CỦA MỘT SỐ HỆ VI SINH VẬT BẢN ĐỊA THU THẬP TỪ ĐẤT Ở CÁC MÔ HÌNH CÂY TRỒNG KHÁC NHAU THUỘC
TỈNH SÓC TRĂNG
Lê Thị Xã1, Nguyễn Khởi Nghĩa2
SURVEYING SOME PLANT BENEFICIAL FUNCTIONS OF SOME INDIGENOUS MICROORGANISM COMMUNITIES FROM DIFFERENT
CROPPING SYSTEMS IN SOC TRANG PROVINCE
Le Thi Xa1, Nguyen Khoi Nghia2
Tóm tắt – Nghiên cứu khảo sát và đánh giá một số chức năng có lợi đối với cây trồng của 15 hệ vi sinh vật bản địa (IMO) từ đất canh tác các cây trồng khác nhau ở tỉnh Sóc Trăng như cố định đạm, hòa tan lân, tổng hợp IAA và đối kháng nấm bệnh gây hại cây trồng. Khả năng cố định đạm, hòa tan lân và tổng hợp IAA được xác định lần lượt bằng phương pháp so màu thuốc thử nitroprusside, molybdate và Salkowski. Hai dòng nấm gây bệnh gồm Fusarium oxysporum và Rhizoctonia solani được sử dụng để khảo sát khả năng đối kháng ở điều kiện phòng thí nghiệm. Kết quả cho thấy 15 hệ vi sinh vật bản địa có khả năng cố định đạm, hòa tan lân và tổng hợp IAA lần lượt dao động từ 0,11 đến 6,41 mg/L NH+4, từ 347 đến 2011 mg/L P2O5 và từ 9,23 đến 56,58 mg/L IAA. Ngoài ra, kết quả khảo sát còn cho thấy, chúng có hiệu quả cao trong việc đối kháng với hai dòng nấm gây bệnh cây trồng, với hiệu quả ức chế dao động từ 34,63% đến 85,46% đối với nấm F.
oxysporum và từ 52,96% đến 92,59% đối với nấm R. solani. Tóm lại, cả 15 hệ vi sinh vật bản địa khảo sát có nhiều chức năng có lợi cho cây trồng.
1Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Cần Thơ
2Bộ môn Khoa học Đất, Khoa Nông nghiệp, Trường Đại học Cần Thơ
Email: nknghia@ctu.edu.vn
Do đó, chúng ta có thể ứng dụng bổ sung nguồn vi sinh vật hữu ích cho cây trồng.
Từ khóa: cố định đạm, đối kháng sinh học, hệ vi sinh vật bản địa, hòa tan lân, tổng hợp IAA.
Abstract – The aim of this study was to sur- vey and evaluate some plant beneficial functions of fifteen indigenous microorganism communities (IMOC) collected from different cropping sys- tems within Soc Trang province such as nitrogen fixation, phosphate solubilization, IAA synthesis and antagonistic efficacy. Nitrogen fixation, phos- phate solubility and IAA synthesis capacity of IMOs were determined by nitroprusside, molyb- date and Salkowski reagent method, respectively.
Fusarium oxysporum and Rhizoctonia solani were acted as plant pathogenic fungi and used to inves- tigate antagonistic capacity of 15 IMOCs against these two pathogenic fungi under the laboratory condition. The results showed that all 15 surveyed IMOCs were able to fix biologically nitrogen from the air, to solubilize phosphate and to synthesize IAA with an extent varied between0.11 and 6.41 mg/L NH+4., between 347 and 2011 mg/L P2O5 and between 9.23 and 56.58 mg/L IAA, respec- tively. In addition, all 15 surveyed IMOCs were found to have a very high potential in bio-control against two model plant pathogenic fungi, with
an extent of antagonistic efficacy ranged from 34.63% to 85.46% for F. oxysporum and from 52.96% to 92.59% for R. solani. In conclusion, the finding results of this study imposed that all 15 surveyed IMOCs possessed many plant beneficial functions and thus they can be exploited for plants as one of microbial fertilizer sources.
Keywords: Antagonistic, IAA synthesis, indigenous microorganism, nitrogen fixation, phosphate solubilization.
I. GIỚI THIỆU
Hiện nay, phương thức canh tác nông nghiệp bền vững, thân thiện với môi trường sinh thái và thích ứng với biến đổi khí hậu được quan tâm và ưu tiên hàng đầu. Trong nông nghiệp bền vững, áp dụng vi sinh vật kích thích sinh trưởng cây trồng (Plant Growth Promotion Microoganisms-PGPM) kết hợp với phân bón hóa học ở mức độ thích hợp được khuyến khích sử dụng để đạt được những lợi ích tối đa. Vi sinh vật kích thích sinh trưởng cây trồng đặc biệt là các vi sinh vật có nguồn gốc bản địa có vai trò quan trọng trong việc kích thích sinh trưởng cây trồng cũng như cải thiện độ màu mỡ của đất vì những vi sinh vật có nguồn gốc bản địa có khả năng thích nghi cao, sinh trưởng tốt nhất, tồn tại và sống sót tốt dưới các điều kiện bất lợi của đất đai và khí hậu của địa phương. Do đó, hiệu quả của chúng trong kích thích sinh trưởng cây trồng cao (Reddy, 2011).
