(Stevia rebaudiana) IN VITRO BẰNG PHƯƠNG PHÁP HẠT NHÂN TẠO
Lê Phan Đình Quí1, Nguyễn Phạm Tuấn2, Nguyễn Công Kha3, Nguyễn Hoài Vững4, Nguyễn Ngọc Giàu5, Lâm Bảo Như Phương6, Nguyễn Thị Thu Trang7
RESEARCH PROCESS STORAGE OF STEVIA REBAUDIANA IN VITRO BY ARTIFICIAL SEED METHOD
Le Phan Dinh Qui1, Nguyen Pham Tuan2, Nguyen Cong Kha3, Nguyen Hoai Vung4, Nguyen Ngoc Giau5, Lam Bao Nhu Phuong6, Nguyen Thi Thu Trang7
Tóm tắt–Nghiên cứu quy trình lưu trữ cỏ ngọt (Stevia rebaudiana) in vitro bằng phương pháp hạt nhân tạo” được tiến hành nhằm mục tiêu bảo tồn cây dược liệu quý hiếm bằng phương pháp tạo hạt nhân tạo góp phần lưu giữ được các giống dược liệu tiềm năng. Kết quả thực hiện đạt được như sau: môi trường tạo hạt nhân tạo thích hợp với cỏ ngọt là môi trường MS có bổ sung Na-Alginate (3%) sau bốn tuần lưu trữ tỉ lệ hạt nảy mầm là 100% và số chồi trung bình tạo thành là 8,33; giá thể thích hợp cho sự nảy mầm của hạt nhân tạo cỏ ngọt là môi trường MS sau bốn tuần lưu trữ tỉ lệ hạt nảy mầm là 66,67% và số chồi trung bình tạo thành là 5,0. Hạt nhân tạo cỏ ngọt có khả năng nảy mầm và phát triển sau hai, ba và bốn tháng lưu trữ, tỉ lệ hạt nảy mầm tương ứng là 86,67;
66,67 và 50%, số chồi trung bình tạo thành tương ứng là 16,33; 13,0 và 10,0. Kết quả nghiên cứu cho thấy, hạt nhân tạo cũng là một công cụ thích hợp cho mở rộng sản xuất quy mô lớn phục vụ thương mại, do tiết kiệm chi phí, không gian, môi trường và thời gian, dễ dàng xử lí, gieo trồng và vận chuyển so với phương pháp truyền thống.
Từ khóa: cỏ ngọt, hạt nhân tạo, lưu trữ, MS, nảy mầm.
Abstract–“Research process storage of Stevia
1,2,3,4,5,6,7
Trung tâm Công nghệ Sinh học tỉnh An Giang Email: [email protected]
rebaudiana in vitro by artificial seed method” was carried out to conserve rare medicinal plants by artificial seed method, contributing to the preser- vation of medical potential. In this study, full- strenght MS medium supplied 3% Sodium Algi- nate, was indicated that the highest percentage of germination (100%), and the highest shoot formation rate (8,33 shoots). This condition is also showed the highest germination rate and number of shoots (66,67% and 5,00 shoots, respectively) when samples were stored at 4oC for 4 weeks.
However, the longer storage, the lower germina- tion rate and the number shoots formation, es- pecially 86,67% and 16,33 shoots for 2 months, 66,67% and 13 shoots for 3 months and 50% and 10 shoots for 4 months, respectively. The research results showed that artificial seed is also a suit- able tool for expanding large-scale production for commercial use, due to cost, space, environment and time savings, easy handling, planting and transportation compared to traditional methods.
Keywords: artificial seeds, MS, germination, Stevia rebaudiana, storage.
