TẠO DÒNG BACILLUS SUBTILIS TÍCH HỢP INTERFERON ALPHA 2A TRONG TIÊM MAO
Dương Nguyễn Ánh Ngọc1, Nguyễn Thị Linh Giang1, Vũ Thanh Thảo1
TÓM TẮT
Đặt vấn đề: Nghiên cứu về IFN- α2a liều thấp đường uống cho thấy kết quả tiềm năng trong việc điều trị, dự phòng các bệnh ở người và động vật. Nhưng việc sử dụng IFN-α đường uống gặp phải trở ngại như bị phân hủy trong đường tiêu hóa, do đó việc sử dụng Bacillus subtilis như giá mang đưa IFN- α2a vào cơ thể được cho là giải pháp tiềm năng cho vấn đề này.
Mục tiêu: Tạo dòng chủng B. subtilis biểu hiện IFN-α2a người khảm trong tiêm mao.
Đối tượng và phương pháp: E. coli mang plasmid pET.NIC, pET.IFN được tạo dòng để biểu hiện các protein giúp kiểm tra sự biểu hiện IFN-α2a trên tiêm mao. Vector pDG364 giúp tích hợp gen IFNA2 mã hóa cho IFN-α2a người vào gen tiêm mao B. subtilis. Các chủng B. subtilis tái tổ hợp được kiểm tra biểu hiện tiêm mao.
Kết quả: Protein IFN-α2a và NIC với kích thước 24 kDa và 49,6 kDa được biểu hiện thành công nhờ E. coli BL21(DE3). Nghiên cứu cũng tạo dòng thành công B. subtilis mang IFN-α2a khảm trong tiêm mao. Chủng B. subtilis này có thể biểu hiện IFN- α2a trên tiêm mao.
Kết luận: Nghiên cứu đã tạo dòng thành công B. subtilis PY79 mang gen tái tổ hợp mã hóa IFN-α2a người.
Chủng B. subtilis tái tổ hợp có tiềm năng phát triển thành nguồn cung cấp IFN-α2a đường uống có khả năng sử dụng như probiotic.
Từ khóa: Bacillus subtilis, IFN-α2a
ABSTRACT
CLONING OF MOSAIC HUMAN INTERFERON ALPHA 2A IN BACILLUS SUBTILIS FLAGELLA Duong Nguyen Anh Ngoc, Nguyen Thi Linh Giang, Vu Thanh Thao
* Ho Chi Minh City Journal of Medicine * Vol. 25 - No. 2 - 2021: 40 - 47 Background: Research on low dose oral use of IFN- α2a has shown potential results in treatment and prevention of various diseases in human and testing animals. However, IFN-α peroral is easily degraded inside gastrointestinal tract. Using Bacillus subtilis as the carrier to deliver IFN- α2a into our body presented to be promising solution to this problem.
Objectives: This research aimed to clone B. subtilis strain expressing mosaic human IFN-α2a on its flagella.
Method: E. coli carrying pET.NIC and pET.IFN were cloned to express recombinant proteins using to verify the expression of protein IFN-α2a on the flagella. Cloning vector pDG364 was used to integrate gene IFNA2 coding for human IFN-α2a to gene Hag coding for B. subtilis flagella. The recombinant strain is tested for its capability to express its flagella.
Results: The protein IFN-α2a và NIC are successfully expressed by E. coli BL21(DE3) and is detected at 24 kDa and 49,6 kDa band on SDS-PAGE. The research also succeeds in cloning B. subtilis strains with mosaic IFN-α2a in its flagella. The results show that B. subtilis strains are able to express IFN-α2a in flagella.
Conclusion: The study succeeded in cloning strain of B. subtilis PY79 carrying gene coding for human IFN-α2a. The recombinant B. subtilis strain is expected to use as an oral IFN-α2a which can be easily used as a
1Phòng thí nghiệm Công nghệ Sinh học Dược, Khoa Dược, Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh
daily probiotics product.