Cho Han Kyu, Hàn Quốc, là người đầu tiên đưa ra khái niệm vi sinh vật bản địa (indigenous microorganisms-IMO), bao gồm tập hợp những vi sinh vật thu được bằng phương pháp bẫy các vi sinh vật trong đất bằng cách sử dụng gạo nấu chín làm nguồn dinh dưỡng dẫn dụ, trong đó bao gồm có nấm, vi khuẩn, xạ khuẩn... (Kyu and Koyama, 1997; Reddy, 2011). IMO có tiềm năng trong việc làm phân bón sinh học, ủ phân compost sinh học, phân hủy sinh học, hòa tan lân, cố định đạm, tổng hợp hormone thực vật và đối kháng sinh học (Kumar and Gopal, 2015). Trên thực tế, những tác động tích cực của IMO đối với các tính chất vật lí, hóa học và sinh học của đất và hoạt động của enzyme đất, sức khỏe của đất và năng suất cây trồng đã được chứng minh bởi nhiều nghiên cứu trước đó (Pham and Dok, 2009; Sumathi et al.,
2012; Koon et al., 2013; Mbouobda et al., 2013;
Hermann et al., 2013). Ngoài ra, việc áp dụng IMO làm gia tăng sự sinh trưởng và phát triển của cây như giúp hạt nảy mầm sớm hơn, tăng số lá, tăng năng suất hạt và tăng hàm lượng chất diệp lục trong lá (Sekhar and Gopal, 2013; Koon et al., 3013). Chiemela et al. (2013) chỉ ra rằng ứng dụng IMO trong nông nghiệp là phương pháp thân thiện với môi trường và giúp tăng cường phân hủy chất hữu cơ, dinh dưỡng cho cây, tăng độ phì của đất, năng suất cây trồng và khả năng kháng bệnh của cây. Tóm lại, việc tận dụng nguồn IMO trong sản xuất nông nghiệp mang lại nhiều lợi ích cho cây trồng, đất và con người. Tuy nhiên, các nghiên cứu cơ bản về các chức năng có lợi đối với cây trồng của IMO ít được nghiên cứu và chứng minh. Do đó, nghiên cứu này được thực hiện nhằm khảo sát và đánh giá một số chức năng có lợi đối với cây trồng của các hệ vi sinh vật bản địa.
II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
A. Thu thập các hệ vi sinh vật bản địa (IMO) từ đất trong các mô hình canh tác cây trồng khác nhau ở khu vực tỉnh Sóc Trăng
IMO được thu thập theo phương pháp của Kyu and Koyama (1997). Tóm tắt quy trình thu như sau: Cho 1 kg gạo nấu chín để nguội vào rổ nhựa vuông có kích thước 25 x 15 x 8 cm. Dùng vải mùng và dây buộc để bao xung quanh rổ chứa cơm. Sử dụng giá đào hố đất với chiều sâu, chiều dài và chiều rộng tương ứng với kích thước của rổ.
Đặt rổ vào trong hố đất, phủ lên trên rổ cơm bằng xác lá cây và đất hiện diện tại vị trí đặt mẫu. Sau ba ngày ủ, tiến hành thu rổ cơm, khi đó, vi sinh vật phát triển khắp bề mặt cơm và cho cơm vào bình thủy tinh có nắp đậy. Nguồn vi sinh vật này được gọi là IMO1. Tiến hành trộn đều đường mía (đã đun sôi để nguội) với IMO1 theo tỉ lệ 1:1 (w/w) cho đến khi hỗn hợp chuyển thành dạng sánh đặc và đồng nhất. Cho nguồn vi sinh vật này vào trong bình thủy tinh, dùng vải mùn đậy nắp bình và các bình chứa mẫu được để yên ở nơi thoáng mát trong một tuần nhằm giúp lên men nhân sinh khối vi sinh vật chứa trong mẫu cơm vừa thu thập. Mẫu chứa vi sinh vật sau khi lên men một tuần được gọi là IMO2.
B. Đánh giả khả năng cố định đạm của các hệ IMO2 thu thập
Cân 10 gam mẫu IMO2 cho vào chai thủy tinh 250 mL có chứa sẵn 90 ml buffer phosphate.
Mẫu được lắc đều trên máy lắc, sau đó hút 1 mL dung dịch mẫu cho vào bình tam giác 100 mL tiệt trùng có chứa 50 mL dung dịch môi trường Burk’s lỏng đã được tiệt trùng. Các bình tam giác chứa mẫu được lắc trên máy lắc tròn với tốc độ 90 vòng/phút trong năm ngày. Sau đó, chúng tôi tiến hành chuyển 1 mL dung dịch huyền phù vi khuẩn nuôi cấy sang bình tam giác 100 mL mới chứa dung dịch môi trường Burk’s mới. Chúng tôi lặp lại toàn bộ quy trình nuôi cấy này thêm một lần nữa. Nguồn vi sinh vật sau ba thế hệ nuôi cấy liên tục được sử dụng để bố trí thí nghiệm.
Thí nghiệm được bố trí với ba lần lặp lại tương ứng với ba bình tam giác cho mỗi hệ vi sinh vật và được thực hiện như sau: chủng 0,5 mL dịch huyền phù vi sinh vật gốc được nhân nuôi trong môi trường nuôi cấy lỏng ở thế hệ thứ ba vào bình tam giác 100 mL tiệt trùng có chứa 14,5 mL môi trường Burk’s lỏng (không chứa đạm) và nghiệm thức đối chứng âm không bổ sung vi khuẩn. Các bình tam giác chứa mẫu được lắc trên máy lắc tròn với tốc độ 90 vòng/phút. Tiến hành định lượng hàm lượng NH4+ trong môi trường nuôi cấy lỏng do vi sinh vật cố định vào 0, 1, 2, 3, 4 và 5 ngày sau khi nuôi cấy bằng phương pháp so màu thuốc thử nitroprusside ở bước sóng 650 nm dựa theo phương pháp của Keny and Nelson (1982).
C. Đánh giá khả năng hòa tan lân của các hệ IMO2 thu thập
Cân 10 gam mẫu IMO2 cho vào chai thủy tinh 250 mL có chứa sẵn 90 mL nước cất tiệt trùng.
Các chai chứa mẫu được lắc đều trên máy lắc trong một giờ. Sau đó, mẫu được để yên trong năm phút ở điều kiện phòng thí nghiệm, tiến hành hút 1 mL dung dịch vi sinh vật cho vào bình tam giác 100 mL có chứa sẵn 49 mL môi trường NBRIP lỏng.
Mỗi hệ IMO2 được thực hiện với ba lần lặp lại và tương ứng với ba bình tam giác. Các bình tam giác chứa mẫu được lắc trên máy lắc tròn với tốc độ 90 vòng/phút trong tối ở điều kiện phòng thí nghiệm.
