123 Natural Sciences, 2020, Volume 65, Issue 3, pp. 123-129
This paper is available online at http://stdb.hnue.edu.vn
TỐI ƯU QUY TRÌNH PHÂN TÍCH ĐA HÌNH ĐƠN NUCLEOTID RS320 THUỘC GEN LIPOPROTEIN LIPASE N Ư I VIỆT NAM
Phạm Thị Bích Đào1, Dương Tuấn Linh2, Bùi Thị Thúy Nga2, Nguyễn Ánh Ngọc2, Trần Quang Thuyên3, Trần Thị Lan Anh4, Phùng Thanh Hương4 vàTrần Quang Bình2
1Bộ môn Y sinh, Trường Cao đẳng Dược Trung ương Hải Dương
2Viện Dinh Dưỡng, 3Viện Y học Dự phòng Quân đội
4Bộ môn Hóa sinh, Trường Đại học Dược Hà Nội
T . Đa h nh rs tr n g n Lipoprotein lipase (LPL) ư c o c o c li n quan n triglyc ri , chol st rol toàn phần, lipoprotein tỉ trọng cao, lipoprotein tỉ trọng thấp. Để phân tích a h nh này ở quần thể người Việt Nam, nghiên cứu có mục tiêu tối ưu phương ph p khu ch ại g n - Đa h nh chiều ài oạn cắt gi i hạn Polymerase chain reaction- restriction fragment length polymorphism - PCR - RFLP) v i các cặp mồi, chu trình nhiệt, enzyme gi i hạn ư c lựa chọn, thử nghiệm ể x c ịnh iều kiện tối ưu. t qu , ch ng t i tối ưu ư c quy tr nh P R v i nhiệt ắt cặp oC, ph n ứng cắt của của enzyme gi i hạn cần ít nhất ơn vị nzym HindIII. t số m u ại iện cho kiểu g n , T , TT sau khi x c ịnh ng P R - R P ư c phân tích lại ng phương ph p gi i tr nh tự cho k t qu tương ồng. Quy tr nh x c ịnh kiểu g n của a h nh rs ng phương ph p PCR - RFLP c thể p ụng tr n quy m l n ể x c ịnh tỉ lệ kiểu g n và phân tích mối li n quan gi a a h nh rs v i rối loạn lipi m u.
Từ khóa: Gen LPL, rs320, PCR - RFLP.
1.
Rối loạn lipid máu là tình trạng bệnh lí khi có m t hoặc nhiều thông số lipid bị rối loạn:
tăng chol st rol hoặc tăng triglyc ri T ), hoặc tăng lipoprot in tỉ trọng thấp (LDL-C), hoặc gi m lipoprotein tỉ trọng cao (HDL-C) [1 . u tố nguy cơ n t i rối loạn lipi m u gồm y u tố i truyền, y u tố m i trường, ch ăn, t p thể ục, o ph hay c c ệnh như tiểu ường, ệnh th n, ệnh gan. Trong y u tố i truyền chi m t i - 60% [2]. ho t i nay ph t hiện ư c hơn a h nh ơn nucl oi S P) trong loci tr n g n người c li n quan n rối loạn lipi m u 3 . t số g n li n quan n rối loạn lipi m u ư c x c ịnh là P , ABCA1 (ATP-binding cassette subfamily A member 1), LIPG (lipase G), PCSK9 (Proprotein convertase subtilisin/kexin type 9), LIPC (lipase C), CETP (Cholesteryl ester transfer protein), APOB (apoprotein B), APOE-C1-C4-C2 (apoprotein E-C1-C4-C2), APOA1-C3-A4-A5 (apoprotein A1-C3-A4-A5) [4]. Gen LPL n m trên cánh ngắn của nhiễm sắc thể số , vị trí . ao gồm xon và intron, chiều ài 30 kb [5], mã hóa cho enzyme LPL (Lipoprotein lipase) c vai tr thủy phân T của chylomicron và Lipoprotein tỉ trọng rất thấp D - Very Low Density Lipoproteins)
Ngày nh n bài: 4/7/2019. Ngày sửa bài: 6/2/2020. Ngày nh n ăng 13/2/2020.
Tác gi liên hệ: Phạm Thị Bích Đào. Địa chỉ e-mail: [email protected]
124
thành acid béo tự o và glyc rol. Đây là ư c quy t ịnh tốc của qu tr nh chuyển h a lipoprotein [6]. Các nghiên cứu lâm sàng cũng kiểm tra các t bi n mất chức năng của LPL d n t i rối loạn lipi m u như ệnh tăng chylomicron m u c tính chất gia nh [7] hoặc ệnh tăng lipoprot in [8]. ho t i nay c kho ng i n thể ư c x c ịnh trên gen LPL.
