả thu được chứng tỏ bộ kit có độ đặc hiệu cao (100%). Trong tế bào ty thể tồn tại với rất nhiều bản sao, các đoạn gen đích trên các bản sao này đôi khi chỉ khác nhau

một nucleotide, do đó các phương pháp phát hiện đột biến gen ty thể đòi hỏi phải có độ đặc hiệu rất cao gần như tuyệt đối. Hầu hết các nghiên cứu sử dụng real-time PCR phát hiện các đột biến A3243G, T8993G/C, G11778A đều cho thấy phương pháp có độ đặc hiệu lên tới 100%

[20-22]. Bộ kit tạo ra trong nghiên cứu này cho phép phát hiện chính xác các đột biến A3243G, G3380A, A8344G, G11778A, T8993G, T8993C và không có xảy ra khả năng bắt cặp nhầm giữa các vùng DNA khác nhau trên hệ gen ty thể.

Bộ kit do chúng tôi tạo ra được ký hiệu:

Mito-6-mutations q.PCR.

Ngoài ra, bộ kit cũng cho kết quả phát hiện đột biến tương tự, khi chúng tôi sử dụng các mẫu dương tính nhân tạo với 6 đột biến bằng cách trộn một tỷ lệ nhất định (5x10⁸bảnsao) của mỗi loại plasmid mang đột biến (3243G, 3380A, 8344G, 8993G, 8993C và 11778A) với huyết thanh của người không mang đột biến thay cho mẫu bệnh nhân nghi bị đột biến gen ty thể.

F

Hình 3. Đường cong khuếch đại đoạn gen mang đột biến A3243G bằng real-time PCR. A: các mẫu bệnh phẩm không mang các đột biến; B: một trường hợp dương tính với A3243G và các đoạn gen khác trên hệ gen ty thể.

3.2.3. Xác định thời gian bảo quản của bộ kit Chúng tôi tiến hành bảo quản bộ kit Mito-6-mutations q.PCR trong 6 tháng ở –20 ^oC, sau đó, xây dựng đường chuẩn của 6 đột biến quan tâm để kiểm tra chất lượng các thành phần của master mix. Kết quả thu được (Bảng 2) cho thấy, sau 6 tháng bảo quản bộ kit vẫn cho tín hiệu đường cong khuếch đại ổn định, hệ số tương quan tuyến tính giữa chu kì ngưỡng và số bản sao ban đầu của 2 kênh HEX và FAM của 6 đột biến nằm trong khoảng 0,970–0,999. Kết quả này chỉ ra rằng trong

vòng 6 tháng kể từ ngày sản xuất, được bảo quản ở –20 ^oC, bộ kit Mito-6-mutations q.PCR vẫn cho phép phát hiện và định lượng đột biến tin cậy, phù hợp với tiêu chuẩn cơ sở đã đặt ra.

Tương tự, bộ kit được bảo quản ở nhiệt độ phòng (25 ^oC) trong 3 ngày, 7 ngày, 10 ngày và ở 4 ^oC trong 10 ngày, 20 ngày và 30 ngày; sau đó đánh giá khả năng phân tích các đột biến A3243G, G3380A, A8344G, G11778A, T8993G, T8993C.

Kết quả thu được cho thấy, sau 7 ngày bảo quản ở nhiệt độ phòng hoặc tương tự sau 20

(8)

ngày ở 4 ^oC, các thành phần của bộ kit vẫn hoạt động tốt, biểu đồ đường cong khuếch đại của 6 đột biến vẫn cho tín hiệu ổn định, hệ số tương quan tuyến tính R²giữa Ct và số bản sao ban đầu của 2 kênh đột biến và không đột biến của các mẫu chuẩn đều lớn hơn 0,99 chứng tỏ rằng đường chuẩn có giá trị tin cậy.

