1 ,(1 ,(0 ( 2 1 1
,5 ,5 2 5(1 1 , 1 , 1
Nguyễn Thị Thanh Hải, Trần Đức Hoàn, Nguyễn Việt Dũng, Đoàn Thị Thảo, Bùi Thị Thương, Trịnh Xuân Đức, Trần Văn Sơn, Nguyễn Thị Loan Khoa Chăn nuôi Thú y, Trường Đại học Nông Lâm Bắc Giang
TÓM TẮT
Nghiên cứu này nhằm xác định sự hiện diện của virus Circo gây bệnh cho đàn vịt nuôi trên địa bàn tỉnh Bắc Giang. 640 con vịt nghi mắc bệnh đã được thu thập để xét nghiệm tỷ lệ vịt dương tính với virus Circo, thực hiện phản ứng PCR để xác định và phân tích trình tự gen, xác định các type, giải mã gen và phân tích cây phả hệ nhằm xác định các chủng virus Circo hiện đang lưu hành trên địa bàn nghiên cứu. Kết quả nghiên cứu cho thấy có 39/640 mẫu dương tính với DuCV (chiếm tỷ lệ 6,09%). Trình tự nucleotide của các chủng virus Circo nghiên cứu so với trình tự nucleotide các chủng tham chiếu trên Ngân hàng Gen có tỷ lệ tương đồng rất cao (98,09-99,55%). Phân tích cây phát sinh loài cho thấy các chủng DuCV phân lập được ở tỉnh Bắc Giang giống với các chủng đã được phân lập ở các nước: Trung Quốc, Hàn Quốc, Mỹ.
Nghiên cứu bước đầu đã cho thấy có sự xuất hiện virus Circo trên đàn vịt ở tỉnh Bắc Giang, cũng là đánh dấu sự lưu hành chủng virus này tại các tỉnh phía Bắc Việt Nam. Đây là cơ sở khoa học cho chẩn đoán, phòng và điều trị bệnh Circo virus gây ra ở vịt nuôi ở các tỉnh phía Bắc Việt Nam.
Từ khóa:Vịt, Circo virus, Bắc Giang, lưu hành.
WXG R PROHFXODU HSLGHPLRORJLFDO FKDUDFWHULVWLFV D G
SUHYDOH FH RI LUFR YLUXV X 9 L GXFNV UDLVHG L DF LD J SURYL FH
X HQ KL KDQK DL DQ X DQ X HQ LH XQ DQ KL KD XL KL KX Q LQK XDQ X DQ DQ Q X HQ KL DQ
800 5
7KLV V G DLPHG R LGH LI KH PROHF ODU HSLGHPLRORJLFDO FKDUDF HULV LFV D G SUH DOH FH RI LUFR LU V L IHF HG L G FNV L %DF LD J SUR L FH R DO RI V VSHF HG G FNV HUH VDPSOHG D G D DO HG IRU KH SRVL L H UD H RI G FN L K LUFR LU V 3 5 DVVD D G VHT H FL J IRU VHUR SH LGH LILFD LR D G SK ORJH H LF UHH D DO VLV 7KH V GLHG UHV O V L GLFD HG KD G FN VDPSOHV HUH SRVL L H L K 9 7KH VLPLODUL OH HO RI FOHR LGH VHT H FHV RI KH LUFR LU V L KLV V G L FRPSDULVR L K FOHR LGH VHT H FHV RI KH LUFR LU V S EOLVKHG L H H%D N DV HU KLJK R 7KH UHV O V RI SK ORJH H LF UHH D DO VLV VKR HG KD KH VHUR SHV RI LUFR LU V LVROD HG L %DF LD J SUR L FH HUH VLPLODU L K VHUR SHV RI LUFR LU V S EOLVKHG L KL D .RUHD D G 8 L HG 6 D HV 7KLV LV L L LDO V G L GLFD L J KH SUH DOH FH RI LUFR LU V L G FNV UDLVL J L %DF LD J SUR L FH DV HOO DV L KH RU KHU SUR L FHV RI 9LH 1DP 7KLV LV DOVR D VFLH LILF EDVLV IRU GLDJ RVLV SUH H LR D G UHD PH RI LUFR LU V GLVHDVH L G FN UDLVL J L KH RU KHU SUR L FHV 9LH 1DP
. FN LUFR LU V %DF LD J SUR L FH SUH DOH FH
ĐẶT VẤN ĐỀ
