BAB III METODE PENELITIAN
H. Alat dan Bahan Penelitian
a. Cawan Petri dengan diameter 10 cm b. Oshe kolong
c. Tabung reaksi d. Beaker glass
e. Alat pembuat sumuran berdiameter 6 mm f. Pipet g. Mikropipet h. Penggaris i. 0,5 standar Mc Farland j. Autoklaf k. Lampu spiritus l. Kertas saring m. Saringan plastik n. Blender 2. Bahan Penelitian
a. Biakan Trichophyton mentagrophytes
b. Sabouroud Dextrose Agar (SDA)
c. Perasan kulit jeruk purut d. Akuades
e. Diflucan yang mengandung 50 mg flukonazol 1 kapsul f. Alkohol 96%
commit to user
h. Kloramfenikol I. Cara Kerja
1. Uji Pendahuluan a. Tahap Persiapan
1) Perasan Kulit Jeruk Purut
Mencuci bersih jeruk purut terlebih dahulu dengan menggunakan air mengalir, tujuannya untuk menghilangkan kotoran yang menempel. Kemudian merendamnya di dalam alkohol 96% agar jeruk purut lebih steril dan bebas dari kontaminasi. Mengupas jeruk purut untuk diambil bagian kulitnya saja. Selanjutnya melumatkan 100 gram irisan kulit jeruk purut tersebut menggunakan blender dengan dicampur 100 ml akuades. Hasil dari proses pelumatan kemudian diperas dan disaring dua kali. Penyaringan pertama dilakukan dengan saringan plastik yang dilapisi kain, kemudian penyaringan berikutnya dengan kertas saring untuk mendapatkan hasil perasan air yang bagus dan tanpa endapan. Air hasil saringan dianggap konsentrasi 100%.
2) Pembiakan Trichophyton mentagrophytes
Biakan jamur diperoleh dari laboratorium Mikrobiologi Universitas Setia Budi Surakarta. Trichophyton mentagrophytes
yang diperoleh merupakan biakan subkultur 5 hari dalam
commit to user
b. Tahap Uji Pendahuluan
1) Persiapan preparat obat flukonazol 25 µg
Preparat flukonazol yang dipakai adalah Diflucan. Satu kapsul Diflucan mengandung 50 mg flukonazol. Satu kapsul flukonazol 50 mg dilarutkan dengan 100 ml akuades. Pengenceran ini adalah pengenceran pertama.
ó 50 mg dlm 100 ml ó 0,5 mg/ 1 ml ó 500 µg/ 1 ml
Kemudian dengan rumus : N1· V1 = N2· V2 500 · V1 = 25 · 100
V1 = 5 ml
Jadi, untuk mendapatkan kadar flukonazol 25 µg, 5 ml dari hasil pengenceran pertama dilarutkan ke dalam 100 ml akuades (V2).
Zona sensitivitas flukonazol 25 µg berdasarkan standar yang ada adalah sebagai berikut:
Flukonazol : ≥ 19 mm = sensitif
: 13 – 18 mm = intermediate
: ≤ 12 = resisten
(Barry & Brown, 1996)
2) Pembuatan Sabouraud Dextrose Agar
Menyiapkan Sabouraud Dextrose Agar bubuk 10 gram
kemudian menambahkannya dengan akuades 150 ml, lalu V1 = Volume yang tersedia N1 = Kadar flukonazol awal
V2 = Volume yang akan
digunakan
commit to user
memanaskan sambil mengaduk sampai tercampur homogen. Menambahkan kloramfenikol pada media cair untuk mencegah tumbuhnya kuman kontaminan. Setiap 1000 ml Sabouraud
Dextrose Agar cair memerlukan 400 mg kloramfenikol, maka:
Kloramfenikol yang diperlukan untuk 150 ml Sabouraud Dextrose
Agar = 150 ml x 400mg = 60 mg
1000 ml
Setiap 250 mg kloramfenikol dilarutkan dalam 10 ml NaCl 0,9%. Maka:
NaCl 0,9% yang diperlukan = 60 mg x 10 ml = 2,4 ml 250 mg
(Bridson, 1998)
Jadi memerlukan 60 mg kloramfenikol untuk melarutkan dalam 2,4 ml NaCl 0,9%.