Bảng 2. Hiệu suất PCR (E) và hệ số tương quan tuyến tính (R²) của đường chuẩn các đột biến A3243G, G3380A, A8344G, T8993G/C và G11778A sử dụng

bộ kit bảo quản sau 6 tháng ở –20 ^oC

Đột biến Tín hiệu FAM Tín hiệu HEX

E (%) R² E (%) R²

A3243G 114,3 0,972 151,7 0,999

G3380A 83,2 0,995 96,4 0,995

A8344G 96,9 0,998 117,8 0,971

T8993G 91,4 0,994 83,6 0,996

T8993C 104,7 0,984 104,6 0,996 G11778A 83,6 0,997 95,7 0,999 Tuy nhiên, sau 10 ngày bảo quản ở nhiệt độ phòng (25 ^oC) hoặc sau 30 ngày ở 4 ^oC, độ tương quan tuyến tính giữa chu kì ngưỡng và số

bản sao ban đầu của 6 đột biến không còn đủ độ tin cậy cho việc định lượng (R² < 0,99). Như vậy bộ kit Mito-6-mutations q.PCR có thể được bảo quản ở nhiệt độ phòng (25 ^oC) trong 7 ngày, ở 4

oC trong 20 ngày hay ở –20 ^oC trong 6 tháng.

3.3. Kiểm tra khả năng phát hiện đột biến ty thể của bộ kit

3.3.1. Kiểm tra khả năng phát hiện và định lượng đột biến G1177A

Trong một nghiên cứu trước đây [25], chúng tôi đã phát hiện được một bệnh nhân (nữ, 7,5 tháng tuổi) mang đột biến G11778A thuộc hội chứng LHON với tỷ lệ đột biến là 2,710,12%. Bố và mẹ bệnh nhân không phát hiện thấy có mang đột biến này. Với bộ kit Mito-6-mutations q.PCR tạo ra, chúng tôi cũng đã tiến hành lặp lại việc phân tích sự có mặt cũng như tỷ lệ đột biến.

Kết quả thu được (Hình 4) cho thấy mẫu bệnh nhân có mang đột biến với tỷ lệ là 2,7%, trong khi mẫu bố và mẹ bệnh nhân không thấy mang đột biến này. Kết quả này phù hợp với phát hiện trước đây, và sự có mặt của đột biến G11778A của bệnh nhân có thể do phát sinh trong quá trình phát triển cá thể.

I

Hình 4. Kết quả real-time PCR với mẫu gia đình bệnh nhân (A) và đường chuẩn thể hiện tương quan giữa logarit số bản sao gen ty thể và chu kỳ ngưỡng của đột biến G11778A (đường dưới là dạng có đột biến,

đường trên là dạng không mang đột biến) (B).

3.3.2. Ứng dụng bộ kit trong sàng lọc sự có mặt của các đột biến gen ty thể ở bệnh nhân

Bộ kit Mito-6-mutations q.PCR đã được sử dụng thử nghiệm điều tra sự có mặt và định lượng 6 đột biến gen ty thể A3243G, G3380A, A8344G, G11778A, T8993G, T8993C trên 69 bệnh nhân có triệu chứng lâm sàng nghi bệnh ty thể tại Khoa Thần kinh, Bệnh viện Nhi Trung ương. Kết quả thu được cho thấy: 57 trong số

69 mẫu bệnh phẩm cho kết quả âm tính. Ở đây chúng tôi chỉ nêu một trường hợp làm minh họa. Cụ thể bệnh nhân số 1 (ký hiệu BN1), kết quả thu được ở Hình 5 cho thấy, ở cả 6 đột biến, đồ thị tín hiệu real-time PCR nhân bản với mẫu dò không đột biến HEX xuất hiện với số chu kỳ ngưỡng Ct dao động từ 14 - 17 nhưng không thu được tín hiệu khuếch đại nào của kênh FAM với mẫu dò đột biến. Trong khi đó,

A B

(9)