I. GIỚI THIỆU
Sự tiến bộ của công nghệ nuôi cấy in vitro, tái sinh thành cây hoàn chỉnh từ phôi vô tính đã mở rộng phạm vi ứng dụng mới cho việc tạo hạt nhân tạo (Gray et al., 1991). Hạt nhân tạo được xem
là phương pháp hiệu quả rút ngắn thời gian trong một số cây trồng quan trọng về mặt thương mại, nhiều tiềm năng cho sản xuất quy mô lớn với chi phí thấp để thay thế cho hạt thật. Một hạt nhân tạo được tạo thành tương tự như hạt giống thật bao gồm một phôi soma (giai đoạn hình tim hoặc hình thuỷ lôi) được bao quanh bởi một lớp phôi nhũ nhân tạo. Thuận lợi của hạt nhân tạo là tạo dòng vô tính tạo ra các hạt giống tương tự nhau có đặc tính như cây mẹ; góp phần bảo tồn được những loài thực vật quý hiếm, đảm bảo duy trì sự đa dạng sinh học và tạo sự đồng bộ hơn trong thu hoạch các loại cây nông nghiệp quan trọng; dễ dàng xử lí, có tiềm năng lưu trữ lâu dài và giảm chi phí sản xuất nhân giống nhân tạo (Gray et al., 1991). Ngày nay, hạt nhân tạo hình viên nang với lớp vỏ gel không chỉ chứa phôi soma mà có thể là chồi nách, chồi ngọn hoặc thân và rễ. Các lớp bảo vệ mẫu cấy tránh bị tổn thương trong quá trình xử lí và cho phép nảy mầm, chuyển đổi mà không gây sự biến đổi (Pennycooke et al., 2001). Chúng giống như hạt thật và nảy mầm thành cây con dưới điều kiện thích hợp. Công nghệ nuôi cấy in vitro đã ứng dụng thành công hạt nhân tạo trên nhiều loại thực vật như cây ngũ trảo, cỏ mực,. . . Sự khai thác và sử dụng cạn kiệt của một số cây dược liệu tiềm năng là nguyên nhân dẫn đến sự cạn kiệt nguồn tài nguyên, một số giống dược liệu bản địa đứng trước tình trạng báo động, một số loài đã được đưa vào sách đỏ Việt Nam.
Mặt khác, cỏ ngọt (Stevia rebaudiana) là giống cỏ hiện đang được trồng và phát triển trên nhiều vùng trong nước. Cỏ ngọt được sử dụng như một nguồn chất làm ngọt không năng lượng, với độ ngọt rất cao (khoảng 200-300 lần đường sucrose từ mía) (Tôn Nữ Liên Hương và ctv, 2015); có tác dụng kháng khuẩn, giúp cải thiện các bệnh về tim mạch, huyết áp (K. Ramesh et al., 2006). Hiện nay, nghiên cứu về loài cây cỏ ngọt này rất ít, và chưa có nghiên cứu nào về quy trình bảo quản cỏ ngọt bằng hạt nhân tạo. Từ đó, “Nghiên cứu quy trình lưu trữ cỏ ngọt (Stevia rebaudiana) in vitro bằng phương pháp hạt nhân tạo” được thực hiện.
II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
A. Vật liệu nghiên cứu
Cỏ ngọt (Stevia rebaudiana) hai tháng tuổi được lưu giữ tại Trung tâm Công nghệ Sinh học An Giang. Hóa chất: Sodium alginate, ethanol 70%, BA (6 - Benzyladenine), NAA (1-Naphthyl Acetic Acid),. . . Dụng cụ và thiết bị: cân phân tích, micropippet, tủ cấy,. . . ; dụng cụ và thiết bị cần thiết khác.
B. Phương pháp nghiên cứu
1) Ảnh hưởng của hàm lượng MS lên khả năng nảy mầm của hạt nhân tạo: Cắt đoạn mẫu thành từng đốt riêng lẻ (0,3-0,4 cm), cho tất cả các mẫu vừa cắt xong vào môi trường MS với hàm lượng khác nhau (đối chứng, bổ sung MS, 12 MS và 14 MS) có bổ sung dung dịch Na-Alginate 3%, sau đó khuấy nhẹ đều. Dùng pipette nhựa hút từng giọt dung dịch trên, mỗi giọt chứa duy nhất một mẫu cây. Sau đó, nhỏ từng giọt mẫu vào dung dịch 100 mM CaCl2.2H2O, chuyển qua máy lắc lắc đều trong vòng 30 phút. Khi hạt nhân tạo đã hình thành, gạn bỏ nước và rửa sạch hạt bằng nước cất vô trùng 2 – 3 lần để loại bỏ dung dịch CaCl2.2H2O còn bám trên bề mặt. Mỗi bình chứa bốn hạt với ba lần lặp lại. Tỉ lệ nảy mầm được ghi nhận sau hai tuần, bốn tuần.
2) Ảnh hưởng của chất kích thích sinh trưởng lên khả năng nảy mầm của hạt nhân tạo: Cắt đoạn mẫu thành từng đốt riêng lẻ (0,3-0,4 cm), cho tất cả các mẫu vừa cắt xong vào dung dịch Na- Alginate 3% môi trường MS và khuấy nhẹ đều.
