METODE PENELITIAN
2.13 Alat dan Bahan 3.3.1 Alat
Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah autoklaf, batang pengaduk, bunsen, tabung sentrifugasi, cool box, colony counter, hot plate, inkubator,
jangka sorong, jarum ose, Laminar Air Flow Cabinet, mikro pipet, neraca analitik, penangas air, penyaring mikro 0,22 µm, petridisk, refrigerator, sentrifugasi, spatula, spuit, spektrofotometer UV-Vis, dan alat-alat gelas sesuai kebutuhan.
Beberapa gambar alat dapat dilihat pada Lampiran 22 halaman 102-104.
Seluruh alat gelas disterilkan menggunakan oven pada suhu 180oC selama 120 menit dengan membungkus menggunakan kertas roti. Jarum ose disterilkan dengan cara dibakar menggunakan lampu spiritus (Ditjen POM, 1995).
3.3.2 Bahan
Bahan uji adalah sediaan probiotik mengandung BAL. Biakan bakteri
patogen yang digunakan yaitu Staphylococcus aureus (S. aureus ATCC 6538) dan Escherichia coli (E. coli ATCC 8939) koleksi Laboratorium Mikrobiologi
Fakultas Farmasi USU. Bahan kimia yang digunakan jika tidak dinyatakan lain berkualitas pro analis yaitu akuades, alkohol 70%, alkohol 96%, NaOH 1 N, NaCl 0,9%, H2O2 3%, gentian violet, lugol, safranin, minyak imersi dan larutan McFarland No. 0,5. Media yang digunakan yaitu MRSA, MRSB, NA, dan MHA. Gambar bahan dapat dilihat pada Lampiran 23 halaman 105.
Kontrol positif yang digunakan adalah Tetrasiklin HCl 30 µg (Oxoid) dan akuades sebagai kontrol negatif. Pencadang kertas yang digunakan adalah pencadang kertas kosong diameter 6 mm (Oxoid). Pencadang kertas kosong disterilkan dalam autoklaf suhu 121oC selama 15 menit (Adebayo, et al., 2014).
3.3.2.1 Pengumpulan Sampel
Pengumpulan sampel dilakukan dengan metode purposif sampling. Sampel merupakan 4 jenis sediaan probiotik mengandung BAL yang di beli dari apotek-apotek yang ada di wilayah kota Medan, Sumatera Utara yaitu:
A. Lacto B diproduksi oleh Novell Farma dengan berat 1 g/sachet mengandung viable cell 6,0 x 107 CFU/sachet (setara 7,78 log CFU/sachet), terdiri dari:
L. acidophilus, S. thermophilus dan B. longum. Kadaluarsa Februari 2018.
B. Rillus diproduksi oleh Kalbe Farma dengan berat 1,5 g/tablet dengan
viable cell 1,0 x 109 CFU/tablet (9 log CFU/tablet) terdiri dari: L. plantarum, B. bifidum dan S. thermophilus. Kadaluarsa Februari 2018.
C. Interlac diproduksi oleh Kalbe Farma dengan berat 0,5 g/tablet mengandung L. reuteri 1 x 108 CFU/tablet (8 log CFU/tablet). Kadaluarsa November 2017.
D. Lacbon diproduksi oleh Kimia Farma dengan berat 0,25 g/tablet mengandung L. sporogenes 5 x 107 CFU/tablet (7,70 log CFU/tablet). Kadaluarsa
Agustus 2018. Komposisi dan banyaknya sampel yang digunakan dapat dilihat pada Lampiran 1 dan Lampiran 2 halaman 76-77.
3.3.2.2 Pembuatan media deMann Rogosa Sharpe Agar (MRSA)
Komposisi : Peptone 10 g
Lab-Lemco’powder 8 g
Yeast extract 4 g
Glucose 20 g
Sorbiton Mono-oleate 1 mL
Dipotasium hydrogen phosphate 2 g
Sodium acetate 3H2O 5 g
Triammonium citrate 2 g
Magnesium Sulphate 7H2O 0,2 g Manganese Sulphate 4H2O 0,05 g
Agar 10 g
Sebanyak 62 gram media MRSA dilarutkan dalam 1000 mL akuades steril, dihomogenkan dengan hot plate sampai larut dan disterilkan dalam autoklaf pada suhu 121oC, selama 15 menit (Oxoid, The Manual Laboratories, 2006).