Hàm lượng lân hòa tan trong môi trường nuôi cấy
lỏng được xác định vào các thời điểm: 0, 1, 2, 3, 5, 7, 9, 15 và 20 ngày nuôi cấy bằng phương pháp hiện màu Molybdate đo ở bước sóng 880 nm.
D. Đánh giá khả năng tổng hợp IAA của các hệ IMO2 thu thập
Hút 1 mL dung dịch huyền phù vi sinh vật đã được chuẩn bị với buffer phosphate như ở mục 2.2 cho vào bình tam giác 100 mL chứa sẵn 30 mL môi trường NBRIP lỏng có bổ sung 100 mg.L−1 tryptophan. Thí nghiệm được thực hiện với ba lần lặp lại cho mỗi hệ IMO2 và tương ứng với ba bình tam giác cho mỗi hệ IMO2. Các bình tam giác chứa mẫu được nuôi trên máy lắc tròn với tốc độ 90 vòng/phút trong tối và ở điều kiện phòng thí nghiệm. Hàm lượng IAA tổng hợp bởi vi sinh vật trong môi trường nuôi cấy lỏng được xác định vào các thời điểm: 0, 1, 2, 3, 5, 6, 8 và 10 ngày nuôi cấy. Khả năng tổng hợp IAA của vi sinh vật trong các hệ IMO2 được xác định theo phương pháp của Brick et al., (1991).
E. Đánh giả khả năng đối kháng với nấm gây bệnh cây trồng Fusarium oxysporum và Rhizoc- tonia solani của các hệ IMO2 thu thập
Hai dòng nấm gây bệnh cây trồng được sử dụng trong nghiên cứu này làFusarium oxysporum và Rhizoctonia solanigây bệnh héo xanh trên cây mè và gây bệnh thối rễ trên hành lá được cung cấp bởi Bộ môn Bảo vệ Thực vật, Khoa Nông nghiệp, Trường Đại học Cần Thơ.
Đối với nấm F. oxysporum, hoạt động đối kháng sinh học của các hệ IMO2 thu thập được khảo sát trên môi trường PDA với ba kiểu bố trí thí nghiệm khác nhau: (1) IMO2 vàF. oxysporum được bố trí cùng lúc trên môi trường PDA và khoảng cách giữa hai đối tượng là 4 cm; (2) IMO2 được chủng trước hai ngày so với nấm F.
oxysporum và (3) IMO2 được chủng sau nấm F.
oxysporum hai ngày. Đối với nấm R. solani, chỉ có hai kiểu bố trí thí nghiệm được áp dụng cho dòng nấm R. solani: (1) IMO2 vàR. solani được bố trí cùng lúc trên đĩa môi trường PDA và khoảng cách giữa hai đối tượng là 4 cm và (2) IMO2 được chủng trước nấmR. solanihai ngày.
Hiệu suất đối kháng của IMO2 chống lại nấm F. oxysporumvàR. solaniđược đánh giá bằng kĩ
thuật cấy đối xứng hai bên (Vincent, 1947). Phần trăm ức chế nấm bệnh được tính theo công thức:
H(%) = [(Dc−Dt)/Dc]×100
Trong đó: H: tỉ lệ ức chế, Dc: trung bình đường kính đối chứng, Dt: trung bình đường kính của nấm bệnh khi xử lí IMO.
F. Phân tích số liệu
Số liệu được phân tích bằng phần mềm MINITAB 16.2.
III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN A. Thu thập IMO
Mười bốn IMO đã được thu thập ở tỉnh Sóc Trăng và một IMO được tạo ra từ hỗn hợp của tất cả mười bốn hệ vi sinh vật này. Các hệ IMO được thu thập từ đất trồng tre, đất luân canh (bắp, dưa hấu, bí ngô), đất trồng chuối, hành tím, rau xà lách, lúa, dưa hấu, đồng cỏ, bắp, rau húng huế, cam, bưởi, ổi và mía ở tỉnh Sóc Trăng, Việt Nam.
B. Khả năng hòa tan lân của các hệ IMO2 thu thập
Kết quả nghiên cứu về khả năng hòa tan lân khó tan của 15 IMO trong Hình 1 cho thấy khả năng hòa tan tricalcium phosphate Ca3(P O4)2
tạo thành phosphate hòa tan (P2O5) của các IMO khác biệt nhau có ý nghĩa thống kê (p<0.01). Hàm lượng phosphate hòa tan dao động mạnh từ 210 mg/L đến 2.372 mg/L. Hai trong số 15 IMO được thử nghiệm đã hòa tan hơn 2.000 mg/L P2O5 sau 20 ngày nuôi cấy và 10 trong số 15 IMO có khả năng giải phóng hơn 1.000 mg/L P2O5 trong thời gian khảo sát. Cụ thể, hai IMO thu thập từ đất luân canh rau màu và đất cỏ hoang hòa tan tricalcium phosphate tốt nhất với lượng P2O5 hòa tan được tạo thành trong môi trường lỏng tương ứng là 2.372 mg/L và 2.011 mg/L. Khả năng hòa tan lân xếp thứ ba là IMO thu thập từ đất trồng dưa hấu với hàm lượng P2O5 hòa tan cao nhất là 1.901mg/L.
Ngược lại, ba hệ vi sinh vật bản địa thu thập từ đất trồng tre, chuối và đất trồng lúa có khả năng hòa tan tricalcium phosphate thấp nhất, với lượng P2O5 hòa tan cao nhất tương ứng là 510, 347 và 211 mg/L. Trong khi đó, 10 hệ vi sinh vật bản địa
còn lại có khả năng hòa tan tricalcium phosphate và giải phóng P2O5 hòa tan dao động 1.160 – 1.738 mg/L.