Trong những năm gần đây chăn nuôi gia cầm đang chiếm một vị trí ngày càng quan trọng trong sản xuất nông nghiệp. Trong đó chăn nuôi vịt siêu ngoại và vịt đẻ cũng đang là một trong những hướng phát triển mới cho người
chăn nuôi. Một số giống vịt siêu thịt đã và đang tăng một cách nhanh chóng, theo đó dịch bệnh cũng ngày một gia tăng. Một số bệnh thường hay gặp ở vịt đó là: Derzsy’s (Hội chứng lùn và mỏ ngắn), Tembusu (Hội chứng giảm đẻ), Duck Circovirus DuCV (Hội chứng còi cọc),... Trong những dịch bệnh trên phải kể đến DuCV do một
2.2.3. Phương pháp giải trình tự gen theo hai chiều (xuôi và ngược) bằng phương loại virus thuộc họ Circoviridae gây ra, bệnh
được phát hiện lần đầu tiên ở một số trang trại nuôi vịt ở Đức (Hattermann W , 2003), bệnh gây ra các tác hại chủ yếu là rối loạn tình trạng mọc lông và gầy ốm, làm suy giảm miễn dịch (Xie W , 2012), DuCV còn làm tổn thương các mô lympho là nguyên nhân giảm đáp ứng miễn dịch, gây kế phát các mầm bệnh khác (Soike W , 2004).
Ở Việt Nam, bằng chứng xác định sự hiện diện DuCV ở các tỉnh phía Nam vào năm 2016, phát hiện chủng Circo virus gây bệnh trên vịt (Bùi Hữu Dũng và cs, 2016). Bệnh thường gặp ở vịt giai đoạn tuổi từ 6-8 tuần, bệnh tích được phát hiện chủ yếu ở túi Fabricius, gan, lách, thận và các cơ quan đường hô hấp khác (Duchatel W 2006). Trong khuôn khổ của bài báo này, chúng tôi trình bày cập nhật về đặc điểm dịch tễ học phân tử của DuCV lưu hành tại một số huyện thuộc địa bàn Bắc Giang.
II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Vật liệu nghiên cứu
- Mẫu vịt thu thập từ các trại chăn nuôi vịt
thuộc địa bàn Bắc Giang, được đưa về mổ khám tại phòng thí nghiệm với các triệu chứng lâm sàng điển hình như: còi cọc, chậm lớn, lông phát triển không bình thường, ỉa chảy. Mẫu bệnh phẩm: gan, lách, tim, túi Fabricius, não. Mẫu thu thập được xay nhuyễn và để trong ống EP, bảo quản ở nhiệt độ -800C đến khi phân tích.
- Hóa chất: tách chiết DNA, PCR, giải trình tự gen đều được thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuất (Công ty Thermo của Mỹ).
2.2. Phương pháp nghiên cứu 2.2.1. Phương pháp tách chiết DNA
DNA của các mẫu thu thập được pha loãng với dung dịch PBS sau đó sử dụng bộ Kit tách DNA Quick - DNATMcủa hãng Thermo (Mỹ).
2.2.2. Phương pháp PCR
DNA sau khi được tách chiết ở trên sẽ được thực hiện phản ứng PCR với thiết kế cặp mồi theo hướng dẫn của Banda,A. W (2007) (bảng 1) và Taq DNApolymera (Thermo biotechnology Co., Ltd) có tổng thể tích 25 l trong đó có 12,5 l Dream taq, 4 l DNA, 1 l mồi ngược và 1 l mồi xuôi, 6,5 l nước PCR Free – nuclease. Chu trình nhiệt phản ứng PCR được thể hiện ở bảng 2.