3.3.2.3 Pembuatan media deMann Rogosa Sharpe Broth (MRSB)
Komposisi : Peptone 10 g
Lab-Lemco’powder 8 g
Yeast extract 4 g
Glucose 20 g
Sorbiton Mono-oleate 1 mL
Dipotasium hydrogen phosphate 2 g
Sodium acetate 3H2O 5 g
Triammonium citrate 2 g
Magnesium Sulphate 7H2O 0,2 g Manganese Sulphate 4H2O 0,05 g
Sebanyak 52 gram media MRSB dilarutkan dalam 1000 mL akuades steril, dihomogenkan dengan hot plate sampai larut dan disterilkan dalam autoklaf pada suhu 121oC selama 15 menit (Oxoid, The Manual Laboratories, 2006).
3.3.2.4 Pembuatan media Nutrient Agar (NA)
Komposisi : Lab-Lemco’ Powder 1 g
Yeast Extract 2 g
Peptone 5 g
Sodium Chloride 5 g
Agar 15 g
Sebanyak 28 gram media NA dilarutkan dalam 1000 mL akuades steril, dihomogenkan dengan hot plate sampai larut dan disterilkan dalam autoklaf pada suhu 121oC, selama 15 menit (Oxoid, The Manual Laboratories, 2006).
3.3.2.5 Pembuatan media Muller Hinton Agar (MHA)
Komposisi : Beef Dehydrated Infusion from 300 g
Casein Hydrolysate 17,5 g
Starch 1,5 g
Agar 17,0 g
Sebanyak 38 gram media MHA dilarutkan dalam 1000 mL akuades steril,
dihomogenkan dengan hot plate sampai larut dan disterilkan dalam autoklaf pada suhu 121oC, selama 15 menit (Oxoid, The Manual Laboratories, 2006).
3.3.2.6 Pembuatan media agar miring
Sebanyak 3 ml media NA steril dimasukkan ke dalam tabung reaksi steril, didiamkan pada temperatur kamar sampai memadat pada posisi miring kira-kira 45o. Hal yang sama dilakukan terhadap media MRSA (Sihombing, 2014).
3.3.2.7 Pembuatan larutan NaCl 0,9%
Sebanyak 9 g NaCl ditimbang dan dilarutkan sempurna dengan akuades steril dalam labu tentukur 1000 mL, kemudian dicukupkan dengan akuades steril sampai garis tanda dalam erlenmeyer steril kemudian disterilkan dalam autoklaf pada suhu 121oC selama 15 menit (Ditjen POM, 1995).
3.3.2.8 Pembuatan larutan McFarland No. 0,5
Sebanyak 0,05 mL larutan BaCl2 1% dicampur dengan 9,95 mL larutan H2SO4
1% dan dikocok homogen. Larutan McFarland No. 0,5 ini setara dengan suspensi sel bakteri konsentrasi 1,5 x 108 CFU/mL (Sihombing, 2014).
3.3.2.9 Peremajaan bakteri
Satu ose koloni bakteri patogen S. aureus dan E. coli dengan menggunakan jarum ose steril, ditanam pada media NA miring dengan cara menggores.
Kemudian diinkubasi pada suhu 37oC selama 24 jam. Hal yang sama dilakukan terhadap BAL pada media MRSA miring (Sihombing, 2014).
3.3.2.10 Pembuatan inokulum bakteri patogen
Koloni bakteri patogen S. aureus dan E. coli hasil peremajaan pada media NA miring diambil dengan jarum ose steril lalu disuspensikan dalam 10 mL NaCl 0,9%. Kultur diukur kekeruhan dengan membandingkan kekeruhannya mengunakan larutan McFarland No. 0,5 (konsentrasi bakteri 1,5 x 108 CFU/mL) (Sihombing, 2014; Barzavar, 2015).
3.3.2.11 Pembuatan lempeng bakteri patogen
Dipipet sebanyak 1 mL inokulum bakteri patogen S. aureus dan E. coli (konsentrasi bakteri 1,5 x 108 cfu/mL) dimasukkan ke dalam cawan petri steril kemudian ditambahkan 15 mL media MHA steril. Lalu cawan petri diputar sesuai angka delapan agar bakteri menyebar rata pada media (Sutrisna, et al., 2012).
2.14 Prosedur
3.4.1 Uji viabilitas BAL
Sebanyak 1 g serbuk sampel dilarutkan homogen dalam 9 mL NaCl 0,9%, diperoleh konsentrasi pengenceran 10-1. Dibuat pengenceran bertingkat hingga pengenceran 10-10. Dipipet 1 mL larutan dari masing-masing serial pengenceran
dimasukkan dalam cawan petri steril (triplo). Dituang 15 ml media MRSA suhu 45oC ke dalam cawan petri tersebut dan dihomogenkan. Diinkubasi pada
suhu 37oC selama 48 jam. Diamati dan dihitung ALT koloni BAL yang tumbuh
pada media MRSA menggunakan colony counter. Pengenceran dengan jumlah koloni 30-300 koloni dijadikan dasar perhitungan. Uji viabilitas dilakukan pada hari ke-0 dan setelah di simpan pada suhu 4oC dan 28oC hari ke-7, 14, 21 dan 28 (Carollina, 2015; Abbas, et al., 2015; Utami, 2013). Alur pengujian terdapat pada Lampiran 3a halaman 78.
