2) Steroid
4.3 Aktivitas Antioksidan
Antioksidan merupakan senyawa pemberi elektron (electron donor) atau reduktan. Senyawa ini memiliki berat molekul kecil, tetapi mampu
menginaktivasi berkembangnya reaksi oksidasi, dengan cara mencegah terbentuknya radikal. Antioksidan juga merupakan senyawa yang dapat menghambat reaksi oksidasi, dengan mengikat radikal bebas dan molekul yang sangat reaktif (Winarsi 2007). Keberadaan senyawa antioksidan ini dalam suatu bahan dapat dideteksi dengan melakukan uji aktivitas antioksidan. Uji aktivitas antioksidan pada tiga ekstrak selada air (daun, batang dan selada air utuh) dilakukan dengan metode uji DPPH.
Metode uji DPPH merupakan salah satu metode yang paling banyak digunakan untuk memperkirakan efisiensi kinerja dari substansi yang berperan sebagai antioksidan (Molyneux 2004). Senyawa 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) merupakan radikal bebas yang stabil pada suhu kamar dan sering digunakan untuk mengevaluasi aktivitas antioksidan beberapa senyawa atau ekstrak bahan alam (Rakesh et al. 2010, Suratmo 2009). Senyawa DPPH menerima elektron atau radikal hidrogen akan membentuk molekul diamagnetik yang stabil. Interaksi antioksidan dengan DPPH baik secara transfer elektron atau radikal hidrogen pada DPPH, akan menetralkan karakter radikal bebas dari DPPH (Suratmo 2009).
Metode uji aktivitas antioksidan dengan menggunakan radikal bebas DPPH dipilih karena merupakan metode yang sederhana, mudah, dan menggunakan sampel dalam jumlah yang sedikit dengan waktu yang singkat (Hanani et al. 2005). Metanol dipilih sebagai pelarut karena metanol dapat melarutkan kristal DPPH (Molyneux 2004). Metanol juga cenderung lebih murah dibanding pelarut organik yang lain (Andayani et al. 2008).
Antioksidan pembanding yang digunakan pada penelitian ini adalah antioksidan sintetik butylated hydroxytoluene (BHT). Larutan BHT pada penelitian ini dibuat dengan konsentrasi 2, 4, 6 dan 8 ppm melalui proses pengenceran larutan stok BHT 250 ppm. Konsentrasi larutan ekstrak kasar selada
air yang diuji dengan metode DPPH ini adalah sebesar 200, 400, 600 dan 800 ppm. Konsentrasi tersebut diperoleh melalui proses pengenceran dari masing-masing larutan stok ekstrak kasar selada air 1000 ppm. Perhitungan
pembuatan larutan stok dan proses pengencerannya dapat dilihat pada Lampiran 5. Larutan stok ekstrak selada air dan BHT dapat dilihat pada Gambar 8.
Gambar 8. Larutan stok ekstrak selada air dan BHT (Kiri-kanan: daun, batang, utuh, BHT)
Adanya aktivitas antioksidan dari sampel mengakibatkan perubahan warna pada larutan DPPH dalam metanol yang semula berwarna violet pekat menjadi kuning pucat (Andayani et al. 2008). Ekstrak daun selada air dalam penelitian ini menunjukkan warna hijau. Hal ini diduga karena warna pigmen klorofil yang mendominasi pada daun sehingga warna larutan menjadi kehijauan. Perubahan warna yang mengindikasikan adanya reaksi peredaman radikal bebas DPPH oleh senyawa antioksidan pada larutan BHT dan larutan ekstrak selada air dapat dilihat pada Gambar 9.
Intensitas perubahan warna yang terjadi pada larutan BHT dan larutan ekstrak kasar selada air ini dapat diukur absorbansinya dengan menggunakan spektofotometer pada panjang gelombang 517 nm yang merupakan panjang gelombang maksimum DPPH. Hal tersebut dilakukan dalam penelitian Özen (2009) yang menggunakan panjang gelombang 517 nm untuk mengukur absorbansi ekstrak selada air dari Turki. Nilai absorbansi tersebut selanjutnya digunakan untuk perhitungan persen inhibisi dan IC50 dari antioksidan BHT dan masing-masing ekstrak selada air.