Keywords: Bacillus subtilis, FN-α2a
ĐẶT VẤN ĐỀ
Từ lúc được phát hiện vào năm 1957, nhiều loại interferon (IFN) đã được tìm ra và cho thấy những hoạt tính khác nhau trong sinh vật. Các nghiên cứu về tiềm năng trị liệu của IFN đã được thực hiện, nhiều loại IFN đã được chấp thuận dùng trong điều trị ở người. Đặc biệt, interferon alpha (IFN-α) đã được nghiên cứu rộng rãi, chuyên sâu và đang được sử dụng như một phương pháp điều trị tiêu chuẩn của nhiều bệnh. Ví dụ, Cục quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ (FDA) đã chấp thuận chỉ định IFN liều cao như liệu pháp bổ trợ cho các bệnh nhân mắc ung thư hắc tố da (melanoma). Ngoài ra, IFN-α được gắn polyethylen glycol (PEG) cũng đã được nghiên cứu, giúp kéo dài thời gian bán hủy của IFN trong huyết tương mà không gây ảnh hưởng đến hoạt tính của IFN. Tuy nhiên, dù sử dụng IFN-α ở dạng nào, IFN-α đều có thể gây ra hàng loạt tác dụng phụ ở hầu hết các hệ cơ quan. Điều này ảnh hưởng đến chất lượng sống của các bệnh nhân điều trị với IFN-α. Hơn nữa, tác dụng phụ còn cản trở việc đạt và duy trì liều điều trị cần thiết để cho hiệu quả điều trị tối đa ở bệnh nhân. Thậm chí, trong nhiều trường hợp, tác dụng phụ còn dẫn đến việc bệnh nhân từ bỏ điều trị. Như vậy, mục tiêu quan trọng cần đạt được chính là việc biến đổi các IFN-α có hiệu quả trị liệu lâm sàng tác dụng phụ tối thiểu(1).
Hiện nay, các nghiên cứu về hiệu quả sử dụng IFN-α liều thấp đường uống đã được thực hiện. Nhiều nghiên cứu cho thấy IFN đường uống liều thấp là an toàn và có lợi trong điều trị các bệnh ở người gây ra bởi virus(2), ung thư(3), tự miễn(4) hay các bệnh không rõ nguồn gốc(5). Tuy nhiên, với bản chất là protein, việc dùng IFN-α đường uống gặp phải nhiều trở ngại, điển hình là việc IFN-α dễ dàng bị phân hủy bởi acid dịch vị và các enzym phân giải protein. Như vậy, việc tạo ra được dạng IFN-α có thể dùng đường uống mà không bị mất hoạt tính khi đưa vào cơ
thể là cần thiết, giúp cải thiện hiệu quả trị liệu ở bệnh nhân điều trị với IFN-α.
Bên cạnh đó, nhiều nghiên cứu về vi sinh vật biến đổi gen dùng làm giá thể tải thuốc đã được thực hiện và cho thấy tiềm năng phát triển. Trong đó, các nghiên cứu sử dụng Bacillus subtilis làm hệ thống biểu hiện protein như protein pneumolysin(6), interferon(7), độc tố bạch hầu(8), năm tiểu đơn vị của độc tố ho gà(9), đoạn C độc tố uốn ván(11) đã thu được những kết quả chứng minh tính khả thi của giá mang này. Các nghiên cứu trước đây thực hiện theo hướng neo kháng nguyên lên vỏ bào tử của B. subtilis, hay biểu hiện protein dưới dạng tiết. Trong nghiên cứu này, nhóm nghiên cứu tiến hành khảm protein IFN-α2a của người vào tiêm mao của B. subtilis nhằm tạo ra chủng B. subtilis biểu hiện protein IFN-α2a người khảm trong tiêm mao mục tiêu hướng đến việc sử dụng như chế phẩm probiotic giúp cung cấp IFN-α2a ở người. Protein tiêm mao - flagella của B. subtilis được mã hóa bởi gen hag, cấu trúc bậc 3 của protein hag cho thấy vùng đầu N (acid amin 1-143) và đầu C (acid amin 218-304) là vùng bảo tồn của gen hag, vùng trình tự giữa (acid amin 144-217) có thể thay đổi mà không ảnh hưởng đến việc gấp cuộn và biểu hiện của protein hag(11). Hag còn là một protein được biểu hiện nhiều nhất trong tế bào với số lượng lên đến 15.104 phân tử/tế bào(12). Mặt khác, protein hag không phải là protein thiết yếu của B. subtilis. Do đó, những biến đổi di truyền liên quan đến protein này cũng không làm ảnh hưởng đến sự sống còn của vi khuẩn(13). Với những đặc điểm thuận lợi này, protein hag là một ứng viên tiềm năng trở thành protein mang protein ngoại lai hiệu quả.
ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Chủng vi sinh vật và plasmidEscherichia coli DH5α được sử dụng làm chủng tạo dòng. E. coli BL21(DE3) và B. subtilis PY79 được sử dụng làm chủng biểu hiện.
Plasmid pUC57.IFN chứa trình tự đã tối ưu hóa của gen IFN-α2a của người trong các nghiên cứu trước của nhóm nghiên cứu. Plasmid pET28b(+) được sử dụng để tạo vector tái tổ hợp cho mục đích biểu hiện protein IFN-α2a . Plasmid pDG364 được sử dụng để chèn đoạn gen đích vào bộ gen của B. subtilis. Vi khuẩn và plasmid được cung cấp bởi PTN Công nghệ sinh học Dược, Khoa Dược, Đại học Y Dược thành phố Hồ Chí Minh.
Tạo dòng E. coli BL21(DE3) mang vector tái tổ hợp pET.IFN và pET.NIC
Các cặp mồi sử dụng cho phản ứng khuếch đại được thiết kế dựa trên trình tự của gen hag mã hóa cho tiêm mao và gen ifn, tính đặc hiệu của mồi được kiểm tra bằng công cụ Blast của NCBI (Bảng 1). Mồi khuếch đại gen hagN, ifn, hagC được thêm trình tự nhận diện của BsaI sao cho khi cắt các gen này với BsaI như sau: gen hagN có đầu dính 5’là GATC tương ứng với đầu dính của BamHI, đầu dính 3’ tương ứng với đầu dính 5’ của gen ifn sau khi cắt; gen hagC có đầu dính 5’ tương ứng với đầu dính 3’ của gen ifn và đầu dính 3’ là TCGA tương ứng với đầu dính của HindIII.
Gen exp-ifn, ifn được thu nhận từ khuôn mẫu pUC57.IFN; hagN và hagC được thu nhận từ DNA nhiễm sắc thể của B. subtilis PY79 bằng phản ứng PCR với cặp mồi tương ứng. Gen exp-ifn và vector pET28b(+) được cắt với cặp enzym BamHI/HindIII. Sản phẩm cắt sau khi tinh chế được nối lại bằng T4 DNA ligase và biến nạp vào E. coli DH5α và sàng lọc bằng PCR khuẩn lạc với cặp mồi exp_ifn_F và exp_ifn_R. Gen hagN, ifn, hagC được cắt với BsaI và pET28b(+) được cắt với cặp enzym BamHI/HindIII, tinh chế và được nối lại bằng enzym T4 ligase (Hình 1) và biến nạp vào E. coli DH5α. Chủng chứa plasmid tái tổ hợp được sàng lọc bằng phản ứng PCR khuẩn lạc với cặp mồi hagN_F và hagC_R. Vector pET.IFN, pET.NIC (sản phẩm nối 3 gen hagN, ifn, hagC được viết tắt là NIC) được biến nạp vào E. coli BL21(DE3) và sàng lọc chủng tái tổ hợp bằng PCR với cặp mồi tương ứng.
Cảm ứng biểu hiện và tinh sạch protein IFN- α2a và NIC tái tổ hợp
Chủng E. coli BL21(DE3)/pET.IFN và pET.NIC được tăng sinh trong 100 ml LB bổ sung kanamycin 30 g/ml và cảm ứng biểu hiện với IPTG 1 mM trong 16 giờ ở 25oC. Ly tâm thu cắn ở 10.000 g/5 phút. Ly giải cắn vi khuẩn bằng tán siêu âm 30 giây/chu kỳ (5 chu kỳ)(14). Thực hiện đồng thời với mẫu đối chứng âm không cảm ứng IPTG. Protein tái tổ hợp được kiểm tra biểu hiện bằng phương pháp SDS-PAGE với thuốc nhuộm Coomassive Blue.
Tạo dòng B. subtilis mang protein IFN- khảm trong tiêm mao
Gen NIC được khuếch đại từ khuôn mẫu pET.NIC với cặp mồi hagN_F/hagC_R (Bảng 1), xử lý NIC với enzym BsaI, nối vào vector pDG364 đã được xử lý với BamHI/HindIII bằng T4 DNA ligase và biến nạp vào E. coli DH5α.