đối chứng dương của 6 đột biến đều cho đường khuếch đại với mẫu dò không đột biến HEX xuất hiện với chu kỳ ngưỡng Ct dao động từ 19 - 23 và mẫu dò đột biến FAM xuất hiện với chu kỳ ngưỡng Ct dao động từ 18 - 26. Các kết quả này chứng tỏ, bệnh nhân BN1 không mang 6 đột biến nghiên cứu là A3243G, G3380A, A8344G, T8993G, T8993C và G11778A trên gen ty thể. Các bệnh nhân ký hiệu BN4, BN11 và BN30, đồ thị nhân bản với mẫu dò FAM và HEX xuất hiện với cặp mồi và mẫu dò đặc hiệu cho đột biến A3243G, trong khi các bệnh nhân

còn lại chỉ thu được tín hiệu HEX mà không thu được tín hiệu FAM (Hình 5). Kết quả chứng tỏ các bệnh nhân BN4, BN11, BN30 có mang đột biến A3243G ở dạng không đồng nhất. Bên cạnh đó, đồ thị tín hiệu nhân bản với mẫu dò FAM không xuất hiện với cặp mồi và mẫu dò đặc hiệu cho các đột biến G3380A, A8344G, G11778A, T8993G, T8993C, trong khi đó đồ thị tín hiệu nhân bản vẫn xuất hiện với HEX, chứng tỏ trong số 69 bệnh nhân điều tra, không có bệnh nhân nào mang đột biến G3380A, A8344G, G11778A, T8993G, T8993C.

I

F

Hình 5. Kết quả thử nghiệm bộ kit Mito- 6-mutations q.PCR phát hiện đột biến gen ty thể của các bệnh nhân BN1, BN4, BN11 và BN30.

Xét về tỷ lệ đột biến, với số lượng mẫu là 69 bệnh nhân nghiên cứu, có 3 bệnh nhân mang đột biến A3243G ở dạng không đồng nhất được phát hiện, chiếm tỷ lệ 4,34%. Tỷ lệ đột biến này khá gần với tỷ lệ 5,7% mà Truong và các cộng sự [26] trước đây đã phát hiện khi điều tra trên 106 bệnh nhân người Việt Nam nghi bị bệnh ty thể. Trong một nghiên cứu trước đây ở 631 bệnh nhân người Hungary có triệu chứng bệnh ty thể, Gal và các cộng sự [27] đã cho thấy có 2,2% bệnh nhân mang đột biến A3243G. Tỷ lệ này là 1,74% trong một nghiên cứu khác, ở 230 bệnh nhân người Nhật bị giảm khả năng nghe

[28]. Trên thực tế, bên cạnh các đặc điểm di truyền, tỷ lệ đột biến gen ty thể còn phụ thuộc tiêu chuẩn lựa chọn bệnh nhân, đối tượng, độ tuổi,...

4. Kết luận

Bộ kit Mito-6-mutations q.PCR tạo ra cho phép phát hiện và định lượng chính xác các đột biến gen ty thể A3243G, G3380A, A8344G, T8993G, T8993C và G11778A bằng real-time PCR sử dụng mẫu dò dạng LNA. Bộ kit đã được thử nghiệm để phân tích sự có mặt của các đột biến gen ty thể cho các bệnh nhân ở Bệnh viện Nhi Trung ương.

(10)

Lời cảm ơn

Nghiên cứu được thực hiện với sự hỗ trợ kính phí của Đề tài cấp Đại học Quốc gia Hà Nội, mã số KLEPT16.03.

Tài liệu tham khảo

[1] P. Mishra, D. C. Chan, Mitochondrial Dynamics and Inheritance During Cell Division, Development and Disease, Nat, Rev, Mol, Cell, Biol, Vol. 15, 2014, pp. 634-646.

[2] P. F. Chinnery, Inheritance of Mitochondrial Disorders, Mitochondrion, Vol. 2, 2002, pp. 149-155.

[3] S. Shanske, J. Pancrudo, P. Kaufmann, K. Engelstad, S. Jhung, J. Lu, A. Naini, S. DiMauro, D. C. De Vivo, Varying Loads of the Mitochondrial DNA A3243G Mutation in Different Tissues: Implications for Diagnosis, Am, J. Med, Genet, Part A, Vol. 130A, 2004, pp. 134-137.

[4] M. K. Koenig, Presentation and Diagnosis of Mitochondrial Disorders in Children, Pediat, Neurol, Vol. 38, 2008, pp. 305-313.

[5] X. Zhou, H. Zhang, F. Zhao, Y. Ji, Y. Tong, J. Zhan, Y. Zhang, L. Yang, Y. Qian, F. Lu, J. Qu, M. X. Guan, Very High Penetrance and Occurrence of Leber’s Hereditary Optic Neuropathy in a Large Han Chinese Pedigree Carrying the ND4 G11778A Mutation, Mol, Genet, Metab, Vol. 100, 2010, pp. 379-384.