Dùng pipette nhựa hút từng giọt dung dịch trên, mỗi giọt chứa duy nhất một mẫu cây. Sau đó, nhỏ vào dung dịch 100 mM CaCl2.2H2O, chuyển qua máy lắc lắc đều trong vòng 30 phút. Khi hạt nhân tạo đã hình thành, gạn bỏ nước và rửa sạch hạt bằng nước cất vô trùng 2-3 lần để loại bỏ dung dịch CaCl2 còn bám trên bề mặt. Sau thời gian lưu trữ, các hạt nhân tạo được nuôi cấy lên các môi trường có bổ sung BA, NAA riêng lẻ hoặc có sự kết hợp (MS, MS + 0,5 mg/L BA, MS + 0,5 mg/L NAA, MS + 0,5 mg/L BA + 0,5 mg/L NAA). Mỗi bình chứa bốn hạt với ba lần lặp lại. Tỉ lệ nảy mầm được đánh giá sau hai tuần, bốn tuần.
3) Ảnh hưởng thời gian lưu trữ lên khả năng nảy mầm của hạt nhân tạo: Hạt nhân tạo được nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung Na- Alginate 3% được trữ lạnh ở 4oC trong điều kiện tối. Sau thời gian lưu trữ, hạt nhân tạo được cấy lên môi trường MS + 0,5 mg/L BA để đánh giá sự nảy mầm của hạt. Mỗi bình lưu trữ có chứa 10 hạt với ba lần lặp lại. Tỉ lệ phần trăm hạt nảy mầm được ghi nhận sau mỗi hai, ba, bốn tháng tồn trữ.
4) Phương pháp thống kê: Các số liệu được xử lí bằng phần mềm Excel và thống kê phần mềm Statgraphics plus 16.0. Kiểm tra sự khác biệt giữa các giá trị trung bình theo phép thử Duncan và LSD.
III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN A. Ảnh hưởng của hàm lượng MS lên khả năng nảy mầm của hạt nhân tạo
Mục tiêu chính của nghiên cứu hạt nhân tạo là tạo ra cấu trúc hạt giống hạt truyền thống và có các đặc điểm dễ xử lí, lưu trữ, tăng khả năng sống sót và mức độ nảy mầm cao (Ara et al., 2000). Các hạt nhân tạo cỏ ngọt có tỉ lệ nảy mầm khác nhau ở các môi trường tạo hạt khác nhau (Bảng 1).
Sau hai tuần lưu trữ, nghiệm thức 1 có môi trường Na-Alginate 3% đạt tỉ lệ nảy mầm 83,33%, thấp hơn nghiệm thức 2 có môi trường Na- Alginate bổ sung MS và nghiệm thức 3 có môi trường Na-Alginate bổ sung 12 MS, cả hai đều đạt tỉ lệ nảy mầm 100% và khác biệt có ý nghĩa thống kê so với nghiệm 4 có môi trường Na-Alginate bổ sung 14 MS đạt tỉ lệ nảy mầm là 66,67%. Các chồi được hình thành sau khi hạt nảy mầm cũng khác nhau giữa các nghiệm thức. Nghiệm thức 1 và 4 đạt số chồi trung bình lần lượt là 5,33 và 5,0 chồi, thấp hơn so với nghiệm thức 2 và 3 và khác biệt có ý nghĩa thống kê. Nghiệm thức 2 và 3 có số chồi trung bình lần lượt là 8,33 và 7,33 chồi, khác biệt không có ý nghĩa thống kê, tuy nhiên tốc độ nảy mầm ở nghiệm thức 3 chậm hơn và chiều cao chồi thấp hơn nghiệm thức 2.
Sau bốn tuần lưu trữ, khả năng nảy mầm các hạt nhân tạo cỏ ngọt vẫn còn khá tốt, tỉ lệ nảy mầm đều đạt trên 90%. Số chồi nghiệm thức 2 hình thành đạt trung bình là 8,33, cao hơn các nghiệm thức còn lại và khác biệt có ý nghĩa thống kê. Nghiệm thức 3 và 4 lần lượt đạt số chồi trung
bình là 7,0 và 6,33, thấp nhất là nghiệm thức 1 đạt trung bình 4,67 chồi và khác biệt có ý nghĩa thống kê với các nghiệm thức còn lại (Hình 1 và 2). Nhiều nghiên cứu cho thấy môi trường Na- Alginate phù hợp cho sự tạo hạt nhân tạo đối với nhiều loại cây như ba gạc bốn lá (Rauvolfia tetraphylla L.) (Faisal et al., 2006), lựu (Punica granatum L.) (Naik and Chand, 2006), ngải cứu (Artemisia vulgaris) (Sujatha and Kumari, 2008).
