3.4.1 Penyiapan Bahan (Amelia, 2011)
Sampel yang digunakan adalah daun Garcinia benthami Pierre didapatkan dalam keadaan sampel kering diproleh dari kebun raya Bogor yang sebelumnya telah dilakukan dengan pengumpulan bahan berupa daun segar sebanyak 2 kilogram pada bulan Februari 2014 dan identitas biologi tumbuhan ini ditentukan oleh ahli botani Hebarium Bogoriense, LIPI (Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia), Bogor.
Selanjutnya dilakukan sortasi basah serta dicuci untuk
menghilangkan pengotor yang masih menempel pada bahan. Sortasi dilakukan untuk memisahkan kotoran-kotoran atau bahan-bahan asing sehingga dapat mengurangi jumlah pengotor yang ikut terbawa dalam bahan uji, setelah itu dikeringkan di Balai Peneliti Tanaman Rempah dan Obat Bogor dengan mengunakan Oven suhu 40ºC selama 5 hari. Daun yang sudah kering didapatkan sebanyak 1 kilogram.
Simplisia yang telah kering disortasi kembali dari kotoran-kotoran yang tertinggal. Simplisia yang telah disortir, dipotong menjadi bagian kecil dan diblender menjadi serbuk halus.
3.4.2 Pembuatan Ekstrak (Amelia, 2011)
Serbuk simplisia daun Garcinia benthami Pierre yang digunakan dalam percobaan sebanyak 700 gram dimasukkan kedalam alat maserasi (botol coklat). Ekstrak dibuat dengan metode remaserasi bertingkat dengan mengunakan pelarut yang memiliki kepolaran meningkat yaitu pelarut
n-heksana (non-polar), etil asetat (semi polar), dan (metanol polar). Proses remaserasi didiamkan selama 2-3 hari sambil sesekali dilakukan pengadukan. Setelah 2-3 hari maserat disaring menggunakan corong yang
dilapiskan dengan kapas selanjutnya disaring dengan menggunakan kertas saring agar tersaring sempurna.
Maserat pertama yang didapatkan adalah maserat n-heksana. Ampas kemudian diangin-anginkan agar bebas dari pelarut n-heksana lalu dimaserasi kembali dengan etil asetat, setelah didapatkan maserat etil asetat, ampas dimaserasi kembali menggunakan pelarut metanol sampai didapatkan maserat metanol. Masing-masing maserat yang didapatkan kemudian diuapkan pelarutnya mengunakan vakum rotary evaporator
dengan suhu 40ºC dan didapatkan ekstrak kental dari masing-masing pelarut. Ekstrak yang didapatkan kemudian disimpan di dalam lemari pendingin dibagian refrigerator.
Keuntungan ekstraksi dengan cara maserasi adalah pengerjaan dan peralatan yang digunakan sederhana, sedangkan kerugiannya yakni cara pengerjaannya lama, membutuhkan pelarut yang banyak dan penyarian kurang sempurna.
3.4.3 Rendemen Total Ekstrak Garcinia benthami Pierre
Rendemen ekstrak daun Garcinia benthami Pierre total dihitung dengan membandingkan berat awal serbuk simplisia dengan berat akhir ekstrak daun Garcinia benthami Pierre total yang diperoleh (Depkes, 2002).
% Rendemen : bobot ekstrak total yang diperoleh x 100% Bobot serbuk simplisia yang diekstraksi
3.4.4 Penapisan Fitokimia
Penapisan fitokimia dilakukan untuk melihat kandungan golongan senyawa yang terdapat didalam ekstrak daun Garcinia benthami Pierre. Pengujian fitokimia meliputi :
a. Alkaloid
Untuk mengidentifikasi alkaloid, ekstrak dilarutkan dengan etanol 96% kemudian ditambahkan asam klorida encer 2 N. Filtrat yang diperoleh disaring kemudian diidentifikasi menggunakan pereaksi Mayer, Bouchardat, Dragendorff. Pada penambahan Mayer, hasil positif ditandai dengan terbentuknya endapan berwarna putih atau kuning. Hasil positif
26
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta Dragendorff ditunjukkan dengan terbentuknya endapan berwarna merah bata. Penambahan Bouchardat memberikan hasil positif jika terbentuk endapan coklat sampai hitam (Materia Medika, 1980).