Kemudian setelah itu mensterilkan media cair yang telah ditambah larutan kloramfenikol dengan autoklaf pada suhu 1210C selama 15 menit bersama dengan peralatan penelitian lain yang dibutuhkan. Menuangkan Sabouraud Dextrosa Agar cair dalam 5
cawan Petri yang telah disterilkan dan membiarkan sampai dingin. 3) Pembuatan suspensi dan inokulum Trichophyton mentagrophytes
Mengambil biakan Trichophyton mentagrophytes dengan
menggunakan oshe steril kemudian memasukkan ke dalam larutan NaCl 0,9% sampai mencapai kekeruhan yang ekivalen dengan 0,5 standart Mc Farland. Menginokulasikan sampel cair Trichophyton
commit to user
mentagrophytes sebanyak 0,2 ml ke dalam tiap-tiap cawan Petri
yang berisi Sabouraud Dextrose Agar. Menggoyang agar untuk
meratakan sampel Trichophyton mentagrophytes.
4) Pengenceran perasan kulit jeruk purut
Mengencerkan hasil perasan kulit jeruk purut yang telah disiapkan saat tahap persiapan uji pendahuluan. Perasan diencerkan dengan akuades sehingga diperoleh konsentrasi 20%, 40%, 60%, 80%, dan 100%. Penentuan konsentrasi tersebut berdasar dari hasil penelitian yang telah dilakukan oleh Hidayah dan Subakir (2010) mengenai efektifitas air perasan buah jeruk purut 25% terhadap pertumbuhan Malassezia sp. Pembuatan perasan konsentrasi 20%,
40%, 60%, 80%, dan 100% tersebut berasal dari pengenceran air perasan konsentrasi 100%. Adapun cara pengencerannya menurut Ahmad (1996) sebagai berikut:
- Perasan konsentrasi 20% berasal dari 20 ml (perasan konsentrasi 100%) + akuades 100ml.
- Perasan konsentrasi 40% berasal dari 40 ml (perasan konsentrasi 100%) + akuades 100ml.
- Perasan konsentrasi 60% berasal dari 60 ml (perasan konsentrasi 100%) + akuades 100ml.
- Perasan konsentrasi 80% berasal dari 80 ml (perasan konsentrasi 100%) + akuades 100ml.
- Perasan konsentrasi 100% merupakan perasan asli yang tidak perlu diencerkan
commit to user
5) Memberi perlakuan ke dalam 5 cawan Petri dengan perasan kulit jeruk purut, akuades, flukonazol 25 µg
Langkah pertama dalam tahap ini adalah membuat 4 sumuran berdiameter 6 mm pada masing cawan Petri. Pada masing-masing sumuran diisi 0,05 ml akuades sebagai kontrol negatif, 0,05 ml flukonazol 25 µg sebagai kontrol positif, dan 0,05 ml perasan kulit jeruk purut dengan konsentrasi berbeda-beda, yaitu 20%, 40%, 60%, 80%, dan 100%.
Selanjutnya diinkubasi pada suhu kamar selama 4 hari. Setelah diinkubasi, dilakukan pengukur diamater daerah yang bening (zona hambatan) dengan menggunakan penggaris melewati pusat sumuran.
2. Uji Penelitian a. Tahap Persiapan
1) Perasan Kulit Jeruk Purut
Mencuci bersih jeruk purut terlebih dahulu dengan menggunakan air mengalir, tujuannya untuk menghilangkan kotoran yang menempel. Kemudian merendamnya di dalam alkohol 96% agar jeruk purut lebih steril dan bebas dari kontaminasi. Mengupas jeruk purut untuk diambil bagian kulitnya saja. Selanjutnya melumatkan 100 gram irisan kulit jeruk purut tersebut menggunakan blender dengan dicampur 100 ml akuades. Hasil dari proses pelumatan kemudian diperas dan disaring dua kali. Penyaringan pertama dilakukan dengan saringan plastik yang
commit to user
dilapisi kain, kemudian penyaringan berikutnya dengan kertas saring untuk mendapatkan hasil perasan air yang bagus dan tanpa endapan. Air hasil saringan dianggap konsentrasi 100%.