Do đó, nghiệm thức 2 là môi trường Na-Alginate 3% có bổ sung MS thích hợp để tạo hạt nhân tạo cỏ ngọt.
1) Ảnh hưởng của chất kích thích sinh trưởng lên khả năng nảy mầm của hạt nhân tạo: Việc bổ sung chất điều hòa sinh trưởng và chất dinh dưỡng cho hạt là một yếu tố cần thiết cho sự thành công của kĩ thuật tạo hạt nhân tạo, tăng khả năng nảy mầm và sống sót cho hạt (Rihan et al., 2017).
Sau hai tuần lưu trữ, hạt nhân tạo nảy mầm ở nghiệm thức 1 có giá thể là môi trường MS đạt tỉ lệ khá cao 75% và khác biệt thống kê so với các nghiệm thức còn lại, ngoại trừ nghiệm thức 2 có giá thể là môi trường MS bổ sung 0,5 mg/L BA có tỉ lệ nảy mầm 50%. Nghiệm thức 4 có giá thể là môi trường MS bổ sung 0,5 mg/L BA và 0,5 mg/L NAA có tỉ lệ nảy mầm là 41,67%, thấp hơn môi trường không có bổ sung chất kích thích sinh trưởng hoặc môi trường MS có bổ sung 0,5mg/L BA. Trong khi đó, môi trường MS có bổ sung 0,5mg/L NAA có phần trăm tỉ lệ nảy mầm thấp nhất, chiếm 8,33% (Bảng 2).
Bên cạnh đó, chất kích thích sinh trưởng cũng ảnh hưởng đến khả năng hình thành chồi. Tuy nhiên, trong nghiên cứu này, môi trường không bổ sung chất kích thích sinh trưởng cho kết quả tốt nhất (5 chồi), cao hơn môi trường bổ sung BA hoặc NAA. Khi bổ sung BA, NAA vào môi trường ở dạng riêng lẻ hoặc kết hợp, số chồi giảm một cách đáng kể, cụ thể, giảm 2 chồi (MS + 0,5mg/L BA), giảm 2,67 chồi cho môi trường MS có bổ sung BA và NAA ở dạng kết hợp và giảm hơn 4 chồi đối với môi trường MS + 0,5mg/L NAA sau hai tuần lưu trữ.
Các hạt nhân tạo cỏ ngọt vẫn có khả năng nảy mầm ở môi trường MS có bổ sung 0,5mg/L BA hoặc 0,5mg/L BA + 0,5mg/L NAA như sau:
91,67% ở môi trường có chứa 0,5mg/L BA và
Bảng 1. Ảnh hưởng của hàm lượng MS lên khả năng nảy mầm của hạt nhân tạo đối với cỏ ngọt (Stevia rebaudiana)
Hình 1: Sự nảy mầm của hạt nhân tạo cỏ ngọt đối với các môi trường tạo hạt khác nhau sau hai tuần lưu trữ: a. Na-Alginate 3%; b. Na-Alginate 3% + MS; c. Na-Alginate 3% + 12 MS; d. Na-Alginate 3% + 14 MS.
Hình 2: Sự nảy mầm của hạt nhân tạo cỏ ngọt đối với các môi trường tạo hạt khác nhau sau bốn tuần lưu trữ: a. Na-Alginate 3%; b. Na-Alginate 3% + MS; c. Na-Alginate 3% + 12 MS; d. Na-Alginate 3% + 14 MS
83,33% đối với môi trường không có bổ sung chất kích thích sinh trưởng. Tuy nhiên, tỉ lệ nảy mầm này giảm một cách đáng kể khi hạt được nuôi cấy trong môi trường có bổ sung 0,5mg/L BA + 0,5mg/L NAA và khi môi trường nuôi cấy chỉ bổ sung NAA thì tỉ lệ phần trăm nảy mầm của hạt hầu như không tìm thấy sau bốn tuần lưu trữ.
Theo Nower (2014), nồng độ BA 0,5 – 1,0 mg/L là thích hợp cho sự nhân chồi cỏ ngọt, tuy nhiên nghiên cứu này cho thấy thời gian lưu trữ vị trí chọn chồi nách (nghiệm thức 1) ảnh hưởng đến sự tái sinh chồi của hạt (nghiệm thức 2, 3 và 4).