Hình 1 cho thấy có sự khác biệt lớn về hàm lượng phosphate hòa tan trong môi trường lỏng giữa các IMO. Điều này có thể do một số IMO sở hữu vi khuẩn hoặc vi nấm có khả năng hòa tan Ca3(P O4)2và giải phóng P2O5tốt hơn. Đặc biệt, chức năng hòa tan phosphate của IMO hỗn hợp tốt hơn nhiều so với một số IMO đơn lẻ. Do đó, sự kết hợp của các IMO từ nhiều nguồn khác nhau là cần thiết để cho IMO có khả năng hòa tan phosphate tốt hơn (Reddy, 2011).
Hình 1: Nồng độ P2O5 hòa tan trong môi trường NPRIP của 15 IMO (n=3, p<0.01)
So với các nghiên cứu trước đây, kết quả nghiên cứu này cho thấy IMO có khả năng hòa tan và giải phóng lượng P2O5 cao hơn đáng kể. Wu et al. (2012) đã phân lập được một loại nấm hòa tan phosphate có hiệu quả cao từ đất vùng rễ với lượng tối đa 1.252 mg/L P2O5 trong 40 giờ trong môi trường lỏng chứa tricalcium phosphate (TCP) làm nguồn phosphate duy nhất. Tương tự, Tam et al.
(2016) đã phân lập được 25 chủng nấm và đánh giá khả năng hòa tan Ca3(P O4)2trong môi trường lỏng. Kết quả cho thấy, những dòng nấm phân lập này có thể hòa tan phosphate chỉ khoảng 37,25 mg/L đến 494,41 mg/L P2O5. Ngoài ra, Walpola and Yoon (2013) đã phân lập được vi khuẩn hòa tan phosphate trong đất ở Hàn Quốc với khả năng hòa tan lân tối đa ở mức 720,75 g/L. Saikrithika et al. (2016) đã đánh giá lượng hòa tan phosphate từ TCP của một chủng vi khuẩn được phân lập từ đất ủ phân trùn quế. Kết quả cho thấy, chúng có thể hòa tan tới 125 mg/L P2O5. Tương tự, Krishnaraj
and Dahale (2014) đã chỉ ra rằng 53 chủng vi sinh vật phân lập bao gồm vi khuẩn, nấm, xạ khuẩn có thể hòa tan và giải phóng từ 100 mg/mL đến 500 mg/mL P2O5. Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng, các vi sinh vật hòa tan lân có thể tiết ra nhiều loại axit hữu cơ phân tử thấp trong quá trình trao đổi chất, như axit malic, axit propionic, axit lactic, axit axetic và axit citric. Các anion axit hữu cơ này có thể phản ứng với các ion canxi trong môi trường lỏng để giải phóng P2O5 từ các photphat khó tan (Lin et al., 2001). Bên cạnh đó, một số enzyme ngoại bào, thậm chí là các muối amoni và muối nitrat... được vi khuẩn giải phóng vào môi trường lỏng, làm hòa tan TCP khó tan (Krishnaraj and Dahale, 2014). Tóm lại, tất cả IMO thu thập đều có tiềm năng lớn về khả năng hòa tan phosphate và hiệu quả hòa tan của các IMO này tương tự hoặc cao hơn các chủng nấm hoặc vi khuẩn phân lập tước đó.
C. Khả năng tổng hợp IAA
Kết quả nghiên cứu về khả năng tổng hợp IAA của 15 IMO được trình bày trong Bảng 2. Kết quả cho thấy các IMO khác nhau tổng hợp lượng IAA thay đổi đáng kể theo thời gian và khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa các IMO (p<0,01). Khả năng tổng hợp IAA của IMO được tổng hợp rất sớm (một ngày sau nuôi cấy). Hàm lượng IAA tổng hợp của các IMO dao động mạnh từ 9,23 đến 56,6 mg/L. Lượng IAA cao nhất được quan sát thấy sau hai ngày chủng và được tìm thấy ở IMO thu thập từ ruộng lúa với nồng độ là 56,58 mg/L và thời điểm các IMO đạt nồng độ IAA cao nhất là rất khác nhau. Khả năng tổng hợp IAA cao thứ hai thuộc về IMO thu thập từ đất trồng bắp với nồng độ IAA là 43,85 mg/L. IMO thu thập từ đất trồng cam và IMO hỗn hợp cùng nhau chia sẻ vị trí thứ ba về khả năng tổng hợp IAA với lượng tương ứng là 41,77 mg/L và 42,62 mg/L. Các IMO còn lại có nồng độ IAA tổng hợp được dao động trong khoảng 10,71 mg/L đến 38,77 mg/L. Khả năng tổng hợp IAA thấp nhất đã được tìm thấy trong IMO thu thập từ đất luân canh cây trồng, đất trồng chuối và đất trồng rau xà lách tương ứng với 9,66 mg/L, 9,23 mg/L và 10,74 mg/L được tổng hợp tương ứng. Đáng chú ý là khi phối trộn với nhau tạo IMO hỗn hợp lượng IAA do hệ vi sinh vật hỗn
hợp này tạo ra khá tốt và ổn định trong thời gian khảo sát.
So với các kết quả nghiên cứu trước đây của Ahmad et al. (2005), khi khảo sát khả năng tổng hợp IAA trong môi trường chứa tryptophan (0, 1, 2 và 5 mg/L) của 10 chủng Azotobacter sp., 11 chủng Pseudomonas sp., kết quả nghiên cứu này cho thấy 7 chủng Azotobacter cho khả năng tổng hợp IAA cao (7,3 đến 32,8 mg/L) khi thêm 5 mg/mL tryptophan, trong khi các dòng Pseu- domona sp. có khả năng tổng hợp từ 41,0 mg/L đến 53,2 mg/L IAA. Hơn nữa, Ahmad et al. (2008) đã phân lập và khảo sát vi khuẩn vùng rễ sống tự do cho thấy khả năng tổng hợp IAA cao nhất của chúng khi môi trường nuôi cấy được bổ sung 500 µg/mL tryptophan và lượng IAA dao động trong khoảng 7,03µg/mL đến 22,02µg/mL.