Chủng tái tổ hợp được sàng lọc bằng PCR khuẩn lạc và kiểm tra lại bằng phản ứng cắt plasmid với BamHI. Vector pDG364.NIC được duỗi thẳng bằng XhoI và biến nạp vào B. subtilis.
Chủng tái tổ hợp được sàng lọc bằng PCR với mồi hagN_F/hag_C_R trên khuôn mẫu DNA nhiễm sắc thể và kiểm tra khả năng thủy giải tinh bột trên môi trường thạch LB (bổ sung 1%
tinh bột) để chứng minh vector pDG364.NIC đã được tái tổ hợp vào locus amyE của B. subtilis(15). Kiểm tra sự biểu hiện tiêm mao của chủng B.
subtilis tái tổ hợp
Chủng B. subtilis tái tổ hợp được kiểm tra biểu hiện của IFN trên của tiêm mao bằng phương pháp Western Blot(16) với kháng thể Anti-IFN-α2 (Abcam).
AmpR MCS
FNG (660 bp)
pUC57.FNG (3370 bp)
(A) (B)
pDG364.NFC (7394 bp) AmpR
AmyE
Cat NFC (915 bp)
AmyE’
pDG.NIC (7718 bp)
NFC (915 bp)
aa 1 304
Vùng biến động
143 218
hagN (N) hagC (C) ifn (I)
hag (Bacillus subtilis) PCR
pUC57.IFN (3205 bp)
IFN (495 bp)
Hình 1. (A): Thiết kế trình tự NIC,
Bảng 1. Danh sách mồi sử dụng trong nghiên cứu
Gen mục tiêu Tên Trình tự 5’-3’ Kích thước, nhiệt độ gắn mồi
exp_ifn exp_ifn_F GGTCTCGGATCCTtgtgacctgccgcaaacac 495 bp, 57oC exp_ifn_R GGTCTCAAGCTTttctttgcttctcaggctttct
hagN (N) hagN_F GGTCTCTGATCCgcagcagcgttatccagc 667 bp, 56oC
hagN_R GGTCTCACAGtgatttgcaggagtagctgtg
IFN (I) ifn_F GGTCTCAACtgtgacctgccgcaaac 495 bp, 55oC
ifn_R GGTCTCACAGCttctttgcttctcaggctttc
hagC (C) hagC_F GGTCTCtgctgatatcggtttcgatg 327 bp, 58oC
hagC_R GGTCTCAAGCTcctggcaacgccaaggtc
Chữ thường: trình tự bắt cặp với DNA khuôn mẫu, chữ hoa: trình tự thêm vào đầu 5’ để cắt bằng enzym cắt giới hạn, gạch dưới: trình tự nhận diện của enzym cắt giới hạn, mồi do IDT tổng hợp. GGATCC: trình tự nhận diện BamHI, GGTCTC: trình tự nhận diện BsaI; AAGCTT: trình tự nhận diện của HindIII
KẾT QUẢ
Tạo dòng E. coli BL21(DE3) mang vector tái tổ hợp pET.IFN
Gen exp_ifn (495 bp) và vector pET28b(+) (5,4 kbp) được thu nhận thành công và xử lý với enzym BamHI/HindIII. Hỗn hợp nối được biến nạp vào E. coli DH5α và lấy ngẫu nhiên 7 khuẩn lạc và PCR khuẩn lạc với cặp mồi
exp_ifn_F/exp_ifn_R (giếng 1-8, Hình 2A).
Plasmid chiết được từ 2 chủng cho kết quả PCR dương tính (chủng 1 và 5) được kiểm tra lại bằng PCR với cặp mồi exp_ifn_F/exp_ifn_R đều cho băng DNA đúng kích thước của gen exp_ifn (495 bp). Như vậy, 2 chủng E. coli DH5α mang vector pET.IFN đã được tạo dòng thành công, ký hiệu các chủng lần lượt là DN001, DN002.