2) Pembiakan Trichophyton mentagrophytes
Memperoleh biakan jamur diperoleh dari laboratorium Mikrobiologi Universitas Setia Budi Surakarta. Trichophyton
mentagrophytes yang diperoleh merupakan biakan subkultur 5 hari
dalam Sabouraud Dextrosa AgarSlant.
b. Tahap Uji Penelitian
1) Penentuan besar ulangan
Dihitung dengan rumus Federer (n-1) (t-1) > 15
Keterangan n : besar ulangan
t : jumlah kelompok perlakuan
Karena pada penelitian ini menggunakan 6 kelompok perlakuan, maka :
(n-1) (t-1) > 15 (n-1) (6-1) > 15 5n > 20
n > 4
Jadi, untuk setiap kelompok, jumlah pengulangan harus lebih dari 4. Dalam penelitian ini menggunakan 5 kali ulangan dalam setiap kelompok.
commit to user
2) Pembuatan Sabouraud Dextrose Agar
Menyiapan Sabouraud Dextrose Agar bubuk 13 gram dan
menambahkan akuades 200 ml, lalu memanaskan sambil
mengaduk sampai tercampur homogen. Menambahkan
kloramfenikol pada media cair untuk mencegah tumbuhnya kuman kontaminan. Setiap 1000 ml Sabouraud Dextrose Agar cair
memerlukan 400 mg kloramfenikol, maka:
Kloramfenikol yang diperlukan untuk 150 ml Sabouraud Dextrose
Agar = 200 ml x 400mg = 80 mg
1000 ml
Setiap 250 mg kloramfenikol dilarutkan dalam 10 ml NaCl 0,9%, Maka:
NaCl 0,9% yang diperlukan = 80 mg x 10 ml = 3,2 ml 250 mg
(Bridson, 1998)
Jadi diperlukan 80 mg kloramfenikol dilarutkan dalam 3,2 ml NaCl 0,9%.
Kemudian mensterilkan media cair yang telah ditambah larutan kloramfenikol dengan autoklaf pada suhu 1210C selama 15 menit bersama dengan peralatan penelitian lain yang dibutuhkan. Menuangkan Sabouraud Dextrosa Agar cair dalam 5 cawan Petri
commit to user
3) Pembuatan suspensi dan inokulum Trichophyton mentagrophytes
Memperoleh biakan jamur dari Laboratorium Mikrobiologi Universitas Setia Budi Surakarta. Trichophyton mentagrophytes
yang diperoleh merupakan biakan sub kultur 5 hari dalam
Sabouraud Dextrose Agar miring. Mengambil biakan dengan
menggunakan oshe steril kemudian memasukkan ke dalam larutan NaCl 0,9% sampai mencapai kekeruhan yang ekivalen dengan 0,5 standart Mc Farland. Menginokulasikan sampel cair Trichophyton
mentagrophytes sebanyak 0,2 ml ke dalam tiap-tiap cawan petri
yang berisi Sabouraud Dextrose Agar. Menggoyang agar untuk
meratakan sampel Trichophyton mentagrophytes.
4) Pengenceran perasan kulit jeruk purut
Mengencerkan hasil perasan kulit jeruk purut yang telah disiapkan pada saat tahap persiapan uji pendahuluan sehingga diperoleh konsentrasi 70%, 80%, 90% dan 100%.
5) Memberi perlakuan ke dalam 7 cawan Petri dengan perasan kulit jeruk purut, akuades dan flukonazol 25 µg
Langkah pertama dalam tahap ini adalah membuat 5 sumuran berdiameter 6 mm pada masing cawan Petri. Pada masing-masing sumuran diisi 0,05 ml akuades sebagai kontrol negatif, 0,05 ml flukonazol 25 µg sebagai kontrol positif, dan 0,05 ml perasan kulit jeruk purut dengan konsentrasi 70%, 80%, 90%, 100%.
Selanjutnya diiinkubasi pada suhu kamar selama 4 hari. Setelah diinkubasi, dilakukan pengukuran diamater daerah yang bening
commit to user
(zona hambatan) dengan menggunakan penggaris melewati pusat sumuran.
Mengulang tahap penelitian poin a dan b dengan perasan kulit jeruk purut yang berbeda. Pengulangan perasan dilakukan sebanyak 3 kali.