b. Saponin
Ekstrak ditambahkan 5 mL aquadest panas, didinginkan kemudian dikocok kuat-kuat selama 10 menit. Hasil positif ditunjukkan dengan terbentuknya buih yang stabil selama tidak kurang dari 10 menit setinggi 1-10 cm dan pada penambahan 1 tetes asam klorida 2 N buih tidak hilang (Materia medika, 1980).
c. Tanin
Sebanyak 0,5 gram ekstrak dimasukan ke dalam tabung reaksi, ditambahkan dengan FeCl3 0,1 %. Terbentuknya warna biru- hitam, hijau atau biru hijau dan endapan menunjukan adanya tanin (Fanswoth, 2012). d. Flavonoid
Ekstrak dilarutkan dalam 1 mL etanol 96% kemudian ditambahkan sebanyak 0,1 gram serbuk Mg dan 5 tetes asam klorida pekat. Jika terbentuk warna merah jingga sampai merah ungu, menunjukkan adanya flavonoid. Jika terbentuk warna kuning jingga menunjukkan adanya flavon, kalkon dan auron (Materia Medika, 1980).
e. Kuinon
Sejumlah lebih kurang 5 mL larutan ekstrak ditambah natrium hidroksida 1N, adanya kuinon ditunjukkan dengan terbentuknya warna merah (Fanswoth, 1969).
f. Steroid / Terpenoid
Sejumlah 1 mL larutan ekstrak ditambah 0,5 mL anhidrida asetat dan 0,5 mL CHCl3 selanjutnya ditambah H2SO4 pekat setetes demi setetes
sebanyak 0,2 mL ke dasar tabung dan diamati terjadinya warna ungu (Materia medika, 1980).
3.4.5 Pengujian Aktivitas Antimikroba ekstrak n-heksana, etil asetat dan ekstrak metanol Daun Garcinia benthami Pierre dengan Metode Dilusi.
3.4.5.1Sterilisasi Alat
Alat-alat yang digunakan dalam penelitian uji aktivitas antimikroba ini disterilkan terlebih dahulu. Alat-alat gelas dan media disterilkan dalam autoklaf pada suhu 121ºC selama 15 menit, ose dan pinset dibakar dengan pembakaran diatas api langsung (Deby et al., 2012).
3.4.5.2Pembuatan Medium (Deby et al., 2012). a. Medium Nutrient Agar ( NA)
NA ditimbang sebanyak 2,3 gram dilarutkan dalam 1 liter aquades. Setelah semua bahan tercampur, medium dipanaskan hingga larut sempurna, lalu disterilkan dengan autoklaf pada suhu 121°C selama 15 menit.
b. Medium Nutrient Broth ( NB)
Sebanyak 8 gram serbuk NB ditambah 1 liter aquades dipanaskan sampai mendidih kemudian disterilkan di autoklaf pada suhu 121°C selama 15 menit, setelah agak dingin disimpan dalam lemari pendigin dan dapat digunakan.
3.4.5.3Persiapan Inokulum
Bakteri yang digunakan dalam penelitian ini adalah Staphylococcus aureus dan Escherichia coli.
a. Peremajaan Bakteri Uji
Bakteri uji diremajakan pada medium Nutrient Agar (NA) miring steril. Mikroba uji diinokulasi sebanyak satu ose ke dalam medium NA dan inkubasi pada suhu 37°C selama 24 jam. Peremajaan dilakukan dalam kondisi steril didalam Laminar Air Flow (LAF) (Deby et al., 2012).
b. Pembuatan Suspensi Bakteri (Dwyana, et al., 2012). 1. Pembuatan suspensi bakteri Staphylococcus aureus
Bakteri uji yang telah diremajakan selama 24 jam, masing-masing diambil satu ose kemudian disuspensikan kedalam larutan NaCl fisiologis 0,9% steril, setelah itu dihomogenkan. Kemudian
28
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
suspensi diukur dengan menggunakan spektrofotometer, sebagai blanko digunakan NaCl 0,9% pada panjang gelombang 625 nm. 2. Pembuatan suspensi bakteri Escherichia coli
Bakteri uji yang telah diremajakan pada suhu 37°C selama 24 jam, masing-masing diambil satu ose kemudian disuspensikan kedalam larutan NaCl 0,9% steril, setelah itu dihomogenkan. Kemudian suspensi diukur asorbansinya menggunakan spektrofotometer, sebagai blanko digunakan NaCl 0,9% pada panjang gelombang 625 nm.
