Sebagian besar gen manusia dipecah menjadi beberapa segmen (ekson) yang harus disambung lagi setelah transkripsi menjadi mRNA prekursor (precursor mRNA [pre-mRNA]) Sampai sekitar 76% gen manusia mengekspresikan mRNA yang beragam melalui alternative splicing dari pre-mRNA di mana ekson disambung kembali dengan pola yang berbeda. Akibatnya, gen individu mengekspresikan beragam mRNA yang identik kecuali di regio variabilitas tertentu (discrete regions of variability ). Beberapa gen memiliki regio alternative splicing multipel dan mengekspresikan ratusan atau bahkan ribuan mRNA yang berbeda. Sebanyak 80% alternative splicing terjadi di coding region dan menghasilkan isoform protein dengan fungsi yang berbeda bergantung pada pengaturan sel spesifik (berdasarkan tipe sel, tahap perkembangan, jenis kelamin, atau respon terhadap signal eksternal) (Faustino and Cooper 2003).
Varian genetik SNP TCF7L2 ini kemungkinan berkaitan dengan terjadinya alternative splicing. Setiap faktor transkripsi dari keluarga TCF/LEF memiliki posisi awal transkripsi atau transcription starts sites (TSS) yang berbeda untuk menghasilkan protein fungsional yang berbeda. Hal ini menjelaskan tidak adanya asosiasi antara ekspresi TCF7L2 yang diperiksa dengan berdasarkan ex7-8 dengan rs7903146 dan rs12255372 (Prokunina-Olsson, 2009a).
Ekspresi TCF7L2 yang mengalami alternative splicing kemungkinan memiliki peranan fungsional berbeda di omental dan jaring lemak subkutan, namun tidak berasosiasi dengan SNPs rs7903146 dan rs12255372, ataupun dengan status DMT2, kadar glukosa darah maupun hemoglobin terglikasi (HbA1c). Hal ini diketahui dari pemeriksaan ekspresi bentuk splice alternatif TCF7L2 yang dilakukan dengan quantitative reverse-transcriptase PCR (qRT-PCR) pada bahan hasil biopsi jaringan lemak omental dan subkutan dari 159 individu yang obese (BMI 54,6±212,2 kg/m2). Ekpresi ‗‗ex12-13‘‘, ‗‗ex12-14‘‘ and ‗‗ex13-13a‘‘ yang mendeteksi ekson alternatif C-terminal dari TCF7L2 lebih tinggi di jaringan lemak subkutan dibanding dengan jaringan lemak omental (Prokunina-Olsson dkk., 2009b).
Gambar 2.7
Struktur dan Lokasi Ekspresi Gen TCF7L2 (Prokunina-Olsson dkk., 2009b)
Keterangan: Skema ini menunjukkan ekson konstitutif (balok hitam), ekson alternative (balok putih); blok linkage disequilibrium (LD) yang berasosiasi dengan SNPs rs7903146 dan rs12255372; domain protein: ß-catenin-interacting domain, DNA-binding HMG domain dan C-terminal Binding Protein
(CtBP)-binding domain. Expression assays untuk mendeteksi bentuk splice alternatif dari TCF7L2 ditunjukkan dengan panah yang berhubungan. Pemeriksaan transkrip target TSS1 (transcription starts sites), TSS2 dan TSS3 didapatkan dari tempat awal transkripsi alternatif sementara bentuk splice alternatif yang lain dengan kombinasi ekson yang berbeda.
* - Ekspresi dari ‗‗ex13-13b‘‘ juga diperiksa tapi tidak terdeteksi di jaringan lemak (Prokunina-Olsson dkk., 2009b).
Alternative splicing dapat menghasilkan produk protein yang beragam dengan komposisi domain bervariasi dari satu gen. Gen TCF7L2 mengkode TCF4 yaitu suatu protein DNA-binding yang merupakan anggota dari T-cell factor (TCF) family dan pasangan interaksi nuclear dari beta katenin yang membentuk fungsi esensial dalam Wnt-signaling growth factor. Isoform TCF4 multipel menunjukkan potensi distribusi yang bersifat spesifik untuk tipe sel tertentu dan berpengaruh kuat pada respon Wnt yang bersifat spesifik untuk tiap jaringan. Sejumlah varian splice Tcf7l2 tikus di jaringan neonatus yaitu sel stem embrionik dan progenitor neural diidentifikasi dengan metode amplifikasi PCR, cloning, dan sekuensing. Sebagian besar (namun tidak semuanya) menunjukkan distribusi jaringan yang luas (Weise dkk., 2010).
