Alat dan Instrumen Penelitian

METODE PENELITIAN

E. Alat dan Instrumen Penelitian

Alat – alat yang digunakan adalah

1. Alat-alat pembuatan serbuk kering daun sirih merah (Piper crocatum)

antara lain : mesin penyerbuk (blender), timbangan, oven.

2. Alat-alat pembuatan infusa daun sirih merah (Piper crocatum) antara lain : Bekker glass, timbangan, batang pengaduk, gelas ukur, panci infusa,

heater, stopwatch, kain flanel.

3. Alat-alat uji toksisitas antara lain : kandang tikus (metabolic cage), timbangan, Bekker glass, jarum suntik per oral, spuit injeksi, Ependorf, pipa kapiler (haematokrit).

F. Tata Cara Penelitian 1. Determinasi tanaman

Determinasi tanaman dilakukan di Laboratorium Farmakognosi

Fitokimia Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta hingga ke

2. Pengumpulan bahan uji

Daun sirih merah (Piper crocatum) untuk bahan uji dipilih dalam kondisi segar dan berwarna hijau pada bagian tengah antara pucuk dan pangkal daun.

Daun sirih merah yang diperoleh berasal dari hasil kebun yang dilakukan oleh

Bapak Yohanes Dwiatmaka, M.Si. yang diberikan pada bulan Maret 2013.

3. Pembuatan serbuk daun sirih merah

Petikan daun sirih merah (Piper crocatum) dicuci dan dikeringkan, kemudian dimasukan dalam oven dengan suhu ± 50^oC selama 24 jam. Daun yang sudah kering diserbuk dan diayak dengan menggunakan ayakan no. 30 dan

dilakukan perhitungan rendemen menggunakan

rumus :𝑏𝑒𝑟𝑎𝑡𝑘𝑒𝑟𝑖𝑛𝑔

𝑏𝑒𝑟𝑎𝑡𝑠𝑎𝑚𝑝𝑒𝑙^{x 100 % (Sharief, 2006).}

4. Penetapan kadar air serbuk kering daun sirih merah

Penetapan kadar air menggunakan metode gravimetri dengan bantuan

alat Moisture Balance. Dimasukkan ±5 g serbuk daun sirih merah ke dalam alat,

kemudian diratakan. Timbang bobot zat sebagai bobot sebelum pemanasan

(bobot a) panaskan pada suhu 110⁰C selama 30 menit. Setelah itu, ditimbang bobot zat setelah pemanasan (bobot b). Selisih bobot a dan bobot b merupakan

kadar air yang diselidiki.

Dari 1 Kg daun sirih merah basah didapatkan 230,18g daun sirih merah

kering. Maka, diperoleh rendemen sebesar :

230,18 𝑔

Untuk perhitungan kadar air menggunakan metode gravimetri, maka

digunakan rumus :𝐵𝑜𝑏𝑜𝑡𝑎𝑤𝑎𝑙−𝑏𝑜𝑏𝑜𝑡𝑎𝑘ℎ𝑖𝑟

𝑏𝑜𝑏𝑜𝑡𝑎𝑤𝑎𝑙 ^{× 100%}

5. Penetapan dosis infusa daun sirih merah

Dosis terapi infusa daun sirih merah (Piper crocatum) adalah 23 g/70 Kg BB untuk manusia 70 Kg. Konversi manusia (70 kg ke tikus 200 g) = 0,018

(Laurence and Bacharach, 1964).

Dosis untuk 200g tikus = 0,018 x 23g

= 0,414g/200g BB

= 2,07x10^-3g/g BB

= 2,07 g/Kg BB

Dalam penelitian ini dibuat 3 peringkat dosis, dengan cara menggunakan

kelipatannya. Angka kelipatan yang digunakan sebesar satu setengah kalinya,

sehingga diperoleh tiga peringkat dosis yaitu 1,38 ; 2,07 ; 3,105 g/kgBB.