3.4.5.4Penyiapan larutan induk uji ekstrak n-heksana, ekstrak etil asetat dan metanol.
Larutan uji dibuat dengan melarutkan ekstrak Garcinia benthami
Pierre dengan pelarut DMSO 100% dengan cara ditimbang 0,02 gram ekstrak dilarutkan dalam 10 mL DMSO 100% (Larutan induk) 2000 µg/mL. Konsentrasi larutan uji yang digunakan adalah 1000µg/mL, 500µg/mL, 250µg/mL; 125µg/mL, dan 62,5µg/mL (Paturusi et al., 2011). 3.4.5.5Pembuatan Larutan kloramfenikol (Wardani et al., 2012).
Ditimbang 1 mg kloramfenikol. Dilarutkan dalam 1 mL aquades steril. Kemudian diambil dengan cara : Sebamyak 0,5 mL larutan kloramfenikol ditambahkan 0,1 mL bakteri uji 106 CFU/Ml dan di ad 0,4 mL nutrient broth.
3.4.5.8Pembuatan Larutan Kontrol Negatif (Wardani et al., 2012).
Sebanyak 0,5 mL NB dalam tabung reaksi ditambahkan 0,5 mL larutan DMSO vortex diambil 0,5 mL dibuang ditambahkan 0,1 bakteri uji 106 CFU/mL dan di ad 0,4 mL NB.
3.4.5.9Penentuan Aktivitas Antimikroba Daun Garcinia benthami Pierre terhadap Mikroba Uji (Metode Dilusi Cair) (Wardani et al., 2012).
Metode dilusi cair dilakukan dengan menyiapkan beberapa tabung rekasi yang sudah steril, larutan uji dan bakteri uji sebagai kontrol negatif, larutan antibiotik pembanding dan bakteri uji sebagai kontrol positif. Selanjutnya tiap-tiap tabung diisi dengan 0,5 mL medium NB. Selanjutnya ditambahkan 0,5 mL larutan uji pada tabung reaksi pertama di vortex. dari
tabung pertama diambil 0,5 mL dipindahkan kedalam tabung kedua dan seterusnya sampai konsentrasi 62,5%. Lalu diambil 0,5 mL larutan pada
tabung terakhir dan dibuang, sehingga masing-masing tabung berisi 0,5 mL. Kemudian masing-masing tabung ditambahkan 0,1 mL
suspensi bakteri dan 0,4 mL Nutrient Broth dengan volum total masing- masing tabung adalah 1 mL dan di vortex. Selanjutnya diinkubasi dalam inkubator pada suhu 37ºC selama 24 jam. Diamati kekeruhan dan dibandingkan dengan kontrol positif (kloramfenikol), kontrol negatif (DMSO) dan kontrol media. Kosentrasi paling rendah yang tidak menunjukan kejernihan adalah KHM.
Aktivitas antimikroba dari ekstrak tanaman diklasifikasikan kuat jika
nilai KHM < 100 µg/mL, sedang jika 100> KHM ≤ 625 µg/mL dan lemah
jika nilai KHM > 625 µg/mL (Kuete et al., 2011).
Untuk mengetahui KBM, dilakukan penggoresan dari tabung larutan 1000 µg/mL, 500 µg/mL, 250 µg/mL, 125 µg/mL, 62,5 µg/mL dari KHM pada media padat, kemudian diinkubasi pada suhu 37°C selama 24 jam. Setelah 24 jam, Kosentrasi paling rendah yang tidak menunjukan adanya pertumbuhan koloni bakteri pada media padat adalah KBM.
30 UIN Syarif Hidayatullah Jakarta BAB 1V