Trong a h nh ơn nucl oti rs là a h nh phổ bi n trên gen LPL [5] ư c báo cáo có li n quan n triglyc ri và nồng HD -C [9-11], cholesterol toàn phần [12, 13], LDL-C [14] ở m t số dân t c.
nhiều phương ph p x c ịnh S P như P R - RFLP (Polymerase chain reaction- restriction fragment length polymorphism) [15], AS - PCR (Allele-Specific PCR), realtime- PCR [16], gi i tr nh tự. Trong phương ph p P R - R P là k thu t chính x c, ít tốn k m và kh ng y u cầu c c thi t ị ắt tiền, thi t k cho PCR-RFLP dễ dàng [15 . Phương ph p P R- R P cũng ư c sử dụng ể phân tích a h nh ơn nucl oti tr n m t số gen tại các phòng thí nghiệm ở Việt am như APOA5 (Apolipoprotein A5) [17], CDKN2A (cyclin-dependent kinase Inhibitor 2A) [18].
Nghiên cứu này có mục tiêu tối ưu phương ph p P R-RFLP có tham kh o cặp mồi trong nghiên cứu của Ranjit ể phân tích a h nh ơn nucl oti rs thu c gen LPL ở người Việt Nam. K t qu của nghiên cứu này sẽ giúp cho việc phân tích a h nh g n P rs tr n quy mô l n trong nghiên cứu ti p theo.
2. N
2 Đ
* : ồm người ân t c Kinh từ 40 - 64 tuổi tại tỉnh Hà am tham gia nghi n cứu. Đề tài là m t phần của ghi n cứu thuần t p năm về ệnh i th o ường Typ và h i chứng chuyển h a ở người iệt am ai tr y u tố i truyền và lối sống ư c H i ồng y ức của Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương th o quy t ịnh số IRB-VN01057- 34/2016.
* Kit Wizard® Genomic ADN Purification (Promega, USA), GoTaq Green ast r mix x Prom ga), nư c tinh sạch GIBCO® UltraPure Distilled Water (Invitrogen), enzyme Hin B, nh Quốc), thạch garos Prom ga, ), ệm UltraPureTM 10X TBE Buffer (Invitrogen, ), R sa ntron Biot chnology, Hàn Quốc), thang chu n D ntron Biot chnology, Hàn Quốc)
* P ơ p áp á ết ADN từ máu toàn phần: Phương ph p t ch D từ t bào bạch cầu trong máu toàn phần sử dụng b Kit Wizard® Genomic ADN Purification (Promega, USA).
* Xá định kiểu gen bằ p ơ p áp RFLP-PCR
ư c . D ng phản ng C đ hu ch đại đoạn g n ch a rs
ặp mồi sử ụng gồm mồi xu i LPL rs ’- GATGCTACCTGGATAATCAAAG - ’ và mồi ngư c P rs R ’- TT T TT T T T - ’ DT, ) th o nghi n cứu của Ranjit [19].
iểm tra mồi tr n trang mạng Blast prim r 20 và Prim r w 21 x c ịnh tính ặc hiệu của mồi, chiều ài của s n ph m. Ti n hành thử nghiệm v i c c nhiệt ắt cặp kh c nhau ể lựa chọn nhiệt ắt cặp tối ưu cho quy tr nh.
ư c . Điện i đ i tra sản ph C
S n ph m P R ư c iện i tr n thạch agaros , ở 100V trong 40 phút, nhu m v i R sa , thang chu n D và ư c chụp h nh nh iện i tr n m y l oc.
ư c sản ph C v i n gi i hạn đ c hiệu v i rs nzym gi i hạn Hin tham kh o 19 c tr nh tự và vị trí cắt
125 ’ … ↓ TT… ’
’…TT ↑ …
iểm tra s n ph m cắt tr n trang mạng [22 v i nzym Hin ể x c ịnh s n ph m sau khi ủ nzym .
ấy s n ph m PCR ủ v i enzyme HindIII trong ph t ở oC.
ư c . Điện i i tra sản ph sau hi n
Điện di kiểm tra s n ph m sau ủ v i nzym tr n thạch , , ùng ệm TBE 0,5X, nhu m R Sa , sử ụng thang chu n D . iểm tra s n ph m sau khi iện i tr n m y l oc. Đ nh gi k t qu kiểu g n ng kích thư c của c c ăng iện i thu ư c tr n h nh nh iện i.