D. Khả năng cố định đạm của các IMO
Kết quả khảo sát về nồng độ NH+4 tổng số của các IMO cho thấy có sự khác biệt đáng kể giữa IMO về khả năng cố định đạm (p <0,01) và thời gian xuất hiện nồng độ NH+4 cực đại trong môi trường Burks lỏng rất khác nhau. Trong nghiên cứu này, tám IMO có khả năng cố định hơn 1 mg/L NH+4 và lượng NH+4 tối đa cố định trong môi trường lỏng là 6,48 mg/L được tìm thấy ở IMO từ đất trồng tre sau ba ngày chủng. Lượng nitơ được cố định bởi IMO tương đối thấp và khả năng cố định nitơ của từng IMO không chỉ khác nhau giữa IMO mà còn dao động đáng kể trong thời gian chủng.
Davis et al. (1964) đã đánh giá vi khuẩn Pseu- domonas methanitrificans có thể cố định 70 mg/L nitơ trong trong hai tháng. Thavasi et al. (2006) cũng chỉ ra rằng vi khuẩn Azotobacter chroococ- cumphân lập từ môi trường biển bị nhiễm dầu thô có thể cố định được 4,2 mg/L nitơ trong 96 giờ.
Mazumdar and Deka (2013) đã đánh giá lượng nitơ cố định bởi vi khuẩn cố định đạm sống tự do được phân lập từ đất bị nhiễm dầu thô dao động từ 9,74 mg/L đến 17,45 mg/L trong khoảng thời gian hai tháng. Tương tự, Smita and Goyal (2017) đã báo cáo rằng lượng nitơ cố định bởi vi khuẩn cố định đạm sống tự do từ đất kiềm được tìm thấy là cao nhất sau 9 – 12 ngày nuôi cấy, với nồng độ nitơ tổng dao động từ 14,44µg/mL đến 18,73µg/mL.
Bảng 1: Nồng độ IAA (mg/L) trong môi trường NBRIP theo thời gian của 15 IMO khảo sát
So với các nghiên cứu trước đây, chúng tôi thấy rằng khả năng cố định nitơ của IMO thấp hơn nhiều so với các chủng phân lập đơn lẻ và hàm lượng NH4+ thay đổi tăng giảm trong quá trình nuôi cấy. Điều này có thể giải thích do các nhóm vi khuẩn tiêu thụ nitơ, đặc biệt là các nhóm khử nitơ trong mỗi IMO có thể làm giảm nitơ bằng cách chuyển NH+4 hoặc NO3- thành các dạng nitơ khác như khí NO, N2O và N2. Điều này cũng giải thích cho sự biến động mạnh mẽ của hàm lượng NH+4 tổng số trong môi trường Burks lỏng theo thời gian nuôi cấy và sự tồn tại các hoạt động cạnh tranh của hai nhóm vi sinh vật: cố định nitơ và tiêu thụ nitơ trong tất cả IMO (Robertson and Groffman, 2015). Mặc dù cả hai nhóm sinh vật sống tự do chỉ cố định một lượng nhỏ nitơ, chúng có thể quan trọng trong việc duy trì các cộng đồng trong hệ sinh thái tự nhiên (Hillel, 2007).
E. Tiềm năng đối kháng của IMO với nấm gây bệnh thực vật
Tiềm năng đối kháng của IMO với nấm Fusar- ium oxysporum
Kết quả nghiên cứu về hoạt động đối kháng của 15 IMO đối với nấmF. oxysporumđược trình bày trong Bảng 2 cho thấy tất cả 15 IMO được thử nghiệm đều có tác dụng đối kháng cao với F.
oxysporumvới mức độ khác nhau đáng kể. Trong ba kiểu bố trí, có thể thấy hiệu quả ức chế sợi nấm đã được ghi nhận như sau: IMO được chủng trên PDA hai ngày trước khi chủng nấmF. oxysporum>
IMO và nấmF. oxysporum được cùng lúc> IMO chủng sau nấmF. oxysporumhai ngày. Thí nghiệm IMO được ủ trước hai ngày so với F. oxysporum, bốn IMO thu thập từ tre, hành tím, bưởi và ổi thể hiện khả năng đối kháng cao nhất của chúng đối với F. oxysporum bằng cách phân hủy hoàn toàn sợi nấm của chủng nấm này (tỉ lệ ức chế là 100%).
Hơn nữa, IMO thu thập từ đất tre, bưởi và ổi có khả năng ngăn chặn sự phát triển củaF. oxysporumlên
Bảng 2. Hàm lượng đạm tổng số trong năm ngày nuôi cấy
đến 100% trong điều kiện IMO và nấm bệnh được chủng cùng một thời điểm và có thể ngăn chặn sự phát triển của F.oxysporum lên đến xấp xỉ 50%
ngay cả sau hai ngày ủ. IMO từ cỏ hoang có hiệu quả thấp nhất. Tuy nhiên, nếu được chủng cùng lúc hoặc trước nấm bệnh thì hiệu quả ức chế nấm cũng tăng đáng kể, từ 13,12% lên 38,79% trong thí nghiệm bố trí cùng thời điểm và 51,70% trong thí nghiệm IMO bố trí trước. Xu hướng tương tự được tìm thấy trong các IMO còn lại, với tỉ lệ ức chế nấm bệnh dao động từ 38% đến 67% trong thí nghiệm bố trí cùng thời điểm và từ 58,54% đến 81,19% trong thí nghiệm IMO bố trí trước so với F.oxysporum.
Từ kết quả trên có thể thấy rằng, tất cả IMO được khảo sát đều có tiềm năng lớn trong kiểm soát sinh học chống lại Fusarium oxyporum và IMO thu thập từ các đất trồng ổi và bưởi cho thấy hiệu quả cao nhất so với các loại khác. Chúng
có thể ngăn chặn sự phát triển của F. oxysporum lên đến khoảng 50% ngay cả khi mầm bệnh xuất hiện trước hai ngày và phân hủy hoàn toàn sợi nấm của nấm bệnh. Điều này có thể là do các vi sinh vật trong IMO bao gồm nấm, vi khuẩn và xạ khuẩn có thể tiết ra một số hợp chất hoặc enzyme phân hủy hoặc ức chế sự phát triển của sợi nấmF.
oxysporum(Xa and Nghia, 2019).