Keterangan : a = BHT + DPPH 1 mM b = ekstrak daun + DPPH 1 mM c = ekstrak batang + DPPH 1 mM d = ekstrak utuh + DPPH 1 mM
Gambar 9. Perubahan warna yang mengindikasikan reaksi peredaman DPPH
Persen inhibisi adalah kemampuan suatu bahan untuk menghambat aktivitas radikal bebas, yang berhubungan dengan konsentrasi suatu bahan. Persen inhibisi ini didapatkan dari perbedaan serapan antara absorban DPPH dengan
absorban sampel yang diukur dengan spektrofotometer UV-Vis (Andayani et al. 2008). Parameter yang dipakai untuk menunjukkan aktivitas
antioksidan adalah Inhibition Concentration (IC50) yaitu konsentrasi suatu zat antioksidan yang dapat menyebabkan 50% DPPH kehilangan karakter radikal atau konsentrasi suatu zat antioksidan yang memberikan persen penghambatan 50% (Suratmo 2009). Semakin kecil nilai IC50 berarti aktivitas antioksidannya semakin tinggi (Molyneux 2004). Perhitungan persen inhibisi dan IC50 dapat dilihat pada Lampiran 6. Hasil uji aktivitas antioksidan BHT dan masing-masing ekstrak kasar selada air dapat dilihat pada Tabel 5.
a b
Tabel 5. Hasil uji aktivitas antioksidan Sampel % Inhibisi IC50 (ppm) BHT 2 ppm 4 ppm 6 ppm 8 ppm 4,96 24,32 46,80 62,85 67,28 200 ppm 400 ppm 600 ppm 800 ppm Ekstrak daun 42,24 53,34 67,32 81,64 331,39 Ekstrak batang 23,85 48,92 68,52 82,54 439,10 Ekstrak utuh 36,93 59,92 67,96 74,28 337,32
Konsentrasi larutan ekstrak yang digunakan dalam penelitian ini yaitu 200 ppm, 400 ppm, 600 ppm dan 800 ppm. Konsentrasi tersebut mengacu kepada hasil penelitian Özen (2009) yang meneliti aktivitas antioksidan selada air dari Turki dengan konsentrasi 50 ppm, 100 ppm, 250 ppm dan 500 ppm, dimana ekstrak etanol dengan konsentrasi 500 ppm menunjukkan aktivitas antioksidan yang tinggi dan penghambatan peroksidasi lipid yang besar sebesar 96,34%.
Konsentrasi larutan BHT yang digunakan dalam penelitian ini yaitu 2 ppm, 4 ppm, 6 ppm dan 8 ppm dipilih berdasarkan hasil penelitian Hanani et al. (2005), dimana dengan menguji keempat konsentrasi tersebut
diperoleh nilai IC50 BHT sebesar 3,81 ppm. Nilai IC50 BHT yang diperoleh pada penelitian ini sebesar 4,96 ppm. Nilai IC50 BHT ini tidak jauh berbeda dengan nilai yang diperoleh Hanani et al. (2005) dalam penelitiannya dan Susanto (2010) dengan nilai IC50 BHT sebesar 4,91 ppm. Hasil tersebut menunjukkan bahwa antioksidan BHT merupakan antioksidan dengan aktivitas yang sangat kuat, karena menurut Molyneux (2004), IC50 < 50 ppm merupakan antioksidan yang sangat kuat. Pengujian aktivitas antioksidan BHT ini menghasilkan hubungan antara konsentrasi BHT yang digunakan dengan persen inhibisinya, yang dapat dilihat pada Gambar 10.
Gambar 10. Grafik hubungan konsentrasi BHT dengan persen inhibisinya
Tabel 5 menunjukkan bahwa ketiga ekstrak kasar selada air juga memiliki aktivitas antioksidan seperti BHT, walaupun aktivitasnya tergolong lemah. Ketiga ekstrak kasar selada air (daun, batang, dan selada air utuh) memiliki kekuatan penghambatan yang berbeda-beda antara yang satu dengan yang lainnya. Pengujian aktivitas antioksidan dari masing-masing ekstrak kasar menghasilkan hubungan antara konsentrasi ekstrak kasar yang digunakan dengan persen inhibisinya, yang dapat dilihat pada Gambar 11.