Bảng 1. Trình tự đoạn mồi dùng trong chẩn đoán DuCV
Chủng virus Tên mồi Trình tự đoạn mồi (5’-3’) Sản phẩm PCR (bp)
DuCV DuCV-F ATG GCT GCC CTT GAG
DuCV-R TCC CGA GTA ACC GTC CCA AA C
Bảng 2. Chu trình nhiệt phản ứng PCR
Giai đoạn Nhiệt độ ( C) Thời gian Số chu kỳ
Tiền biến tính 3 phút
Biến tính 40 giây
Bắt cặp 20 giây
Kéo dài 2 phút
Kéo dài cuối cùng 7 phút
được thực hiện tại công ty Macrogen (Seoul, Hàn Quốc). Trình tự nucleotide thu được tiếp tục được phân tích bằng chương trình sinh học BioEdit V7.1.3.0 (Hall, 1999).
2.2.4. Phương pháp xây dựng cây phả hệ Trên cơ sở trình tự gen của các chủng Circovirus lưu hành ở Bắc Giang, chúng tôi tiến hành xây dựng cây phả hệ bằng phương pháp neighbor-joining algorithm. Tree topology được xác định bằng phân tích bootstrap từ dữ liệu neighbor-joining bằng chương trình SEQBOOT và CONSENSE.
2.2.5. Phương pháp xử lý số liệu
Số liệu được xử lý bằng phần mềm SPSS phiên bản 20.0. Sự khác nhau giữa các nhóm
chỉ tiêu thí nghiệm được phân tích bằng chương trình one-way ANOVA Duncan test (giá trị p <
0,05).
III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Kết quả xác định đặc điểm dịch tễ bệnh Circovirus
Trong quá trình điều tra thu thập số liệu tại một số huyện thuộc tỉnh Bắc Giang, chúng tôi được biết nhiều hộ chăn nuôi, trang trại chăn nuôi vịt có một số con bị còi cọc chậm lớn, giảm khả năng miễn dịch (chiếm khoảng 10%). Để khảo sát tìm hiểu có sự lưu hành virus Circo hay không, chúng tôi lấy mẫu và phân tích PCR, 640 con vịt nghi mắc bệnh có 39 con dương tính với DuCV (chiếm tỷ lệ 6,09%). Kết quả được trình bày trong bảng 3.
Bảng 3. Kết quả phân tích PCR sự có mặt của virus Circo trong bệnh phẩm của vịt Địa điểm Tổng số con theo dõi Tổng số con mắc bệnh Tỷ lệ (%)
Việt Yên 160 11 6,87
Hồng Thái ab
Tự Lạn 7,5ab
Bích Sơn ab
Minh Đức ab
Yên Thế 160 14 8,75
Tân Sỏi ab
Cầu Gồ 17,5a
Tam Hiệp 7,5ab
Tam Tiến ab
Tân Yên 160 8
Cao Xá 10,0ab
Quang Tiến b
Lam Cốt 7,5ab
Liên Sơn 2,5b
Yên Dũng 160 3,75
Tiền Phong 10,0ab
Nội Hoàng 2,5b
Yên Lư 2,5b
Nham Sơn b
Tổng số 39 6,09
Bảng 3 cho thấy tỷ lệ mắc bệnh Circo virus ở các huyện thuộc tỉnh Bắc Giang không cao, số con mắc nằm rải rác ở các địa phương không tập trung, tỷ lệ chết không cao, chủ yếu là vịt còi cọc, chậm lớn và lông mọc không bình thường, làm giảm hiệu quả kinh tế. Cụ thể tỷ lệ mắc bệnh ở huyện Yên Dũng thấp nhất (3,75%), cao nhất ở Yên Thế (8,75%). Trong quá trình điều tra chúng tôi thấy các hộ chăn nuôi ở Yên Thế không xây dựng quy mô chuồng trại tốt, vệ sinh, chăm sóc nuôi dưỡng kém, đây có thể là nguyên nhân chủ yếu gây ra bệnh ghép làm mức độ nghiêm trọng của bệnh nặng hơn, gây tỷ lệ mắc bệnh cao. Theo kết quả nghiên cứu, DuCV có khả năng lưu hành cao trên đàn vịt ở các nước khác nhau như Đức (46%), Đài Loan (38,2%), Mỹ (6,1%), Trung Quốc (33,3%) (Ban da, 2007; Chen và cs, 2006;
Soike và cs, 2004, Xie và cs, 2012). Tại Việt Nam, bệnh xảy ra chưa phổ biến, nghiên cứu đầu tiên phát hiện ở phía Nam, Việt Nam (Bùi Hữu Dũng và cs, 2016) cho thấy tỷ lệ vịt bị mắc DuCV ở các trang trại là 10,81%.