6. Penetapan dosis aquadest sebagai kontrol negatif

Untuk penentuan dosis aquadest digunakan dosis tertinggi untuk

mengetahui jumlah volume maksimum yang diberikan kepada hewan uji. Dosis

tertinggi 3,105 g/kgBB, berdasarkan rumus didapatkan volume maksimum yaitu :

D x BB =C x V

3,105g/Kg BB x 200g = 20% x V

V = 3,105 ml/200g BB

Maka dosis aquadest adalah :

V = 0,015525 g/g BB (karena 1ml aquadest sama dengan 1g)

V = 15,525 g/Kg BB

7. Pembutan infusa daun sirih merah

Dalam pembuatan infusa, sebanyak 20 g serbuk kering daun sirih merah

(Piper crocatum) ditimbang dan dicampur dengan 100 ml aquadest. Campuran ini dipanaskan selama 15 menit dengan suhu 90⁰C pada heater (waktu terhitung dari suhu campuran telah mencapai 90⁰C). Air yang diperoleh kemudian disaring menggunakan kain flanel dan ditambahkan aquadest hingga 100 ml. Konsentrasi infusa yang didapat adalah 20%.

8. Penyiapan hewan uji

Hewan uji yang digunakan berjumlah 40 ekor, terdiri dari tikus jantan

dan betina, galur Wistar, umur 2- 3 bulan, berat badan 100 – 200 g. Ditempatkan dalam metabolic cage. Pada setiap metabolic cage berisi satu tikus. Sebelum dilakukan perlakuan hewan uji diadaptasikan pada metabolic cage selama 3 hari.

9. Pengelompokan hewan uji

Tikus sebanyak empat puluh ekor yang digunakan dalam penelitian,

dibagi menjadi empat kelompok secara acak, yaitu tiga sebagai kelompok

perlakuan dan satu kelompok perlakuan yang masing – masing kelompok terdiri

dari sepuluh ekor tikus (lima jantan dan lima betina). Pada kelompok satu

merupakan kelompok kontrol negatif dengan pemberian aquadest dengan dosis 15,252 g/KgBB sedangkan kelompok II hingga IV diberikan perlakuan infusa

daun sirih merah (Piper crocatum) dengan peringkat dosis berturut – turut, yaitu 1,38 ; 2,07 ; 3,105 g/KgBB tikus.

10. Prosedur pelaksanaan toksisitas subkronis

Infusa daun sirih merah (Piper crocatum) yang merupakan sediaan uji diberikan pada hewan uji sesuai dosis pemberian dengan kekerapan pemberian

satu kali sehari selama 28 hari pada tikus jantan dan betina dengan tetap diberi

makan dan minum. Pada awal masa uji yaitu pada hari I, darah semua tikus

diambil melalui sinus orbital mata, Pengambilan darah tersebut dilakukan dengan

menusukkan pipa kapiler langsung ke sinus orbital mata. Sampel darah yang

diambil kemudian ditampung pada Ependorf berisi heparin untuk diambil serum darah, diberi kode kemudian dikirim ke Parahita Medical Lab untuk dilakukan

pengukuran kadar glukosa darah tikus. Pemberian infusa daun sirih merah

dilakukan selama 28 hari pada setiap kelompok perlakuan sesuai dengan peringkat

dosis. Pada hari ke-29 darah semua tikus diambil kembali melalui vena orbital

mata ditampung pada Ependorf berisi heparin untuk diambil serum darah kemudian dilakukan kembali pengukuran kadar glukosa darah tikus. Pada hari

ke-29 juga dilakukan pembedahan setengah dari hewan uji baik jantan maupun betina

untuk dilakukan pemeriksaan histopatologi. Kemudian pada hari ke-42 (14 hari

setelah hari ke-28) dilakukan pembedahan hewan uji yang tersisa untuk melihat

reversibilitas.

11. Prosedur Pembedahan

Pertama-tama disiapkan pot organ yang yag telah diberi label dan yang

sesuai dengan nomor tikus yang akan dibedah dan telah diisi dengan formalin

10% untuk menyimpan organ. Kemudian, menyiapkan alat-alat bedah yang akan

digunakan untuk menampung NaCl 0,9% mencuci organ setelah dibedah. Setelah

itu, tikus yang akan dibedah di dislokasi leher terlebih dahulu kemudian posisikan

tikus pada papan bedah menggunakan pins. Bedah dimulai dari bagian perut

sampai bagian leher menggunakan gunting bedah. Kemudian, ambil dan pisahkan

masing-masing organ menggunakan gunting bedah dengan bantuan pinset,

pastikan tiap-tiap organ tidak tercampur, kemudian organ tersebut dicuci dengan

NaCl 0,9% kemudian dimasukkan ke dalam pot organ yang sesuai antara label

tikus yang dibedah dengan label yang ada di pot organ. Sisa organ tikus yang

tidak terpakai dimasukkan ke dalam kantong plastik dan ditutup rapat agar tidak

ada bau yang keluar, kemudian di kubur.