[6] Y. Ma, F. Fang, Y. Cao, Y. Yang, L. Zou, Y. Zhang, S. Wang, S. Zhu, Y. Xu, P. Pei, Y. Qi, Clinical Features of Mitochondrial DNA m.3243A>G Mutation in 47 Chinese Families, J. Neurol, Sci, Vol. 291, 2010, pp. 17-21.

[7] S. Rahman, J. Poulton, D. Marchington, A. Suomalainen, Decrease of A3243G mtDNA Mutation from Blood in MELAS Syndrome: A Longitudinal Study, Am, J. Hum, Genet, Vol. 68, 2001, pp. 238-240.

[8] E. Ciafaloni, E. Ricci, S. Shanske, C. T. Moraes, G. Silvestri, M. Hirano, S. Simonetti, C. Angelini, M. A. Donati, C. Garcia, A. Martinuzzi, R. Mosewich, S. Servidei, E. Zammarchi, E. Bonilla, D. C. DeVivo, L. P. Rowland, E. A. Schon, S. DiMauro, MELAS: Clinical Features, Biochemistry, and Molecular Genetics, Annal, Neurol, Vol. 31, 1992, pp. 391-398.

[9] K. Majamaa, J. S. Moilanen, S. Uimonen, A. M. Remes, P. I. Salmela, M. Kärppä, K. A. Voltti, H. Rusanen, M. Sorri, K. J. Peuhkurinen, I. E.

Hassinen, Epidemiology of A3243G, the Mutation for Mitochondrial Encephalomyopathy, Lactic Acidosis, and Strokelike Episodes: Prevalence of the

Mutation in an Adult Population, Am, J. Hum, Genet, Vol. 63, 1998, pp. 447-454.

[10] P. J. Lorenzoni, R. H. Scola, C. S. K Kay, R. C. Arndt, A. A. Freund, I. Bruck, M. L. S. F. Santos, L. C. Werneck, MELAS: Clinical Features, Muscle Biopsy and Molecular Genetics, Arquivos de Neuro-Psiquiatria, Vol. 67, 2009, pp. 668-676.

[11] M. Mimaki, H. Hatakeyama, T. Ichiyama, H. Isumi, S. Furukawa, M. Akasaka, A. Kamei, H. Komaki, I. Nishino, I. Nonaka, Y. I. Goto, Different Effects of Novel mtDNA G3242A and G3244A Base Changes Adjacent to a Common A3243G Mutation in Patients with Mitochondrial Disorders, Mitochondrion, Vol. 9, 2009, pp. 15-122.

[12] C. Glatz, K. D’Aco, S. Smith, N. Sondheimer, Mutation in the Mitochondrial tRNA(Val) Causes Mitochondrial Encephalopathy, Lactic Acidosis and Stroke-like Episodes, Mitochondrion, Vol. 11, 2011, pp. 615-619.

[13] R. Horvath, R. Reilmann, E. Holinski-Feder, E. B. Ringelstein, T. Klopstock, The Role of Complex I Genes in MELAS: A Novel Heteroplasmic Mutation 3380G>A in ND1 of mtDNA, Neuromusc, Disord, Vol. 18, 2008, pp. 553-556.

[14] A. L. Gropman, The Neurological Presentations of Childhood and Adult Mitochondrial Disease:

Established Syndromes and Phenotypic Variations, Mitochondrion, Vol. 4, 2004, pp. 503-520.

[15] Y. Suzuki, T. Wada, T. Sakai, Y. Ishikawa, R. Minami, N. Tachi, S. Saitoh, Phenotypic Variability in a Family with a Mitochondrial DNA T8993C Mutation, Pediat, Neurol, Vol. 19, 1998, pp. 283-286.

[16] E. M. Rebai, W. Chaari, S. Younes, R. Bousoffara, M. T. Sfar, F. Fakhfakh, Maternally Inherited Leigh Syndrome: T8993G Mutation in a Tunisian Family, Pediat. Neurol, Vol. 40, 2009, pp 437-442.