Như vậy, tỷ lệ mắc bệnh Circo virus ở vịt của các huyện thuộc tỉnh Bắc Giang thấp hơn kết quả nghiên cứu trên. Theo chúng tôi, có thể các vùng miền khác nhau thì khả năng mắc bệnh cũng khác nhau.
3.2. Kết quả PCR trong chẩn đoán Circo virus ở vịt
Cặp mồi sử dụng cho quy trình PCR phát hiện DuCV được xác định có khả năng hoạt động tốt và hoàn toàn đặc hiệu qua phản ứng PCR (hình 1). Sản phẩm PCR trên gel điện di có kích thước 408bp.
Hình 1 cho thấy 5 mẫu dương tính PCR đều cho vạch sáng, rõ, sản phẩm khuếch tán có kích thước phù hợp (ở >400 bp), không có dương tính giả. Như vậy hoàn toàn phù hợp với thiết kế mồi ở bảng 1. Điều đó cho thấy
có sự hiện diện virus Circo trên đàn vịt nuôi tại địa bàn Bắc Giang.
Hình 1. Sản phẩm PCR của DuCV Ghi chú: Thang chuẩn DNA 100bp (M), giếng 1,2,3,4,5 các mẫu dương tính với DuCV. Giếng 6 là đối chứng âm tính DuCV 3.3. Đặc điểm tương đồng trình tự nucleotide
Sản phẩm PCR tinh sạch được giải trình tự theo thiết kế mồi (xuôi và ngược) bằng phương pháp Sanger. Kết quả phân tích sự tương đồng trình tự nucleotide giữa chủng nghiên cứu với các chủng tham chiếu được trình bày tại hình 2 và bảng 4.
Kết quả phân tích trình tự nucleotide cho thấy DuCV từ 4 mẫu bệnh phẩm Bacgiang 1, Bacgiang 2, Bacgiang 3, Bacgiang 4 thu thập được ở huyện thuộc tỉnh Bắc Giang năm 2019 có sự tương đồng với nhau rất cao (100%), không có sự sai khác nào trong vị trí các nucleotide, có thể do địa bàn nghiên cứu trên một tỉnh nên điều kiện tự nhiên như nhau.
Trình tự nucleotide giữa các chủng nghiên cứu với các chủng đã được công bố trên Ngân hàng Gen có mức độ tương đồng từ 98,09-99,55%.
Như vậy, kết quả này cho thấy ở cùng khu vực châu Á, các chủng DuCV phân lập được trong nghiên cứu với các chủng đã công bố trên Ngân hàng Gen có sự tương đồng tương đối cao so với các chủng của Trung Quốc thuộc các tỉnh Phúc
M 1 2 3 4 5 6
500 bp
Kiến, Quảng Tây, Sơn Đông,… với độ tương
đồng từ 98 đến 99%. Đây là những tỉnh gần với Việt Nam về mặt địa lý, do vậy nguồn virus cũng có thể lây từ Trung Quốc sang Việt Nam.