* P ơ p áp
Phương ph p gi i tr nh tự g n ùng ể kiểm tra k t qu x c ịnh kiểu gen b ng phương ph p P R-R P. S n ph m P R ư c tinh sạch. ấy m t số m u tương ứng v i kiểu g n TT, T , gửi c ng ti arog n, Hàn Quốc làm gi i tr nh tự g n. t qu gi i tr nh tự ư c so s nh v i k t qu phân tích kiểu g n của phương ph p P R-RFLP.
2.2. Kết quả và bàn luận
2 2 ả
iểm tra mồi tr n trang mạng Blast prim r 20 và Prim r w 21 cho s n ph m c kích thư c p. Sau ư c ti n hành ph n ứng P R ể x c ịnh nhiệt ắt cặp tối ưu.
Thành phần của ph n ứng P R , µ nư c tinh sạch; 6,0 µL master mix GoTaq Green PCR; 0,75 pmol mồi mỗi loại nồng pmol µl) µ D nồng ng µl) trong tổng thể tích là 12 µL.
hu tr nh ph n ứng giai oạn i n tính ở nhiệt 94 oC trong 3 phút; ti p theo 32 chu kì ở 94 o trong giây giai oạn ắt cặp trong giây ư c thực hiện ở 4 nhiệt khác nhau: 56 oC¸
57 oC, 58 oC, 59 o giai oạn kéo dài ở 72 o trong giây, giai oạn ủ ở nhiệt 72 oC trong 8 phút.
Hình 1. Hình đ ện di s n phẩm PCR của một s mẫu nghiên c u
126
Hình Hình ảnh điện di sản ph m PCR c a 3 mẫu nghiên c uở 4 nhiệt độ bắt c p 56 oC, 57 oC, 58 oC, 59 oC; gi ng 1, 2, 3: nhiệt độ bắt c p l oC; gi ng 4, 5, 6: nhiệt độ bắt c p l oC; gi ng 8, 9, 10: nhiệt độ bắt c p l oC; gi ng 11, 12, 13: nhiệt độ bắt c p l oC;
gi ng 14: là mẫu ch ng â (nư c); gi ng 7: thang chu n D
Hình Hình ảnh điện i sản ph sau hi n c a ẫu C ở nhiệt độ oC;
i ng ẫu sản ph C sau hi n gi ng thang chu n D
t qu iện di s n ph m PCR của 3 m u nghiên cứu ở 4 nhiệt bắt cặp oC, 57 oC, 58 oC, 59 o ư c thể hiện ở H nh cho thấy ở c 4 nhiệt bắt cặp ều c c c ăng iện di s n ph m P R, trong ở nhiệt o ăng m và r n t nhất.
ấy s n ph m ở nhiệt ắt cặp 57 oC ủ nzym HindIII trong ph t ở oC. Mỗi ph n ứng cắt enzyme chứa , µ nư c tinh sạch; 2,0 µL 10x NEBuffer; 0,15 µL Hin ơn vị) và 5,0 µL s n ph m PCR. S n ph m PCR sau ủ nzym ư c iện i thể hiện ở H nh B cho thấy m u , c ăng p và p, m u c ăng p và p, p.
hư v y nhiệt o là nhiệt ắt cặp tối ưu của quy tr nh x c ịnh g n của a h nh rs320. ư ng nzym Hin ủ là ơn vị ph n ứng.
2.2.2. Kết quả x ịnh kiểu gen
Sau khi kh o s t nhiệt ắt cặp và nzym HindIII, chúng tôi ti n hành x c ịnh kiểu gen của m t số m u nghiên cứu.
K t qu iện di s n ph m P R H nh ) và sau khi cắt b ng enzyme gi i hạn HindIII H nh B) của m t số m u nghiên cứu cho thấy tỉ lệ x c ịnh kiểu gen của các m u nghiên cứu là . ăn cứ vào c c ăng s n ph m sau khi ủ v i enzyme gi i hạn ể x c ịnh kiểu gen.
Các m u 3, 4, 9, 11, 13, 14, 15 mang kiểu gen TT. Các m u 1, 5, 6, 7, 8, , c kiểu gen TG.
M u 2 mang kiểu gen GG.