Gambar 2.8
Perbandingan Pola Ekspresi Varian TCF4 pada Jaringan Tikus dan Embryonic Stem (ES) Cell
(Weise dkk., 2010) Keterangan:
A. Skema stuktur protein TCF4 yang disederhanakan (atas) dan gen TCF7L2 tikus (bawah)
Gen TCF7L2 terdiri dari 17 ekson, sebagian di antaranya dapat mengalami alternative splicing (ekson 4, 13–16; ditandai dengan warna merah). Ekson konstitutif berwarna hijau. Variasi tambahan sekuen mRNA TCF7L2 dihasilkan dari penggunaan alternative splice acceptor dan tempat donor (donor site), di ekson 7, 8, dan 9. Regio yang terkena alternative splicing ini diberi warna merah. Posisi start codon di ekson 1 diberi tanda. Stop codon yang mana yang potensial
akan digunakan mengikuti ekson 8 atau antara ekson 15, 16 and 17, bergantung pada kombinasi ekson yang ada di mRNa final. Retensi sekuen yang mengikuti ekson 8 (diberi tanda N) pada mRNA final membentuk varian TCF4N. Panjang ekson digambar dengan skala. Panah horizontal menunjukkan posisi dan orientasi primer yang digunakan pada reaksi RT-PCR. Daerah yang dengan garis terputus-putus menunjukkan bagian C-terminal TCF4 yang paling bervariasi, dari ekson 13-17.
β-cat=β-catenin binding domain; Grg=binding motif untuk produk groucho-related gene (Grg); HMG: HMG box; NLS: nuclear localization signal.
B. Analisis ekspresi varian splicing TCF4 pada jaringan tikus dan sel ES yang berbeda.
Isolasi RNA dari sel ES dan sampel jaringan tikus berusia 3 hari, cDNA disintesis dan varian splicing TCF4 diamplikasi dengan PCR menggunakan kombinasi primer yang ekson-spesifik, seperti yang ditunjukkan pada gambar. Amplifikasi dari sekuen GAPDH digunakan sebagai kontrol integritas RNA dan cDNA. Produk PCR dipisahkan dengan elektroforesis gel dan divisualisasi dengan pewarnaan ethidium bromide. Kombinasi ekson yang dihasilkan dari berbagai fragmen DNA dideterminasi dengan melakukan subcloning dan sekuensing dari produk PCR. Kesimpulan ukuran dari hasil produk PCR dan kaitannya dengan varian splicing TCF4 E, S dan M ditunjukkan pada bagian kanan dari panel.Produk PCR dari jaringan otak diberi label bintang menunjukkan isoform S3 dan S6.
C. Ringkasan dari identifikasi varian C-terminal TCF4
Ekson merah adalah splicing alternatif, ekson hijau adalah ekson konstitutif. Warna biru menunjukkan regio yang tidak ditranslasi (untranslated). Posisi stop kodon ditunjukkan pada gmabar. Varian splicing dikelompokkan berdasarkan ada atau tidak C-clamp, komplit, atau inkomplit. Isoform yang dulu disebut S5, direklasifikasi sebagai M3 (Weise dkk., 2010).
Kaminska dkk., 2012 meneliti tentang efek penurunan berat badan setelah pembedahan pada alternatve splicing gen TCF7L2 di jaringan lemak (adipose)
dan hati, serta asosiasi antara splicing TCF7L2 ini dengan kadar glukosa dan asam lemak bebas atau free fatty acid (FFA) serum, pada 3 studi independen (n=216). Ekspresi dari varian mRNA pendek (tidak mengandung ekson 12, 13, dan 13a) di jaringan lemak subkutan (n=46) dan hati (n=11) menurun setelah penurunan berat badan, dan lebih sering pada lemak subukutan subyek dengan DMT2 dibanding subyek dengan normal glucose tolerance (NGT) yang obese (n=54) dan sampel di populasi (n=49). Di samping itu, terdapat korelasi positif antara varian ini dengan kadar glukosa puasa pada individu nondiabetes (n=113). Asosiasi antara splicing TCF7L2 dan glukosa plasma independen terhadap genotipe TCF7L2. Varian ini berasosiasi dengan kadar serum FFA selama hiperinsulinemia, yang menunjukkan bahwa adanya gangguan kerja insulin di jaringan lemak, dan tidak berasosiasi dengan sekresi insulin atau ambilan glukosa di tubuh yang distimulasi insulin. Studi ini menunjukkan bahwa varian mRNA TCF7L2 yang pendek di lemak subkutan diregulasi oleh penurunan berat badan dan berasosiasi dengan hiperglikemia dan gangguan kerja insulin di jaringan lemak (Kaminska dkk., 2012).