Hình 2. So sánh trình tự nucleotide giữa các chủng DuCV trong nghiên cứu với các chủng DuCV tham chiếu khác
Bảng 4. So sánh mức độ tương đồng (%) giữa các chủng Circo virus tham khảo và nghiên cứu
Mã tra cứu Tên chủng Tỷ lệ tương
đồng (%) JX241046.1 Duck Circovirus isolate GX1104, complete genome 99,55%
JX241045.1 Duck Circovirus isolate GX1105, complete genome 99,35%
GQ423743.1 Muscovy duck Circovirus isolate FJCL311, complete genome 98,59%
JX499186.1 Muscovy duck Circovirus strain GH01, complete genome 98,54%
GQ423745.1 Muscovy duck Circovirus isolate FJFQ312, complete genome 98,54%
GQ423746.1 Muscovy duck Circovirus isolate FJPT60, complete genome 98,49%
8 Duck Circovirus isolate PT07, complete genome 98,44%
GQ423744.1 Muscovy duck Circovirus isolate FJFQ315, complete genome 98,39%
HG532019.1 Duck Circovirus rep gene, isolate Fujian/2010 98,34%
GQ868757.1 Muscovy duck Circovirus isolate FJ0701, complete genome 98,34%
GQ423741.1 Muscovy duck Circovirus isolate FJPT09, complete genome 98,29%
EF370476.1 Muscovy duck Circovirus isolate FJ0601, complete genome 98,24%
*8 Duck Circovirus isolate WF0804, complete genome 98,19%
*8 Duck Circovirus isolate WF0802, complete genome 98,09%
3.4. Kết quả xây dựng cây phả hệ các chủng DuCV trong nghiên cứu
Để xác định mối tương quan giữa các chủng Circovirus gây ra ở Bắc Giang với các nước trên thế giới, chúng tôi sử dụng phần mềm BioEdit và DNASTAR (hình 3).
Kết quả phân tích cho thấy: Bắc Giang có nguồn gốc DuCV được phân lập gần giống với các chủng của Quảng Tây, Quảng Đông, Hắc Long Giang của Trung Quốc. Các chủng ở các huyện của Bắc Giang thuộc về các nhánh khác nhau của cây phát sinh chủng thì có mức tương đồng như nhau.
Đáng chú ý kết quả phân tích cho thấy virus Circo lưu hành ở Bắc Giang được phát hiện lần đầu tiên ở miền Bắc Việt Nam.
Kết quả phân tích cây phả hệ cho thấy tất cả các chủng DuCV trong nghiên cứu này đều thuộc cùng một nhóm, có cùng
nhánh với các chủng DuCV đang lưu hành phổ biến ở các nước thuộc khu vực Đông Nam Á và Mỹ. Nghiên cứu này một lần nữa khẳng định mối quan hệ gần gũi của các chủng DuCV ở Việt Nam với các nước trong khu vực (Banda W , 2007). Chủng DuCV được phân lập ở tỉnh Bắc Giang có mối quan hệ gần gũi với nhau và với các chủng virus phân lập được ở Mỹ, Hàn Quốc, Trung Quốc.Việc chưa phát hiện các biến chủng mới tại tỉnh Bắc Giang so với các nghiên cứu trước đó có thể do số lượng mẫu trong nghiên cứu này chưa mang tính đại diện, cũng như thiếu các nghiên cứu, điều tra đầy đủ về đặc điểm dịch tễ học phân tử của các chủng DuCV đang lưu hành tại Việt Nam. Trên cơ sở dữ liệu, chúng tôi thấy rằng DuCV ít có sự lây lan giữa các địa phương.