Hình 2. Hình đ ện di s n phẩm PCR (A) và sau khi cắt với enzyme giới hạn (B) của một s mẫu nghiên c u
A: K t quả điện di 15 sản ph m PCR 355bp, gi ng 1 - 8 và 10 - 16: các mẫu nghiên c u, gi ng 9:
thang chu n D gi ng Ch ng â ; B: K t quả điện di 15 sản ph m PCR sau khi v i enzyme HindIII, gi ng 1 - 8 và 10 - 16: các mẫu nghiên c u, gi ng 9: thang chu n D
127 2.2.3. Kiể r chính xác củ
t số m u tương ứng v i kiểu g n , T , TT sau khi x c ịnh ng P R- R P ư c m gi i tr nh tự. t qu H nh cho thấy tại vị trí S P rs vị trí nucl oti ) kiểu g n ư c iểu thị màu n H nh ), kiểu g n T ư c iểu thị màu và n H nh B), kiểu g n TT ư c iểu thị màu H nh ). t qu cho thấy x c ịnh kiểu g n ng phương ph p P R-R P hoàn toàn trùng kh p v i k t qu gi i tr nh tự.
hư v y phương ph p x c ịnh kiểu g n ng phương ph p P R - RFLP ở nghiên cứu này ư c kh o s t và triển khai là k thu t chính x c, kh ng y u cầu c c thi t ị ắt tiền, kh ng y u cầu k thu t cao, thi t k dễ àng và c thể áp dụng ở nhiều phòng thí nghiệm tại Việt Nam ể x c ịnh kiểu gen LPL rs320 ở người Việt Nam.
. ế ủ ẫ ể Hình i u g n hình i u g n T hình C i u g n TT
3. Kết luận
Quy tr nh x c ịnh kiểu gen LPL rs320 b ng phương ph p P R-RFLP ở quần thể người Việt am ư c tối ưu gồm ư c sau:
Bư c 1: ùng ph n ứng P R ể khu ch ại oạn g n chứa S P rs v i nhiệt bắt mồi là 57 oC; Bư c iện i ể kiểm tra s n ph m P R Bư c 3: s n ph m P R ư c cắt b ng
128
enzyme gi i hạn HindIII v i ơn vị/ph n ứng; Bư c iện di s n ph m sau khi ủ nzym tr n thạch agaros , trong ph t ở 100 V.
Quy tr nh này c thể p ụng ể x c ịnh tỉ lệ kiểu g n và phân tích mối li n quan gi a a h nh rs v i rối loạn lipi .
Lời c ơ . Nghiên cứu này ư c tài tr bởi Qu Phát triển khoa học và công nghệ Quốc gia OST D) trong ề tài mã số 106-YS.01-2015.10.
T I LIỆU THA H O
[1] B t , . Hư ng ẫn v đi u tr ệnh nội ti t - chu n h a. hà xuất n học, tr. 255-275.
[2] Weiss, L. A., Pan, L., Abney, M., & Ober, 2006. The sex-specific genetic architecture of quantitative traits in humans. Nature Genetics, 38, 2, 218.
[3] Hernandez, M. M., Williams, F. M. M., Potter, T., Valdes, A. M., Spector, T., & Menni, 2017. Genetic and microbiome influence on lipid metabolism and dyslipidemia. Physiological Genomics, 50, 2, 117-126.
[4] Luo, H., Zhang, X., Shuai, P., Miao, Y., Ye, Z., & Lin, Y., 2017. Genetic variants influencing lipid levels and risk of dyslipidemia in Chinese population. Journal of Genetics, 96, 6, 985-992.
[5] Rojas, M. P., Prieto, C., Bermúdez, V., Garicano, C., Nava, T. N., Martínez, M. S., ...&
Martínez, N. G., 2017. Dyslipidemia: Genetics, lipoprotein lipase and HindIII polymorphism. F1000Research, 6, 2073
[6] Chamberlain, J. C., Thorn, J. A., Oka, K., Galton, D. J., & Stocks, J., 1989. DNA polymorphisms at the lipoprotein lipase gene: associations in normal and hypertriglyceridaemic subjects. Atherosclerosis, 79, 1, 85-91.
[7] Mead, J. R., Irvine, S. A., & Ramji, D. P., 2002. Lipoprotein lipase: structure, function, regulation, and role in disease. Journal of molecular medicine, 80, 12, 753-769.
[8] Holmes, R. S., Vandeberg, J. L., & Cox, L. A., 2011. Comparative studies of vertebrate lipoprotein lipase: a key enzyme of very low density lipoprotein metabolism. Comparative Biochemistry and Physiology Part D: Genomics and Proteomics, 6, 2, 224-234.
[9] Ahn, Y. I., Kamboh, M. I., Hamman, R. F., Cole, S. A., & Ferrell, R. E., 1993. Two DNA polymorphisms in the lipoprotein lipase gene and their associations with factors related to cardiovascular disease. Journal of Lipid Research, 34, 3, 421-428.
[10] Jemaa, R. I. A. D. H., Fumeron, F., Poirier, O., Lecerf, L., Evans, A., Arveiler, Fruchart, J.