Stanojkovic-Sebic et al. (2017) chỉ ra rằng rất khó kiểm soát hoàn toàn các bệnh trong đất, đặc biệt là các dòng Fusarium gây ra bằng phương pháp hóa học. Sự không ổn định về tác dụng ức chế trong kiểm soát sinh học của mầm bệnh từ đất trong các điều kiện môi trường khác nhau được xem là một yếu tố hạn chế phổ biến. Gần đây, các nghiên cứu tập trung vào đánh giá hiệu quả của các cộng đồng vi sinh vật bản địa chống lại các mầm bệnh này từ đất. Một trong số đó, Huy et al.
(2017) khuyến cáo rằng, việc xử lí hạt giống bằng
Bảng 3: Hiệu quả đối kháng của 15 IMO đối với nấm gây bệnh F.oxysporum và R.solani
Trichoderma asperrellum kết hợp với phân bón sinh học khoảng 2-3 ngày trước khi trồng sẽ giúp cây phát triển tốt, ngăn ngừa bệnh cây và cho hiệu quả kiểm soát sinh học cao đối với mầm bệnh.
Nhìn chung, việc áp dụng IMO như một nguồn vi sinh vật có lợi cho cây trồng và có khả năng ức chế rất lớn đối vớiFusarium oxysporumvới tỉ lệ ức chế sợi nấm dao động trong khoảng 34,63%
đến 85,46%. Kết quả này tương tự các nghiên cứu trước đây của Yuliar et al. (2013), Dar et al. (2013), Toppo and Naik (2015), Stanojkovic- Sebic et al. (2017). Tóm lại, sự nhạy cảm của F.oxysporum với IMO cho thấy IMO có thể được sử dụng như một tác nhân kiểm soát nấm F.oxysporumgây bệnh. Trong trường hợp nấm gây bệnh xuất hiện trước, IMO có thể được sử dụng để điều trị nấm gây bệnh. Tuy nhiên, để có hiệu quả tốt hơn, IMO nên được xử lí trước để phòng ngừa nấm bệnh này. Hơn nữa, để đảm bảo hiệu quả cao nhất và ổn định của IOM cho các chức năng tốt này, một hỗn hợp nhiều IMO khác nhau là cần thiết.
Tiềm năng đối kháng của IMO với Rhizoctonia solani
Kết quả khảo sát khả năng đối kháng của 15 IMO đối với nấmRhizoctonia solanitrong trường hợp cả IMO và nấm đều được chủng cùng thời điểm cho thấy IMO có hiệu quả thấp trong việc ức chếR. solanivì sợi nấm bệnh phát triển phủ trên bề mặt đĩa Petri sau hai ngày ủ. Tuy nhiên, chúng không thể vượt qua vùng tăng trưởng của các IMO ngoại trừ IMO từ đất đồng cỏ và đất trồng cam.
Điều này có thể được giải thích bởi sự sinh trưởng nhanh chóng của R.solanidẫn đến IMO chưa kịp thời hình thành cơ chế đối kháng nấm bệnh. Kết quả này tương tự với Ghai et al (2007) khi khảo sát tính đối kháng sinh học của các chủng nấm phân lập cho thấy chúng đối kháng mạnh mẽ với nấmF. sclerotiumnhưng không ức chế đối với sự phát triền củaR. solani.
Tuy nhiên, trong trường hợp IMO được chủng trước hai ngày so với R.solani, hiệu quả ức chế tăng rất đáng kể và khác nhau giữa các IMO. Theo đó, sự tăng trưởng sợi nấm của Rhizoctonia bị ức
chế trong khoảng từ 52,96% đến 92,59%. Trong đó, hiệu quả ức chế cao nhất đối với nấm bệnh đã được quan sát thấy ở IMO ổi (hơn 92,59%), kế theo là IMO bưởi (88,19%), trong khi 13 IMO còn lại có tỉ lệ ức chế dao động khoảng 52,96%
– 71,11%. Đặc biệt trong cả hai trường hợp đối kháng nấmF.oxyvàR.sol, hệ vi sinh vật bản địa hỗn hợp cho thấy khả năng đối kháng khá tốt và ổn định trong các thời điểm bố trí.
Từ kết quả này, chúng ta có thể thấy rằng tất cả 15 IMO được thử nghiệm có hiệu quả đối kháng đối với nấm F. oxysporom cao hơn so với nấm Rhizoctonia; đồng thời, tác dụng ức chế của các IMO đối với cả hai dòng nấm này được chứng minh là hiệu quả hơn khi chủng IMO trước nấm bệnh. Điều này ngụ ý rằng IMO có thể được sử dụng để phòng ngừa các bệnh do nấm trong đất sinh ra như Fusarium solani và Rhizoctonia solani.
Kết quả của nghiên cứu này phù hợp với nghiên cứu của Ghai et al. (2007) và Robles-Yerena et al. (2010). Kết quả của họ cho thấy rằng khi nấm Ascomycete và nấm gây bệnh thực vật P. capsici được chủng cùng một lúc, sự tăng trưởng của sợi nấmP. capsicibị ức chế 53,1%. Khi Ascomycete được chủng trước ba ngày so với nấmP. capsici, khả năng ức chế đối với sự phát triển của sợi nấm tăng lên 73%. Tuy nhiên, Ascomycete không có tác dụng đối với nấm Rhizoctonia solani. Ngoài ra, Koche et al. (2013) đã phát hiện ra rằng, các hợp chất chống nấm chiết xuất từ dung dịch nuôi cấy được phát hiện là rất hiệu quả trong việc ức chế sự phát triển của nấm bệnh lên tới 42,79% và 20,45% đối với Rhizoctonia solani và Fusarium solani.