Hình 3. Mối tương quan giữa các chủng DuCV trong nghiên cứu với các nước
trên thế giới
IV. KẾT LUẬN
Đây là lần đầu tiên xác định được sự xuất hiện chủng Circo virus ở đàn vịt trên địa bàn tỉnh Bắc Giang, tỷ lệ mắc bệnh 6,09%. Trình tự sắp xếp gen của chủng DuCV thu được có độ tương đồng cao với các chủng tham chiếu trên Ngân hàng Gen (98,09-99,55%). Cây phả hệ cho thấy các chủng DuCV trong nghiên cứu có cùng nguồn gốc với các chủng đã tìm thấy ở một số tỉnh thuộc Trung Quốc.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Hattermann K., Schmitt C., Soike D.and Mankertz A., 2003. Cloning and sequencing of duck Circovirus (DuCV). Archives of Virology.148: 2471-2480.
2. Xie Zhi Xun, Zhang Yan Fang, el al., 2012. Construction and identi cation of recombinant attenuated DuCV typhimurium oral Riemerella antipestifer vaccine.
animal husbandry veterinarinery, 11- 40.
3. SoikeD.,Albrecht K.,HattermannK.,SchmittC.
and MankertzA., 2004. Novel Circovirus in mulard ducks with developmental and feathering disorders. W FR 154:792-793.
4. Bùi Hữu Dũng, Đỗ Tiến Duy, Nguyễn Tất Toàn, Nguyễn Thị Thu Năm, Lê Thanh Hiền, Nguyễn Thị Phước Ninh, 2016. Xác định sự hiện diện duck Circovirus và Riemerella anatipestifer từ các ca bệnh bại huyết trên vịt bằng kỹ thuật PCR.Tạp chí khoa học kỹ thuật thú y, số 6, 14-21.
5. Duchatel J P., Todd D., Smyth J A., Bustin JC and Vindecogel H., 2006. Observation on detection, excretion and transmission of pigeon Circovirrus in dult, young and embryonic pigeons. Avian pathology, 35:
30-34.
6. Banda A.,Galloway askinsRI., SandhuTS., SchatKA., 2007. Genetic analysis of duck Circovirus detected in commercial Pekin ducks in New York. Avian Diseases, 51:90-95.
Ngày nhận 12-12-2019 Ngày phản biện 15-1-2020 Ngày đăng 1-3-2020
Guangxi-KC460529 Guangxi-KC460535 GX-MDCV-HQ180265 Beijing-HM162350 SC-MDCV-KP780079
Fujian-EU344807 Taiwan-KP229362 FJ-MDCV-GQ423742 Heilongjiang-KU844856 Fujian-GQ423747 USA-NC 005053-Mulardduck ShandongJSPX03-BMF627687
ShandongDY0520-MF627689 ShandongLY0201-MF627690 Guangdong-MK814587 GX-MDCV-KR491946 Guangdong-MK814588 GX-MDCV-KR491947
Guangdong-MK814589 Taiwan-KP229376
Jiangsu-GU014543 Beijing-HM162353 Beijing-HM162351 Taiwan-KP229367 Taiwan-KP229369 Korea-KC851822
Newyork11941-NC 007220 Beijing-HM162352 Shandong-KY328304 Korea-KC851823 ShandongJSPX03E-MF627688
Guangxi-KC460533 Guangxi-KC460531 Poland-KP943594 USA-MDCV-NC 006561 TW-MDCV-AY394721 TW-MDCV-DQ166836 TW-MDCV-DQ166837 TW-MDCV-DQ166838 Heilongjiang-KU844857 Taiwan-KP229377
GD-MDCV-FJ554673 Guangdong-KF941315 Guangdong-MK814571 Heilongjiang-KU844858 GX-MDCV-KR491945 Fujian-HG532019 Fujian-EU499310 FJ-MDCV-GQ423746
Guangxi-JX241046 Bacgiang1 Bacgiang2 Bacgiang3 Bacgiang4
FJ-GCV-GU320569