12. Pengamatan

a. Pengamatan berat badan hewan uji

Pengamatan berat badan terhadap hewan uji dilakukan dengan cara

menimbang hewan uji dengan timbangan. Penimbangan berat badan hewan uji

dilakukan setiap hari. Perhitungan purata berat badan tikus dilakukan dengan cara

menambahkan berat badan tikus kemudian dibagi dengan jumlah tikus ditiap

kelompok dilakukan pada hari 0, 7, 14, 21, 28. Kemudian data yang diperoleh

dianalisis secara statistik.

b. Pengukuran asupan pakan hewan uji

Hewan uji diberikan asupan pakan setiap hari sebanyak 20 g dan

dilakukan penggantian pakan setiap harinya. Cara mengukur besarnya asupan

pakan tikus yaitu dengan menghitung selisih berat pakan hari kedua dikurangi

pada hari pertama, kemudian pada hari kedua pakan yang masih tertinggal pada

wadah ditimbang. Selisih penimbangan antara berat pakan hari kedua dengan

berat badan hari pertama inilah yang dihitung sebagai asupan makanan pada hari

pertama.

c. Pengukuran asupan minun hewan uji

Hewan uji diberikan minum berupa aquadest sebanyak 150 ml. Minuman

diberikan dalam wadah botol kaca yang diberi pipa seperti tabung reaksi yang

diberi lubang pada ujungnya. Pengukuran asupan minum hewan uji dilakukan

dengan cara memasukkan 150 ml air pada wadah dihari pertama, kemudian pada

hari kedua jumlah sisa air yang masih terdapat dalam botol dihitung. Air minum

yang dihabiskan tikus pada hari pertama dihitung dengan cara mengurangkan

jumlah air minum yang diberikan pada hari pertama dengan jumlah air minum

sisa pada hari kedua.

13. Pemeriksaan histopatologis

Pemeriksaan hispatologis dilakukan dengan cara pembedahan untuk

diambil organ pankreas. Sebelum melakukan pembedahan, tikus dikorbankan

dengan cara diskolasi leher yaitu mematikan hewan uji dengan cara menarik leher

dan ekor secara bersamaan sehingga tulang leher patah. Kemudian dilakukan

pembedahan terhadap tikus. Tikus diletakkan secara terlentang diatas papan

pembedahan (gabus/steroform) dan dibedah caesar dengan membuat irisan digaris

tengah ventral tubuh mulai dari area bukaan genitalia hingga ke leher. Rongga

dilakukan pemeriksaan histopatologis. Organ kemudian dicuci bersih dengan

aquadest kemudian difiksasi, diletakkan didalam pot yang berisi formalin 10%.

14. Histopatologi pankreas

Pembacaannya preparat dilakukan di Fakultas Kedokteran Hewan

Universitas Gadjah Mada. Perubahan pankreas yang diamati meliputi bagian

endokrin dan bagian eksokrin yang meliputi pulau Langerhans dan sel - sel asinar.

Pengamatan dilakukan di bawahmikroskop cahaya pembesaran 400x dengan

bantuan video mikrometer.

Pengambilan organ pankreas dengan cara nekropsi setelah tikus mati,

selanjutnya dibuat preparat agar mudah diamati dibawah mikroskop. Pembuatan

preparat histopatologi tersebut secara berurutan difiksasi di dalam larutan buffer

netral formalin, trimming, dehidrasi, infiltrasi dengan parafin, diiris dengan

mikrotom dan diwarnai dengan hematosilin-eosin (HE). Pewarnaan dilakukan

dengan cara menginkubasi preparat otot dengan larutan Mayer’s hematoxilyn,

kemudian diinkubasi dalam larutan Eosin 0,5% yang sudah ditambah asam asetat

(100 : 1) selama 5 menit.