3.4.2 Uji aktivitas antibakteri hasil uji viabilitas BAL
Sebanyak 1 ose koloni BAL hasil uji viabilitas pada media MRSA diinokulasikan ke dalam 20 mL media MRSB dan diinkubasi pada suhu 37oC selama 72 jam secara aerobik (inokulum). Inokulum bakteri yang diperoleh disentrifugasi pada kecepatan 10.000 rpm pada suhu 4oC selama 20 menit (supernatan). Diukur dan disesuaikan pH supernatan menjadi pH 7,0 menggunakan NaOH 1 N (supernatan netral). Supernatan netral yang diperoleh kemudian disaring menggunakan penyaring mikro 0,22 µm (bakteriosin). Dipipet sebanyak 20 µL masing-masing inokulum, supernatan dan bakteriosin lalu diteteskan pada pencadang kertas yang sudah disusun diatas lempeng bakteri patogen kemudian diinkubasi pada suhu 37oC selama 24 jam. Diukur zona bening yang terbentuk dengan Tetrasiklin HCl 30 µg sebagai kontrol positif dan akuades sebagai kontrol negatif (Begum, 2015; Yulinery, 2015; Khoiriyah, dkk., 2014; Jiang, 2011;
Setianingsih, 2010). Alur pengujian dapat dilihat pada Lampiran 4 halaman 79.
3.4.3 Isolasi BAL
Isolasi BAL dilakukan dengan mengamati morfologi koloni bakteri yang tumbuh pada media MRSA pada uji viabilitas meliputi bentuk, tepian, warna, permukaan, elevasi dan ukuran (Utami, 2013; Ramalingam dan Anvita, 2011).
3.4.4 Identifikasi BAL
Identifikasi BAL dilakukan dengan beberapa cara antara lain:
a. Pewarnaan Gram
Isolat BAL dari media MRSA dibuat olesan tipis pada gelas objek steril dan difiksasi panas. Kemudian diteteskan gentian violet, tunggu selama 1 menit, dibilas dengan akuades. Preparat diberi tetesan lugol dan dibiarkan selama 1 menit lalu dibilas dengan akuades. Kemudian preparat dicuci dengan alkohol 96% sampai gentian violet pada preparat tidak luntur lagi lalu dibilas dengan akuades. Selanjutnya preparat diberi tetesan zat warna safranin dan dibiarkan selama 45 detik lalu dibilas dengan akuades dan dikeringkan.
Kemudian preparat diteteskan minyak imersi dan diamati dibawah mikroskop dengan perbesaran 100x untuk melihat bentuk dan warna dinding sel setelah dilakukan pewarnaan. Bakteri yang termasuk dalam kelompok Gram positif dinding selnya berwarna ungu atau gelap sedangkan kelompok bakteri Gram negatif akan menunjukkan warna merah safranin (Sharah, dkk., 2015).
b. Uji katalase
Isolat BAL dari media MRSA dioles pada gelas objek yang telah disterilkan dengan alkohol, lalu diteteskan larutan H2O2 3%. Preparat diamati, bila terdapat gelembung gas maka menunjukkan bakteri tersebut katalase positif dan apabila tidak terbentuk gelembung gas maka bakteri tersebut katalase negatif (Sharah, dkk., 2015). Alur terdapat pada Lampiran 3b halaman 78.
3.4.5 Penentuan waktu inkubasi optimum BAL
Modifikasi penentuan waktu inkubasi optimum BAL dari masing-masing sampel dengan mengambil 1 ose koloni BAL pada media MRSA miring diinokulasikan secara aseptis ke dalam 10 mL media MRSB diinkubasi pada suhu 37oC selama 24 jam (kultur). Kultur dipindahkan ke dalam media MRSB segar disamakan kekeruhannya dengan mengukur nilai Optical Dencity
menggunakan spektrofotometer UV-Vis pada panjang gelombang 600 ŋm, absorbansi 1 (setara 109 CFU/mL) menggunakan media MRSB sebagai blanko.