Nower (2014) cũng cho rằng khi so sánh sự phát triển của cỏ ngọt trên nhiều loại môi trường khác nhau thì môi trường MS phù hợp hơn.
Môi trường không có chất kích thích sinh trưởng cho kết quả khá tốt như các chồi mới phát triển tốt, sinh trưởng bình thường. Đối với môi trường MS có bổ sung 0,5mg/L BA, chồi mới hình thành có hiện tượng thủy tinh hóa, cây con hình thành bị mọng nước. Đối với môi trường MS có bổ sung 0,5mg/L NAA, các hạt bị hóa nâu tạo thành callus nhưng không tạo chồi sau bốn tuần lưu trữ. Trong khi đó, môi trường MS có bổ sung 0,5mg/L BA + 0,5 mg/L NAA, các hạt phát triển nhưng có xu hướng tạo thành cụm callus do đó ít chồi được hình thành. Vì thế, môi trường MS được
Bảng 2. Ảnh hưởng các chất kích thích sinh trưởng lên sự nảy mầm hạt cỏ ngọt trên môi trường MS có bổ sung BA, NAA riêng lẻ hoặc có sự kết hợp
Hình 3: Sự nảy mầm của hạt nhân tạo cỏ ngọt trên các loại giá thể khác nhau sau hai tuần lưu trữ:
a. MS; b. MS + 0,5 mg/L BA; c. MS + 0,5 mg/L NAA; d. MS + 0,5 mg/L BA + 0,5 mg/L NAA.
xem là phù hợp cho sự nảy mầm của hạt nhân tạo cỏ ngọt.
Hình 4: Sự nảy mầm của hạt nhân tạo cỏ ngọt trên các loại giá thể khác nhau sau bốn tuần lưu trữ:
a. MS; b. MS + 0,5 mg/L BA; c. MS + 0,5 mg/L NAA; d. MS + 0,5 mg/L BA + 0,5 mg/L NAA.
2) Ảnh hưởng thời gian lưu trữ lên khả năng nảy mầm của hạt nhân tạo: Thời gian lưu trữ là một trong các yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến khả năng nảy mầm của hạt. Sau hai tháng lưu trữ, hạt cỏ ngọt khi được cho nảy mầm lên giá thế MS có tỉ lệ nảy mầm đạt 86,67%, số chồi tạo ra trung bình là 16,33 và cả hai chỉ tiêu đều khác biệt có ý nghĩa thống kê so với sau ba tháng và bốn tháng lưu trữ. Các hạt sau hai tháng nảy mầm và chồi mới hình thành phát triển tốt, cây khỏe.
Sau ba tháng lưu trữ, khả năng nảy mầm đã giảm một phần tỉ lệ đạt 66,67% và số chồi trung bình tạo ra là 13,00 chồi. Các chồi mới hình thành tạo số chồi ít hơn so với hai tháng nhưng các hạt vẫn phát triển sinh trưởng bình thường.
Bảng 3. Ảnh hưởng thời gian lưu trữ lên sự nảy mầm hạt cỏ ngọt ở 4oC
Sau bốn tháng lưu trữ, tỉ lệ nảy mầm của hạt nhân tạo cỏ ngọt là 50% và số chồi trung bình là 10, thấp hơn so với sau hai và ba tháng lưu trữ. Tốc
Hình 5: Sự nảy mầm hạt nhân tạo cỏ ngọt sau thời gian lưu trữ ở 4oC: a. 2 tháng; b. 3 tháng; c. 4 tháng
độ nảy mầm của hạt có chậm hơn so với hai và ba tháng, chiều cao chồi thấp hơn.
Nghiên cứu đối với hạt nhân tạo cỏ ngọt này cho thấy thời gian lưu trữ lâu hơn so với nghiên cứu của Ray và Bhattacharya (2008) thực hiện trên cây ba gạc (Rauvolvia serpentine), chỉ hơn ba tháng lưu trữ ở 4oC. Theo nghiên cứu của Nower (2014), hạt cỏ ngọt được tạo từ môi trường MS sau năm tuần lưu giữ có tỉ lệ nảy mầm chỉ 69,53%. Ngày nay, nghiên cứu về bảo quản hạt nhân tạo và kỹ thuật rất ít, cần phải có nhiều nghiên cứu hơn nữa vì tiềm năng to lớn của hạt nhân tạo như dễ dàng lưu trữ nguồn gen và tiết kiệm được chi phí (Rihan et al., 2017). Các hạt nhân tạo cỏ ngọt vẫn còn khả năng nảy mầm, phát triển tốt sau bốn tháng lưu trữ.