Hơn nữa, Duffy and Weller (1995), Hervas et al. (1998) đã khẳng định hỗn hợp của các loài vi sinh vật khác nhau có thể cho hiệu quả kiểm soát mầm bệnh tốt hơn, bởi chúng có thể thích nghi tốt hơn với những thay đổi của môi trường; đồng thời, chúng có thể có nhiều cơ chế ức chế mầm bệnh cũng như khả năng chống lại một loạt mầm bệnh khi chúng xuất hiện. Tóm lại, kết quả ghi nhận được của nghiên cứu này và kết quả của các nghiên cứu trước đó đã hỗ trợ cho nghiên cứu này cho thấy các hệ vi sinh vật bản địa có khả năng kiểm soát sinh học cao đối với các loại nấm gây bệnh thực vật như Fusarium oxysporum và Rhizoctonia
solani mà các cơ chế đối kháng sinh học của các IMO cần được nghiên cứu sâu hơn trong tương lai.
IV. KẾT LUẬN
Các hệ vi sinh vật bản địa (IMO) thu thập từ các hệ thống canh tác cây trồng khác nhau trong tỉnh Sóc Trăng có tiềm năng trong kích thích sinh trưởng cây trồng với các hoạt động như cố định đạm, hòa tan lân, tổng hợp IAA và đối kháng nấm gây bệnh thực vật rất rõ rệt. Trong đó, hệ vi sinh vật bản địa thu thập từ đất trồng tre có khả năng cố định đạm tốt nhất, hệ vi sinh vật thu từ đất luân canh và đất cỏ hoang có khả năng hòa tan lân mạnh nhất, trong khi hệ vi sinh vật từ đất trồng lúa và bắp có khả năng tổng hợp IAA cao nhất, và hai hệ vi sinh vật được thu thập từ các đất trồng ổi và bưởi cho thấy hoạt động kiểm soát sinh học đối với hai loại nấm gây bệnh làFusarium oxysporumvà Rhizoctonia solanilà hiệu quả nhất. Đặc biệt, hệ vi sinh vật được tạo ra từ hỗn hợp của các IMO có nguồn gốc khác nhau cho thấy tính hiệu quả khá cao và ổn định trong tất cả các hoạt động được khảo sát. Do đó, để đảm bảo hiệu quả cao và ổn định của IMO cho các chức năng này, việc tạo ra hỗn hợp IMO từ nhiều nguồn gốc khác nhau là cần thiết. Kết quả của nghiên cứu này cho thấy rằng các cộng đồng vi sinh vật bản địa có tiềm năng lớn trong việc cung cấp chất dinh dưỡng, điều hoà sinh trưởng của cây trồng cũng như kiểm soát sinh học đối với nấm bệnh trong đất mà có thể được khai thác trong chăm sóc và bảo vệ thực vật.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
[1] Ahmad, F., Ahmad, I. and Khan, M.S., 2005. Indole acetic acid production by the indigenous isolates of Azotobacter and fluorescent Pseudomonas in the presence and absence of tryptophan.Turk. J. of Biol., 29(1): 29-34.
[2] Ahmad, F., Ahmad, I. and Khan, M.S., 2008. Screen- ing of free-living rhizospheric bacteria for their mul- tiple plant growth promoting activities. Microbiol.
Res., 163(2): 173-181.
[3] Brick, J.M., Bostock, R.M., and Silverstone, S.E., 1991. Rapid insitu assay for indole acetic acid pro- duction by bacteria immobilized on nitrocellulose membrane. Appl. Environ. Microbiol. 57, 535–538.
[4] Chiemela, F.A., Serafin, L.N., Ricardo, L.I., Joseph, L.N., 2013. Application of indigenous microorgan- isms (IMO) for bio-conversion of agricultural waste.
International Journal of Science and Research(IJSR) ISSN (Online): 2319-7064.
[5] Dar, W.A., Beig, M.A., Ganie, S.A., Bhat, J.A., Shabir-u-Rehman and Razvi, S.M., 2013, In vitro study of fungicides and biocontrol agents against Fusarium oxysporum f.sp. pini causing root rot of Western Himalayan fir (Abies pindrow). Academin Journal: Scientific Research and Essays. Vol . 8(30):
1407-1412.
[6] Davis, J.B., Coty, V.T. and Stanley, J.P., 1964. At- mospheric nitrogen fixation by methane oxidizing bacteria.Journal of Bacteriology. 88:468-472.
[7] Duffy, B. K., and Weller, D.M., 1995. Use of Gaeu- mannomyces graminis var. graminis alone and in combination with fluorescent Pseudomonas spp. to suppress take-all of wheat.Plant Dis. 79: 907–911.
[8] Ghai S., Sood, S.S. and Jain, R.K., 2007. Antago- nistic and antimicrobial activities of some bacterial isolates collected from soil samples.Indian Journal of Microbiology47:77–80.
[9] Herva’s, A., Landa, B., Datnoff, L.E. and Jime’nez- Dı’az, R.M., 1998. Effects of Commercial and In- digenous Microorganisms on Fusarium Wilt De- velopment in Chickpea. Biological Control 13:
166–176.
[10] Hillel, D., 2007.Soil in the Environment, 1st Edition crucible of terrestrial life
[11] Huy, N.D., Nguyen P.Q., Hong N.T.T., Giang H., Vien N.V. and Canh N.T., 2017. Isolation and eval- uation of antagonistic ability of Trichoderma asperel- lum against soil borne plant pathogen. Vietnam J.
Agri. Sci. 15(12): 1593-1640.
[12] Keeney and Nelson, 1982. Method in applied Soil mi- crobiology and biochemistry. Edited by Kassem Alef and Paolo Nannipieri.Harcourt Brace and Company, pp79.
[13] Koche, D., Gade, R.M. and Deshmukh, A.G., 2013.
Antifungal activity of secondary metabolites pro- duced by Pseudomonas Fluorescens. The bioscan 8(2): 723-726.
[14] Koon-Hui, W., M. Duponte and K. Chang, 2013.
Use of Korean Natural Farming for vegetable crop production in Hawai’i. Hanai’ai/The Food Provider.