Sebanyak 2 mL inokulum setara 109 CFU/mL diinokulasi ke dalam 100 mL media MRSB secara aseptik kemudian diinkubasi pada suhu 37oC selama 120 jam
(inokulum aktif). Sebanyak 1 mL inokulum aktif diencerkan homogen dengan 9 mL NaCl 0,9 % (pengenceran 10-1). Dibuat pengenceran bertingkat hingga
diperoleh piring dengan jumlah koloni 30-300 koloni dengan memipet sebanyak 1 mL dari masing-masing serial pengenceran dimasukkan ke dalam cawan petri steril dan ditambahkan 15 mL media MRSA suhu 45oC dan dihomogenkan kemudian diinkubasi terbalik pada suhu 37oC selama 48 jam pada kondisi aerobik.
Perhitungan ALT koloni yang tumbuh pada media MRSA dilakukan terhadap inokulum aktif pada waktu inkubasi ke-0, 24, 48, 72, 96 dan 120 jam menggunakan colony counter (Khoiriyah, dkk., 2014; Barua, et al., 2015). Alur penelitian dapat dilihat pada Lampiran 5 halaman 80.
3.4.6 Penentuan waktu optimum aktivitas antibakteri bakteriosin dari BAL Dipipet 1 mL kultur aktif BAL diinokulasi ke dalam 20 mL media MRSB diinkubasi pada suhu 37oC selama 96 jam (inokulum). Inokulum disentrifugasi pada kecepatan 10.000 rpm pada suhu 4oC selama 20 menit. pH supernatan diukur dan disesuaikan menjadi pH 7,0 menggunakan NaOH 1 N lalu disaring menggunakan penyaring mikro 0,22 µm. Pemanenan dilakukan pada waktu inkubasi ke-48, 72 dan 96 jam. Uji aktivitas dilakukan terhadap bakteri S. aureus karena memiliki kesamaan filogenetik dengan memipet 1 mL inokulum bakteri patogen setara larutan McFarland No. 0,5 (konsentrasi bakteri 1,5 x 108 CFU/mL) ke dalam cawan petri steril lalu ditambahkan 15 mL media MHA, dihomogenkan.
Disusun cakram kertas steril pada lempeng patogen untuk masing-masing BAL
kemudian diteteskan 20 µL bakteriosin lalu diinkubasi pada suhu 37oC selama 24 jam (Khoiriyah, dkk., 2014; Rawal, 2013; Sutrisna, dkk., 2012).
3.4.7 Produksi bakteriosin dari BAL
Dipipet 1 mL kultur aktif BAL diinokulasikan ke dalam 20 mL media MRSB dan diinkubasi pada suhu 37oC selama 72 jam secara aerobik (inokulum).
Inokulum bakteri disentrifugasi pada kecepatan 10.000 rpm pada suhu 4oC selama 20 menit (supernatan dan pelet). Diukur dan disesuaikan pH supernatan menjadi pH 7,0 menggunakan NaOH 1 N (supernatan netral), lalu disaring menggunakan penyaring mikro 0,22 µm (bakteriosin). Kemudian bakteriosin yang dihasilkan disimpan pada suhu 4oC dan 28oC selama 28 hari (Khoiriyah, dkk., 2014;
Barzavar, 2015; Abbas, et al., 2016; Abdelsamei, et al., 2015; Gomashe, 2014;
Francois, et al., 2013). Alur ekstraksi bakteriosin dapat dilihat pada Lampiran 6 halaman 81.
3.4.8 Uji aktivitas antibakteri bakteriosin dari BAL
Sebanyak 20 µL bakteriosin dari masing-masing BAL diteteskan pada pencadang kertas steril yang telah disusun sebelumnya pada lempeng bakteri patogen S. aureus dan E. coli. Diinkubasi pada suhu 37oC selama 24 jam.
Pengamatan aktivitas antibakteri bakteriosin dari BAL dilakukan dengan mengukur zona bening yang terbentuk pada skala mm termasuk diameter pencadang kertas (6 mm), serta membandingkan aktivitas antibakteri bakteriosin dari BAL berdasarkan tabel potensi antibakteri. Pengukuran aktivitas antibakteri bakteriosin dari BAL terhadap bakteri patogen S. aureus dan E. coli dilakukan dengan 2 tahap yaitu: (i) sebelum penyimpanan yaitu pada hari ke-0, (ii) setelah penyimpanan pada suhu 4oC (dalam refrigerator) dan 28oC (dalam inkubator) pada hari ke-7, 14, 21, dan 28. Tetrasiklin HCl 30 µg digunakan sebagai kontrol positif
dan akuades sebagai kontrol negatif (Yulinery, 2015; Barua, et al., 2015; Francois, et al., 2013; Jiang, 2011). Secara keseluruhan alur penelitian dapat dilihat pada Lampiran 7 halaman 82.