[17] H. Tajima, K. Sueoka, S. Y. Moon, A. Nakabayashi, T. Sakurai, Y. Murakoshi, H. Watanabe, S. Iwata, T. Hashiba, S. Kato, Y. I. Goto, Y. Yoshimura, The Development of Novel Quantification Assay for Mitochondrial DNA Heteroplasmy Aimed at Preimplantation Genetic Diagnosis of Leigh Encephalopathy, J. Assist, Reprod, Genet, Vol. 24, 2007, pp. 227-232.

[18] G. C. Black, K. Morten, A. Laborde, J. Poulton, Leber's Hereditary Optic Neuropathy: Heteroplasmy is Likely to be Significant in the Expression of LHON in Families with the 3460 ND1 Mutation, Brit, J. Ophthalmol, Vol. 80, 1996, pp. 915-917.

[19] T. H. Truong, T. V. A. Nguyen, T. H. L. Nguyen, V. A. Pham, T. N. Phan, Sensitive Quantitation of

(11)

Mitochoncirial Mutation Using New Taqman Probes, Cent, Eur, J. Med, Vol. 9, 2014, pp. 839-848.

[20] R. Singh, S. Ellard, A. Hattersley, L. W. Harries, Rapid and Sensitive Real-time Polymerase Chain Reaction Method for Detection and Quantification of 3243A>G Mitochondrial Point Mutation, J. Mol, Diagn, Vol. 8, 2006, pp. 225-230.

[21] H. Strand, O. C. Ingebretsen, O. Nilssen, Real-time Detection and Quantification of Mitochondrial Mutations with Oligonucleotide Primers Containing Locked Nucleic Acid, Clin, Chim, Acta, Vol. 390, 2008, pp. 126-133.

[22] J. Y. Wang, Y. S. Gu, Y. Tong, Y. Wang, J. B. Shao, M. Qi, MGB Probe Aassay for Rapid Detection of mtDNA11778 Mutation in the Chinese LHON Patients by Real-time PCR, J. Zhejiang, Univ, Sci. B, Vol. 9, 2008, pp. 610-615.

[23] H. E. White, V. J. Durtonand, A. Seller, Accurate Detection and Quantitation Of heteroplasmic Mitochondrial Point Mutations by Pyrosequencing, Genet, Test, Vol. 9, 2005, pp. 190-199.

[24] K. S. Lim, R. K. Naviaux, R. H. Haas, Quantitative Mitochondrial DNA Mutation Analysis by Denaturing HPLC, Clin, Chem, Vol. 53, 2007, pp. 1046-1052.

[25] N. V. Minh, P. B. Khanh, N. T. H. Loan, L. N. Anh, P. V. Anh, C. V. Hung, P. T. Nghia, Detection and Quantitation of Mitochondrial G11778A Mutation of LHON Syndrome in a Vietnamese Patient with Tentatively Diagnosed Mitochondrial Disease, VNU Journal of Science: Natural Sciences and Technology, Vol. 33, 2017, pp. 20-25.

[26] T. H. Truong, T. V. A. Nguyen, V. L. Nguyen, V. A. Pham, T. N. Phan, Screening of Common Point-mutations and Discovery of New T14727C Change in Mitochondrial Genome of Vietnamese Encephalomyopathy Patients, Mitochondrial DNA, Vol. 27, 2016, pp. 441-448.

[27] A. Gal, K. Komlosi, A. Maasz, P. Pentelenyi, V. Remenyi, C. Ovary, A. Valikovics, P. Dioszeghy, D. Bereczkil, B. Melegh, M. J. Molnár, Analysis of mtDNA A3243G Mutation Frequency in Hungary, Cent, Eur, J. Med, Vol. 5, 2010, pp. 322-328.

[28] H. Nagata, K. Kumahara, T. Tomemori, Y. Arimoto, K. Isoyama, K. Yoshida, A. Konno, Frequency and Clinical Features of Patients with Sensorineural Hearing Loss Associated with the A3243G Mutation of the Mitochondrial DNA in Otorhinolaryngic Clinics, J. Hum, Genet, Vol. 46, 2001, pp. 595-959.

d s