IV. KẾT LUẬN
Môi trường tạo hạt nhân tạo thích hợp với cỏ ngọt là Na-Alginate 3% bổ sung MS sau hai và bốn tuần lưu trữ tỉ lệ hạt nảy mầm là 100% và số chồi trung bình tạo thành là 8,33. Giá thể thích hợp cho sự nảy mầm của hạt nhân tạo cỏ ngọt là môi trường MS, sau hai và bốn tuần lưu trữ tỉ lệ hạt nảy mầm là 86,67% và 66,67%; số chồi trung bình tạo thành đều là 5,0. Thời gian làm ảnh hưởng đến sự lưu trữ hạt nhân tạo cỏ ngọt, các hạt bị khô và khó tái sinh hơn. Sau hai, ba và bốn tháng lưu trữ tỉ lệ hạt nảy mầm tương ứng là 86,67; 66,67 và 50%;
số chồi trung bình tạo thành tương ứng là 16,33;
13,0 và 10,0
LỜI CẢM ƠN
Xin chân thành cảm ơn Trung tâm Công nghệ Sinh học và Sở Khoa học & Công nghệ tỉnh An Giang đã tạo điều kiện và hỗ trợ để thực hiện nghiên cứu này.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
[1] Ara, H.; Jaiswal, U.; Jaiswal, V (2000). Syn- thetic seed: Prospects and limitation.Curr. Sci, 78:
1438–1444.
[2] Faisal, M.; Ahmad, N. and Anis, M (2006). In vitro plant regeneration from alginateencapsulated micro- cuttings ofRauvolfia tetraphylla L. Am. Eurasian J.1:
1–6.
[3] Gray, D.J.; Purohit, A.; Triglano, R.N. (1991). So- matic embryogenesis and development of synthetic seed technology.Crit. Rev. Plant Sci. 10, 33–61.
[4] Hail Z. Rihan, Fakhriya Kareem, Mohammed E.
El-Mahrouk and Michael P. Fuller (2017) Artificial seeds (principle, aspects and applications). Agron- omy, 15, 71-86.
[5] K. Ramesh, Virendra Singh and Nima W. Megeji.
2006 . Cultivation of Stevia [Stevia rebaudiana (Bert.) Bertoni]: A Comprehensive Review.Advances in Agronomy. Vol 89, (137–177).
[6] Naik, S.K.; Chand, P.K (2006) Nutrient-alginate encapsulation of in vitro nodal segments of pomegranate (Punica granatum L.) for germplasm distribution and exchange.Sci. Hortic, 108, 247–252.
[7] Nower A.A. 2014. In vitro propagation and synthetic seeds production: an eficient methods for Stevia re- baudiana Bertoni.Sugar Tech. 16(1): 100-108.
[8] Pennycooke, J.C.; Towill, L.E. (2001). Medium al- terations improve regrowth of sweet potato (Ipomoea batatas (L.) Lam.) shoot tips cryopreserved by vitri- fication and encapsulation-dehydration.Cryoletters, 22, 381–389.
[9] Ray, A. and Bhattacharya, S (2008) Storage and plant regeneration from encapsulated shoot tips of Rau- volfia serpentine—An effective way of conservation and mass propagation.S. Afr. J. Bot. 74: 776–779.
[10] Rihan, H.Z.; Al-Issawi, M.; Burchett, S.; Fuller, M.P.
(2011). Encapsulation of cauliflower (Brassica ol- eracea var botrytis) microshoots as artificial seeds and their conversion and growth in commercial sub- strates.Plant Cell Tissue Organ Cult, 107, 243–250.
[11] Sujatha, G.; Kumari, B.D.R (2008) Micropropaga- tion, encapsulation and growth of Artemisia vul- garis node explants for germplasm preservation.
S.Afr.J.Bot, 74, 93–100.
[12] Tôn Nữ Liên Hương, Võ Hoàng Duy, Dương Mộng Hòa, Đỗ Duy Phúc và Nguyễn Duy Thanh. Chiết xuất Stevioside từ cây cỏ ngọt (Stevia rebaudiana Bertoni).Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ:
36 (2015): 73-76.