3 kb 1 kb 0,5 kb
(A)
1 2 3 4 5 6 7 C+ M 1 2 3 4 5 6 7 8 M
(C)
3 kb 1,5 kb 1 kb hagC ifn hagN M
700 bp 600 bp 500 bp 350 bp 150 bp
(B)
Hình 2. (A): Sản phẩm PCR khuẩn lạc sàng lọc chủng mang vector pET.IFN, (B): Sản phẩm PCR đoạn hagC, ifn và hagN, (C): Sản phẩm PCR khuẩn lạc sàng lọc chủng mang vector pET.NIC
Thang DNA 1 kb, C+: plasmid pUC57.IFN Gen hagC (327 bp), ifn (495 bp), hagN (667 bp)
(Hình 2B) và vector pET28b(+) (5,4 kbp) được thu nhận thành công và xử lý với enzym BamHI/HindIII. Hỗn hợp nối được biến nạp vào E. coli DH5α và lấy ngẫu nhiên 8 khuẩn lạc và PCR khuẩn lạc với cặp mồi hagN_F và hagC-R (giếng 1-8, Hình 2C). Plasmid chiết được từ 2 chủng cho kết quả PCR dương tính (chủng 2 và 8) được kiểm tra lại bằng PCR với cặp mồi hagN_F và hagC-R đều cho băng DNA đúng kích thước của gen NIC (1489 bp). Như vậy, 2 chủng E. coli DH5α mang vector pET.NIC đã được tạo dòng thành công, ký hiệu các chủng là DN003 và DN004.
Plasmid pET.IFN chiết từ chủng E. coli DN001 và pET.NIC chiết từ chủng E. coli DN003 được chọn để biến nạp vào E. coli BL21(DE3).
Đối với các khuẩn lạc mọc trên môi trường, chọn ngẫu nhiên hai khuẩn lạc mọc trên môi trường thạch LB bổ sung kanamycin 30 g/ml đối với mỗi loại plasmid biến nạp được lựa chọn ngẫu nhiên để chiết plasmid và kiểm tra bằng PCR với cặp mồi đặc hiệu. Kết quả PCR đều cho băng tương ứng với băng DNA chủng E. coli BL21(DE3) mang vector pET.IFN và E. coli BL21(DE3) mang vector pET.NIC đã được tạo dòng thành công, ký hiệu chủng là DN005 và DN006 chứa plasmid pET.IFN; DN007 và
DN008 chứa plasmid pET.NIC, các chủng này sẽ được sử dụng để cảm ứng biểu hiện protein IFN-α2a và NIC, làm chứng dương việc kiểm tra biểu hiện của protein IFN-α2a khảm trên tiêm mao của B. subtilis.
Kiểm tra biểu hiện protein IFN-α2a và NIC tái tổ hợp
Kết quả biểu hiện protein IFN-α2a bởi 2 chủng DN005 và DN006 được kiểm tra trên gel SDS-PAGE 12% cho thấy mẫu protein pha tổng ở các chủng có cảm ứng IPTG đều xuất hiện băng protein kích thước khoảng 24 kDa, tương ứng với kích thước protein IFN-α2a dự đoán và không thấy sự xuất hiện của băng protein này ở mẫu chứng âm không cảm ứng bằng IPTG (Hình 3A). Kết quả biểu hiện protein NIC bởi hai chủng DN007 và DN008 cho thấy mẫu protein pha tổng của chủng DN008 cảm ứng IPTG xuất hiện băng protein kích thước khoảng 49,6 kDa tương ứng với kích thước protein NIC dự đoán (Hình 3B), không thấy sự xuất hiện của băng protein này ở mẫu chứng âm không cảm ứng bằng IPTG và chủng DN007.
Tạo dòng B. subtilis mang protein IFN- α2a khảm trong tiêm mao
Đoạn NIC được thu nhận bằng phản ứng PCR với cặp mồi hagN_F và hagC_R từ plasmid pET.NIC và được cắt giới hạn 2 đầu với BsaI, plasmid pDG364 được cắt giới hạn với BamHI/HindIII. Hỗn hợp nối của NIC và pDG364 được biến nạp vào E. coli DH5α và thu nhận được 6 khuẩn lạc tiềm năng bằng phương pháp PCR khuẩn lạc với cặp mồi hagN_F/hagC_R
(giếng 1-6, Hình 4A), chỉ có khuẩn lạc 3 có đoạn chèn NIC có kích thước đúng khoảng 1,5 kb. Kết quả kiểm tra bằng phản ứng cắt với BamHI cho thấy plasmid mở vòng của khuẩn lạc này có băng DNA kích thước khoảng 7,8 kb và lớn hơn kích thước của vector pDG364 (Hình 4B). Như vậy, 1 chủng E. coli mang vector pDG.NIC đã được tạo dòng thành công, ký hiệu các chủng từ DN009.