C., 1995. Lipoprotein lipase gene polymorphisms: associations with myocardial infarction and lipoprotein levels, the ECTIM study. Journal of Lipid Research, 36, 10, 2141-2146.
[11] Peacock, R. E., Hamsten, A., Nilsson-Ehle, P., & Humphries, S. E., 1992. Associations between lipoprotein lipase gene polymorphisms and plasma correlations of lipids, lipoproteins and lipase activities in young myocardial infarction survivors and age- matched healthy individuals from Sweden. Atherosclerosis, 97, 2-3, 171-185.
[12] Mattu, R. K., Needham, E. W., Morgan, R., Rees, A., Hackshaw, A. K., Stocks, J., &
Galton, D. J., 1994. DNA variants at the LPL gene locus associate with angiographically defined severity of atherosclerosis and serum lipoprotein levels in a Welsh population.
Arteriosclerosis and thrombosis: Journal of Vascular Biology, 14, 7, 1090-1097.
129 [13] Thorn, J. A., Chamberlain, J. C., Alcolado, J. C., Oka, K., Chan, L., Stocks, J., & Galton, D. J., 1990. Lipoprotein and hepatic lipase gene variants in coronary atherosclerosis.
Atherosclerosis, 85, 1, 55-60.
[14] Larson, I., Hoffmann, M. M., Ordovas, J. M., Schaefer, E. J., März, W., & Kreuzer, J., 1999. The lipoprotein lipase HindIII polymorphism: association with total cholesterol and LDL-cholesterol, but not with HDL and triglycerides in 342 females. Clinical Chemistry, 45, 7, 963-968.
[15] Rasmussen, H. B., 2012. Gel electrophoresis-principles and basics. In Tech, 315-334 [16] Rahman, M. T., Uddin, M. S., Sultana, R., Moue, A., & Setu, M., 2013. Polymerase chain
reaction (PCR): a short review. J. of Anwer Khan Modern Medical College, 4, 1, 30-36.
[17] Nguyễn Thị Hồng Hạnh, Phạm Trần Phương, Trần Quang Bình, 2016. Tối ưu ho quy tr nh x c ịnh kiểu gen của a h nh PO rs ở trẻ em nam 6 - 11 tuổi tại Hà N i.
Tạp chí Khoa học, Trường Đại học Sư phạm Hà N i, 61, 4, 130-136.
[18] Nguyễn Thị Trung Thu, Phạm Trần Phương, Trần Quang Bình, . X c ịnh a hình rs10811661 gen CDKN2A trên quần thể người Việt Nam sử dụng phương ph p AS-PCR và RFLP-PCR. Tạp chí Khoa học, Trường Đại học Sư phạm Hà N i, 62, 3, 114-120.
[19] Pusapati Madan Ranjit, Girijasankar Guntuku, 2017. Association of Lipid Profile, Atherogenic Indices, and LPL HindIII Gene Polymorphism with Coronary Artery Disease Positive Subjects. International Journal of Pharmaceutical and Clinical Research, 9, 1, 6-15.
[20] Primer-blast https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/truy c p . [21] Primer3web http://primer3.ut.ee/ truy c p .
[22] Restrictionmapper http://www.restrictionmapper.org/ truy c p ngày .
ABSTRACT
The optimal protocol for analysis of single nucleotide polymorphism rs320 on Lipoprotein Lipase gene of Vietnamese populations
Pham Thi Bich Dao1, Duong Tuan Linh2, Bui Thi Thuy Nga2, Nguyen Anh Ngoc2, Tran Quang Thuyen3, Tran Thi Lan Anh4, Phung Thanh Huong4,Tran Quang Binh2
1Department of Biomedicine Hai Duong Central College of Pharmacy
2National Institute of Nutrition, 3Military Institute of Preventive Medicine
4Department of Biochemistry, Hanoi University of Pharmacy
The rs320 polymorphism of LPL gene has been reported to be associated with triglycerides, total cholesterol, HDL-C, and LDL-C. To analyze this polymorphism in Vienamese populations, the study aimed to optimize the polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism (PCR-RFLP) method with primers, thermal cycles, and restriction enzyme which were selected and tested to identify opimal condition of PCR-RFLP method. The GG, TG, and TT genotypes by PCR - RFLP methods were confirmed by the sequencing method. The experimental results determined the annealing temperature of 57 oC for PCR, the minimum 3 units of HindIII for incubation with PCR product. In conclusion, this optimal PCR-RFLP method can be applied to genotype LPLrs320 in large populations to investigate the association between the rs320 polymorphism and dyslipidemia.
Keywords: LPL gene, rs320, PCR - RFLP.