[15] Krishnaraj, P.U. and Dahale, S., 2014. Mineral phos- phate solubilization: concepts and prospects in sus- tainable agriculture.Proc Indian Natn Sci Acad 80 (2) pp. 389-405.
[16] Kumar, B.L. and Gopal D.V.R, 2015. Effective role of indigenous microorganism for sustainable enviro- ment.Biotech5: 867-876.
[17] Kyu, C.H and Koyama A., 1997.Korean nature farm- ing. Indigenous microorganisms and vital power of crop/livestock. Korean Nature Farming Association Publisher. 173 pages. (Special issue on Agriculture):
39-48.
[18] Lin, Q.M., Wang, H., Zhao, X.R., and Zhao, Z.J., 2001. The solubilizing ability of some bacteria and fungi and its mechanisms. Microbiol. China 2001, 28, 26–30.
[19] Mazumdar, A. and Deka, M., 2013. Isolation of free living nitrogen fixing bacteria from crude oil contam- inated soil.International Journal of Bio-Technology and Research. Vol. 3: 69-76.
[20] Mbouobda, H.D., Fotso, Djeuani C.A., Fail K. and Omokolo N D., 2013. Impact of effective and in- digenous microorganisms manures on Colocassia es- culenta and enzymes activities. African Journal of Agricultural Research. Vol. 8(12), pp.1086-1092.
[21] Pham Tien Dung and Y ka Nin H’ Dok. 2009. Mi- crobial organic fertilizer application for safe coffee production at Daklak, Vietnam.International Society for Southeast Asian Agricultural Sciences. 15(1): 22- 31.
[22] Reddy, R., 2011. Cho’s global natural farming. South Asia Rural Reconstruction Association.
[23] Robertson, G.P. and Groffman, P.M., 2015. Nitrogen transformations. In: E. A. Paul, (Ed.). Soil micro- biology, ecology and biochemistry. Fourth edition.
Academic Press, Burlington, Massachusetts, USA.
pp. 421-446
[24] Robles-Yerena L., Rodríguez-Villarreal, R.A., Ortega-Amaro, M.A., Fraire-elázquez, S. Simpson, J., Rodríguez-Guerra, R. and Jiménez-Bremont, J.F., 2010. Characterization of a new fungal antagonist of Phytophthora capsici.Scientia Horticulturae. 125(3):
248-255.
[25] Saikrithika, S., Krishnaswamy V.G. and Sujatha B., 2016. A Study on Isolation of Phosphate Solubi- lizing Bacterial (PSB) Strain fromVermicomposted Soil and Their Phosphate Solubilizing Abilities.In- ternational Journal of Advanced Biotechnology and Research(IJBR) ISSN 0976-2612. 7(2): 526-535.
[26] Sekhar, M.S., and V.R.S. Gopal, 2013. Studies on in- digenous microorganisms (IMOs) increasing growth of leaves germination, chlorophyll content and differ- entiation between IMOs and chemical fertilizers in various crop plants.International Journal of Emerg- ing Technologies in Computational and Applied Sci- ences (IJETCAS)4(3): 313-318.
[27] Smita M., and Goyal, D., 2017. Isolation and char- acterization of free-living nitrogen fixing bacteria from alkaline soils.International Journal of Scien- tific World, 5(1): 18-22.
[28] Stanojkovi´c-Sebi´c, A., Pavlovi´c, S., Starovi´c, M., Pivi´c, R., Dini´c1, Z., Lepˇsanovi´c, Z. and Joˇsi´c, D., 2017. Antagonistic activity of indigenous pseu- domonas isolates against Fusarium species isolated from anise.Scientific Papers. Series B, Horticulture.
LXI: 413-416.
[29] Sumathi T., A. Janardhan, A. Srilakhmi, D.V.R Sai Gopal and Narasimha, 2012. Impact of indigenous microoganisms on soil microbial and enzyme activ- ities. Archives of Applied Science Research 4 (2):
1065-1073.
[30] Tam, H.T, Diep, C.N., Chau D.T.M., 2016. Isolation and identification phosphate-solubilizing fungi from ferralsols of tithonia (tithonia diversifolia (hamsl.) gray) in daknong and daklak province(s), Vietnam.
World Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sci- ences. 5(9): 325-341.
[31] Thavasi, R., Jayalaxmi, S., Balasubramanian, T., and Banat, I.M., 2006. Biodegradation of crude oil by ni- trogen fixing marine bacteria Azotobacter chroococ- cum. Research journal of microbial.5:401-40.
[32] Toppo, S.R. and Naik, U.C., 2015. Isolation and characterization of bacterial antagonist to plant pathogenic fungi (Fusarium spp.) from agro based area of Bilaspur.International Journal of Research Studies in Biosciences. (Published Special Issues) ISSN (Online): 6-14.
[33] Vincent, J.M., 1947. Distortion of fungal hyphae in the presence of certain inhibitors.Nature159: 850- 850.
[34] Walpola, B.C. and Yoon, M.H., 2013. Isolation and characterization of phosphate solubilizing. African journal of microbiology research7: 266-275.
[35] Xa, L.T. and Nghia N.K., 2019. Microbial diversity of indigenous microorganism communities from differ- ent agri-ecosystems in Soc Trang province, Vietnam.
The International Conference of Ho Chi Minh City Open University 2019: Research and Application in Biotechnology.Proceeding (abstract book)p28.
[36] Xa, L.T., Thao, N.T.P. and Nghia N.K., 2018. Phos- phate solubilization, indole-3-acetic acid synthesis and nitrogen fixation of various indigenous microor- ganisms communities from different agri-ecosystem habitats. Scientific Journal of Cantho University, Vietnam. 54 (special issue on Agriculture): 39-48.
[37] Yuliar, S., Supriyati, D. and Rahmansyah, M., 2013.
Biodiversity of endophytic bacteria and their antag- onistic activity to rhizoctonia solaniand Fusarium oxysporum.Global journal of Biology, Agriculture &
Health Sciences, 2(4): 111-118.‘