Plasmid pDG.NIC thu nhận từ chủng DN009 được gửi giải trình tự ở công ty PhuSa Biochem.
Kết quả không ghi nhận đột biến trên gen NIC.
Vector pDG.NIC được cắt giới hạn với enzym XhoI và được biến nạp vào tế bào khả nạp B. subtilis PY79. Sản phẩm biến nạp được trải trên môi trường thạch LB bổ sung chloramphenicol 5 μg/mL. Các khuẩn lạc mang gen tái tổ hợp NIC được sàng lọc lọc bằng phương pháp PCR khuẩn lạc, với cặp mồi hagN_F/hagC_R. Kết quả cho thấy, trong 11 khuẩn lạc được chọn ngẫu nhiên trên môi trường thạch LB bổ sung chloramphenicol 5 μg/mL, có 6 chủng (giếng 1, 2, 4, 5, 9 và 10, Hình 5A) khi PCR khuẩn lạc xuất hiện 2 băng DNA, có kích thước phù hợp với kích thước của 2 đoạn gen tương ứng là gen Hag (1165 bp) trong Bacillus và gen NIC (1489 bp) tái tổ hợp vào nhiễm sắc thể. 6 khuẩn lạc tiềm năng đồng thời cũng mất khả năng thủy giải tinh bột vì được chèn vào locus amyE của B.
subtilis (Hình 5B). Các chủng Bacillus subtilis cho kết quả PCR khuẩn lạc dương tính được lưu chủng mã DN010 đến DN015.
M C- DN 007
DN 008
49,6 kDa 75
kDa
63 48 35
25 M C- DN
005 DN 006
24 kDa 75
kDa
48
25
(A) (B)
Hình 3. (A): Phân tích biểu hiện protein IFN-α2a ở các chủng E. coli BL21(DE3) DN005 và DN 006 (B):
Phân tích biểu hiện protein NI ở các chủng E. coli BL21(DE3) DN007 và DN008.
M: protein marker Opti-XL, C-: chủng không cảm ứng IPTG
M 1 2 3 4 5 6 C+ pDG364 pDG364 BaMHI M BamHI pNIC pNIC
7,8 kb 3 kb
1 kb
(B) (C)
Hình 4. (A): Sản phẩm PCR khuẩn lạc sàng lọc chủng mang pNIC, C+: sản phẩm PCR chứng dương DNA NST B. subtilis PY79, (B): Kết quả cắt kiểm tra các plasmid pDG364 và pDG.NIC với BamHI
1 2 3 4 5 6 7 C 8 9
3 kb 1,5 kb
1 kb 10 11 M
(A) (B)
DN010 DN011 DN012
DN013 DN014 DN015
PY79
Hình 5. (A): Sản phẩm PCR khuẩn lạc sàng lọc chủng Bacillus subtilis mang gen NIC, (B): Kết quả kiểm tra khả năng thủy giải tinh bột của 6 chủng B. subtilis tái tổ hợp Kiểm tra khả năng biểu hiện tiêm mao của
chủng B. subtilis tái tổ hợp
Kết quả kiểm tra biểu hiện của protein IFN-α2a bằng Western Bot thể hiện trong Hình 6.
Kết quả cho thấy protein tái tổ hợp IFN-α2a và protein IFN dung hợp vào tiêm mao là NIC đều có khả năng biểu hiện IFN tương ứng với protein IFN-α2a thương mạicó gắn với PEG
(
Pegasys).