Gambar 11. Grafik hubungan konsentrasi ekstrak kasar selada air dengan rata-rata persen inhibisinya
y = 7.245x + 14.08 R² = 0.926 0 10 20 30 40 50 60 70 80 0 2 4 6 8 10 % Inhi bis i Konsentrasi (ppm) y = 0.066x + 28.10 R² = 0.996 y = 0.097x + 7.042 R² = 0.984 y = 0.06x + 29.74 R² = 0.902 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 0 200 400 600 800 1000 % Inhi bis i Konsentrasi (ppm) daun batang utuh
Gambar 11 menunjukkan bahwa persen inhibisi tertinggi dihasilkan oleh larutan yang mengandung konsentrasi ekstrak kasar yang terbanyak, yaitu larutan dengan konsentrasi 800 ppm pada masing-masing ekstrak kasar. Persen inhibisi terendah dihasilkan oleh larutan yang mengandung konsentrasi ekstrak kasar terkecil yaitu larutan dengan konsentrasi 200 ppm. Hal ini menunjukkan bahwa semakin tinggi konsentrasi ekstrak kasar selada air yang ditambahkan, maka semakin tinggi persen inhibisi yang dihasilkan. Hal tersebut sesuai dengan penelitian yang dilakukan oleh Hanani et al. (2005) yaitu bahwa persentase penghambatan ekstrak terhadap aktivitas radikal bebas meningkat dengan meningkatnya konsentrasi ekstrak. Nilai rata-rata IC50 BHT dan ekstrak kasar selada air (daun, batang dan selada air utuh) dapat dilihat pada Gambar 12.
Gambar 12. Diagram batang nilai rata-rata IC50 BHT dan ekstrak selada air
Semakin kecil nilai IC50 menunjukkan bahwa aktivitas antioksidannya semakin tinggi (Molyneux 2004). Diagram batang pada Gambar 12, menunjukkan bahwa ekstrak daun selada air memiliki aktivitas antioksidan yang lebih besar dari dua ekstrak selada air lainnya, ditandai dengan nilai IC50-nya yang terkecil, yaitu 331,39 ppm. Ekstrak batang selada air merupakan ekstrak yang memiliki aktivitas antioksidan yang paling lemah ditunjukkan dengan nilai IC50-nya yang terbesar, yaitu 439,10 ppm. 331,39 439,10 337,32 4,96 0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500
Daun Batang Utuh BHT
Ra ta -ra ta I C50 (pp m )
Rendemen ekstrak daun selada air dan selada air utuh lebih sedikit dari rendemen ekstrak batang selada air, walaupun begitu aktivitas antioksidan ekstrak daun lebih kuat. Hal ini diduga karena pada ekstrak daun selada air dan selada air utuh terdapat komponen fenol yang terdeteksi melalui uji fitokimia, sedangkan pada ekstrak batang selada air tidak. Menurut Suratmo (2009), golongan fenolat merupakan senyawa-senyawa yang berpotensi sebagai antioksidan. Peran fenol sebagai antioksidan ini terbukti dari hasil penelitian Escudero et al. (2008) dimana komponen polifenol yang diisolasi dari daun Piper aduncum L. yang diekstraksi dengan etanol memiliki aktivitas antioksidan dan menurunkan kandungan hidrogen peroksida secara in-vivo.
Suatu senyawa dikatakan sebagai antioksidan sangat kuat apabila nilai IC50 kurang dari 0,05 mg/ml, kuat apabila nilai IC50 antara 0,05-0,10 mg/ml, sedang apabila nilai IC50 berkisar antara 0,10-0,15 mg/ml, dan lemah apabila nilai IC50 berkisar antara 0,15-0,20 mg/ml (Blois 1958 dalam Molyneux 2004). Menurut klasifikasi ini, ketiga ekstrak kasar selada air tersebut memiliki aktivitas antioksidan yang sangat lemah karena nilai IC50-nya lebih besar dari 0,20 mg/ml atau 200 ppm. Hal ini jauh berbeda dengan aktivitas antioksidan BHT. Hasil penelitian ini jauh lebih baik dibandingkan hasil penelitian Raghu et al. (2010) terhadap sepuluh macam sayuran yang biasa dikonsumsi di India dimana nilai IC50-nya berkisar 950 - 4750 ppm.
Nilai IC50 BHT menunjukkan bahwa antioksidan BHT memiliki aktivitas yang lebih kuat dari senyawa-senyawa antioksidan yang terdapat pada ketiga ekstrak kasar selada air, ditunjukkan dengan nilai IC50 BHT yang jauh lebih kecil dari IC50 ketiga ekstrak kasar selada air. Hal tersebut dapat terjadi karena ekstrak selada air yang digunakan dalam penelitian ini masih tergolong sebagai ekstrak kasar (crude). Ekstrak kasar ini masih mengandung senyawa lain yang bukan merupakan senyawa antioksidan. Senyawa lain tersebut ikut terekstrak dalam pelarut selama proses ekstraksi. Senyawa-senyawa ini dapat meningkatkan nilai rendemen ekstrak, tetapi tidak dapat meningkatkan aktivitas antioksidan ekstrak tersebut.