Đối với dịch chiết tiêm mao(16) của chủng B.
subtilis PY79 là chứng âm, không có băng phản ứng kháng nguyên và kháng thể. Trong 6 chủng
Bacillus tái tổ hợp được khảm protein IFN-α2a lên tiêm mao, kết quả cho thấy chỉ có 04/06 chủng có kết quả có hiện băng phản ứng của IFN với kháng thể tương ứng với kích thước của protein NIC là 49,6 kDa là chủng B. subtilis DN010, DN012, DN014 và DN015, 02/06 chủng không có khả năng biểu hiện protein IFN lên tiêm mao. Như vậy nghiên cứu đã thành công trong việc khảm protein IFN-α2a của người lên tiêm mao và biểu hiện thành công protein này trên tiêm mao.
2
75 kDa
48
25
1 3 4 DN
010 DN 011
DN 012
DN 013
DN 014
DN 015
C (-)
Hình 6. (A): Kết quả kiểm tra biểu hiện của protein IFN khảm trên tiêm mao bằng Western Blot với kháng thể Anti-IFN-α2. 1: Protein IFN-α2a thu nhận từ chủng E. coli DN005; 2: Protein NIC thu nhận từ chủng E.
coli DN008, 3: Chế phẩm IFN-α2a thương mại (Pegasys); M: protein marker Opti-XL; DN010-DN015: Dịch chiết tiêm mao của các chủng B. subtilis tái tổ hợp, C(-): Dịch chiết tiêm mao của B. subtilis PY79
BÀN LUẬN
Nghiên cứu đã đạt được mục tiêu tạo ra chủng B. subtilis PY79 mang gen tái tổ hợp NIC.
Để kiểm tra sự biểu hiện protein dung hợp trong tiêm mao của các chủng B. subtilis mang gen HagP-NIC tái tổ hợp, các protein chứng NICvà protein IFN-α2a cũng đã được biểu hiện thành công trong E. coli BL21 (DE3).
Kết quả thí nghiệm Western Blot của protein NIC và IFN-α2a được biểu hiện trong E. coli BL21 (DE3) đã xác định được tính kháng nguyên của protein IFN-α2a người khi được biểu hiện trong E. coli, cũng như tính kháng nguyên của protein dung hợp NIC đối với kháng thể Anti-IFN-α2. Như vậy, protein IFN-α2a và protein dung hợp NIC vẫn hoạt động bình thường và biểu hiện được protein IFN-α2a.
Trong thí nghiệm Western Blot dịch chiết tiêm mao của các chủng B. subtilis mang gen tái tổ hợp NIC với kháng thể Anti-IFN-α2, nghiên cứu ghi nhận có 4 chủng Bacillus subtilis có khả năng biểu hiện protein IFN trên tiêm mao, tuy nhiên có 2 chủng không biểu hiện thành công protein IFN-α2a mặc dù kết quả kiểm tra về DNA nhiễm sắc thể cho thấy đoạn gen mã hóa cho protein NIC đã được chèn vào nhiễm sắc thể của 2 chủng này. Điều này có thể lý giải do gen mã hóa cho protein IFN-α2a có kích thước 495 bp, lớn hơn kích thước của đoạn không bảo tồn của gen Hag được loại bỏ khoảng 200 bp, nên khi ta loại bỏ đoạn không bảo tồn để chèn đoạn gen mã hóa cho IFN-α2a có thể làm thay đổi khả năng tiết ra bề mặt tế bào của protein tiêm mao Hag. Mặt khác, protein tiêm mao Hag là một polymer được cấu tạo bởi 46 phân tử protein Hag monomer, vậy nên kích thước của phân tử protein Hag tái tổ hợp monomer lớn hơn (49,6 kDa của protein NIC) so với protein Hag nguyên thủy (36,2 kDa) có thể gây ảnh hưởng đến khả năng xuất của các protein tiêm mao Hag(17,18).
Protein hag của B. subtilis là một protein được biểu hiện mạnh trong tế bào và không phải protein thiết yếu nên những biến đổi di truyền
không làm ảnh hưởng đến sự sống của vi khuẩn(13). Điều này được thể hiện qua kết quả của đề tài khi đã tạo dòng thành công chủng B. subtilis mang protein IFN-α2a dung hợp trong tiêm mao mà vẫn biểu hiện tiêm mao.
Khi đó, B. subtilis trở thành giá mang cho protein, do vậy có thể sử dụng protein mà không cần thực hiện việc tinh chế. Vi khuẩn này sẽ được lên men và thu nhận ở dạng bào tử hoặc tế bào sinh dưỡng và cung cấp IFN-α2a khi được sử dụng như probiotic.
KẾT LUẬN
Protein IFN-α2a và protein IFN-α2a dung hợp vào gen hag là NIC đã được biểu hiện thành công trong E. coli. Đồng thời, nghiên cứu đã thu nhận được 04 chủng B. subtilis tái tổ hợp mang protein IFN-α2a khảm trong tiêm mao làm tiền đề cho thử nghiệm cung cấp IFN-α2a dưới dạng probiotic.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Garcin G, Paul F, Staufenbiel M, et al (2014). High efficiency cell- specific targeting of cytokine activity. Nature Communications, 5:3016.
2. Tsanev RG, Ivanov I (2001). Biological activities of interferon gamma In: Immune interferon : properties and clinical applications. Pharmacology and toxicology, 1st ed, pp: 25-39.
CRC Press, Boca Raton FL.
3. Cummins MJ, Pruitt B (1999). Low-dose oral use of human Interferon-alpha in cancer patients. Journal of Interferon &
Cytokine Research, 19(8):937-941.
4. Cummins MJ, Papas A, Kammer GM, et al (2003). Treatment of primary Sjögren's syndrome with low-dose human interferon alfa administered by the oromucosal route: combined phase III results. Arthritis and Rheumatism, 49(4):585-593.
5. Pedersen A (1998). IFN-alpha cream in the treatment of oral lichen planus. Oral Diseases, 4(2):155-156.
6. Taira S, Jalonen E, Paton JC, et al (1989). Production of pneumolysin, a pneumococcal toxin, in Bacillus subtilis. Gene, 77(2):211-218.
7. Palva I, Lehtovaara P, Kääriäinen L, et al (1983). Secretion of interferon by Bacillus subtilis. Gene, 22(2-3):229-235.
8. Hemilä H, Glode LM, Palva I (1989). Production of diphtheria toxin CRM228 in B. subtilis. FEMS Microbiology Letters, 53(1-2):193-198.
9. Runeberg-Nyman K, Engström O, Löfdahl S, et al (1987).
Expression and secretion of pertussis toxin subunit S1 in Bacillus subtilis. Microbial Pathogenesis, 3(6):461-468.
10. Isticato R, Cangiano G, Tran HT, et al (2001). Surface display of recombinant proteins on Bacillus subtilis spores. Journal of Bacteriology, 183(21):6294-6301.
11. Smith KD, Andersen-Nissen E, Hayashi F, et al (2003). Toll-like receptor 5 recognizes a conserved site on flagellin required for
protofilament formation and bacterial motility. Nat Immunol, 4(12):1247-53.
12. Muntel J, Fromion V, Goelzer A, et al (2014). Comprehensive absolute quantification of the cytosolic proteome of Bacillus subtilis by data independent, parallel fragmentation in liquid chromatography/mass spectrometry (LC/MS(E)). Mol Cell Proteomics, 13(4):1008-1019.
13. Commichau FM, Pietack N, Stulke J (2013). Essential genes in Bacillus subtilis: a re-evaluation after ten years. Molecular BioSystems, 9(6):1068-1075.
14. Boshtam M, Khanahmad Shahreza H, Feizollahzadeh S, et al (2018). Expression and purification of biologically active recombinant rabbit monocyte chemoattractant protein1 in Escherichia coli. FEMS Microbiol Lett, 365:9.
15. Cutting SM, Horn PBV (1990). Chapter 2: Genetic analysis. In Colin RH, Simon MC (eds). Molecular Biological Methods for Bacillus, pp.27-61. Wiley, New York.
16. Mukherjee S, Babitzke P, Kearns DB (2013). FliW and FliS function independently to control cytoplasmic flagellin levels in Bacillus subtilis. Journal of Bacteriology, 195(2):297-306.
17. Wang F, Burrage AM, Postel S, et al (2017). A structural model of flagellar filament switching across multiple bacterial species.
Nature Communications, 8:960.
18. Mukherjee S, Kearns DB (2014). The structure and regulation of flagella in Bacillus subtilis. Annual Review of Genetics, 48:319-340.
Ngày nhận bài báo: 11/12/2020
Ngày phản biện nhận xét bài báo: 05/01/2021 Ngày bài báo được đăng: 20/04/2021