(Isolation, Cloning, and Characterization of Rice Aluminum Tolerance Gene)
Abstrak
Toleransi cekaman Aluminium (Al) pada tanaman padi merupakan sifat kuantitatif yang dikendalikan oleh banyak gen. Penelitian ini bertujuan mengisolasi, mengklon, dan mengkarakterisasi gen toleran Al dari genotipe padi Hawara Bunar yang toleran Al. Bahan tanaman yang digunakan adalah padi Hawara Bunar (genotipe padi toleran Al) dan IR64 (varietas padi sensitif Al). Isolasi gen dilakukan berdasarkan kombinasi pendekatan hubungan sintenik antara padi dan rye, dan reverse transcription-polymerase chain reaction menggunakan cetakan berupa mRNA dari Hawara Bunar yang telah mendapat cekaman 15 ppm Al pada pH 4.0 selama 24 jam. Karakterisasi dilakukan dengan pendekatan sekuensing, analisis bioinformatika, dan tembakau transgenik yang diintroduksi gen toleran Al. Hasil penelitian mendapatkan gen toleran Al yang ekspresinya diinduksi oleh Al, yang disebut gen B11. Ekspresi gen B11 pada Hawara Bunar lebih tinggi daripada IR64. DNA genomik dari gen B11 berukuran 2021 pb, terdiri dari 3 ekson dan 2 intron, dengan transkrip mRNA berukuran 573 pb, daerah sekuen penyandi asam amino sebesar 573 pb, dan menyandikan 113 asam amino deduksi. Gen B11 dapat meningkatkan toleransi tanaman tembakau transgenik terhadap cekaman Al. Protein B11 yang disandikannya mirip dengan protein L32 ribosomal bakteri dan diprediksi berperan sebagai faktor transkripsi dengan domain bZIP dan motif seperti C2H2-zinc finger.
Kata kunci: Aluminium, gen toleran Al, Nicotiana tabacum, tembakau transgenik. Abstract
Aluminum tolerance trait in rice is a quantitative trait controlled by many genes. The objective of this study was to isolate, cloning, and characterize aluminum tolerance gene of local rice genotype Hawara Bunar (Al tolerant). The plant material were rice genotype Hawara Bunar (Al tolerant) and rice variety IR64 (Al sensitive). The gene was isolated based on combination of syntenic relationship between rice and rye, and reverse transcription-polymerase chain reaction approaches using mRNA of Hawara Bunar after 15 ppm Al treatment at pH 4.0 for 24 hours. Characterization of the gene was conducted with sequencing, bioinformatic analysis, and trangenic tobacco (Nicotiana tabacum L.) introducing Al tolerance gene. This research successfully isolated Al tolerance gene, called B11 gene, that its expression was induced by Al. The B11 gene expression in Hawara Bunar (Al tolerant genotype) was higher than that of IR64 (Al sensitive variety). Genomic DNA of the B11 gene had 2021 bp composed of 3 exons and 2 introns with 573 bp of mRNA transcript, 342 bp of open reading frame, and 113 deduced amino acid sequence. Transgenic tobacco plants of T0 and T1 generation were constantly more tolerance than non-transgenic tobacco plants. The B11 protein was similar to bacterial like L32 protein and was
predicted as a transcription factor with bZIP domain and C2H2-zinc finger like motif.
Key words: Aluminum, Al tolerance gene, Nicotiana tabacum, transgenic. Pendahuluan
Padi menjadi tumpuan untuk mengisolasi dan mengklon gen toleran Al karena padi merupakan spesies tanaman pertanian serealia yang paling toleran terhadap cekaman Al (Kim et al. 2001), yang memiliki ukuran genom paling kecil, yaitu 389 Mb nukleotida dibandingkan anggota tanaman serealia lainnya, dan memiliki informasi urutan nukleotida genom paling lengkap (IRSGP 2005). Namun spesies tanaman pertanian yang sering diteliti secara intensif sampai saat ini adalah tanaman gandum (Triticum aestivum L.) (Delhaize et al. 2004; Sasaki et al. 2004). Beberapa studi fisiologi mengidentifikasikan bahwa toleransi tanaman gandum terhadap cekaman Al melibatkan pelepasan asam organik ke rizosfer. Asam organik tersebut mengkelat dan mendetoksifikasi Al di rizosfer sehingga mencegahnya masuk ke akar tanaman gandum. Asam organik di sitoplasma juga berfungsi mengkelat Al membentuk kompleks Al-asam organik yang selanjutnya kompleks tersebut dikeluarkan dari sel-sel akar sehingga sel-sel akar terhindar dari kerusakan akibat Al dan tanaman gandum menjadi toleran Al (Delhaize et al. 1993a, 1993b; Sasaki et al. 2004).
Toleransi tanaman gandum terhadap cekaman Al yang meliputi mekanisme ekslusi Al dengan bantuan asam malat tersebut rupanya terkait dengan suatu protein transporter yang ada di membran plasma dari sel akar tanaman gandum (Yamaguchi et al. 2005). Gen penyandi protein tersebut, yaitu gen ALMT1 (Aluminum-activated Malate Transporter) sudah berhasil diisolasi dari tanaman gandum (Sasaki et al. 2004) dan juga sudah diintroduksikan ke tanaman padi sub spesies japonica genotipe Nipponbare. Analisis padi transgenik tersebut menunjukkan bahwa meskipun ekspresi gen ALMT1 di padi berasosiasi dengan sekresi asam malat dari akar tanaman padi transgenik setelah diberi cekaman Al, namun toleransi padi transgenik terhadap cekaman Al tidak meningkat. Kemungkinan jumlah asam malat yang disekresikan tidak cukup untuk meningkatkan toleransi tanaman padi terhadap cekaman Al melebihi level
toleransi cekaman Al endogenus yang dimiliki oleh Nipponbare transgenik. Selain itu, kemungkinan gen ortholog ALMT1 di tanaman padi memiliki fungsi lain. Oleh karena itu isolasi gen toleran Al dari tanaman padi merupakan sesuatu yang penting dilakukan untuk dapat mempelajari mekanisme fisiologi dan molekuler yang mendasari toleransi cekaman Al pada tanaman padi.
Untuk mengisolasi gen toleran Al diperlukan genotipe padi yang toleran Al. Identifikasi menggunakan larutan hara minimal dan verifikasi pada tanah asam berkelarutan Al tinggi pada penelitian ini telah berhasil mengidentifikasikan bahwa salah satu padi gogo lokal Indonesia bersifat toleran Al, yaitu Hawara Bunar. Oleh karena itu Hawara Bunar berpotensi sebagai sumber gen toleran Al.
Toleransi tanaman padi terhadap cekaman Al dikendalikan oleh banyak gen atau berasosiasi dengan QTL (Quantitative Trait Loci). Salah satu QTL toleransi cekaman Al pada tanaman padi yang utama terletak pada kromosom 3 (Nguyen et al. 2001). Analisis pemetaan komparatif mengindikasikan bahwa daerah QTL toleransi cekaman Al padi tersebut ortholog dengan lokus gen toleran Al pada kromosom homoeologous grup 4 dari anggota Triticeae, yaitu lokus gen Alp pada barley (Hordeum vulgare L.), AltBH pada gandum (Triticum aestivum L.), dan Alt3 pada rye (Secale cereale L.) (Miftahudin et al. 2002; Nguyen et al. 2003).
Informasi urutan nukleotida dari DNA genom padi dan data hubungan sintenik dapat menjadi dasar untuk mengembangkan penanda molekuler terkait gen toleran Al. Miftahudin et al. (2004, 2005) telah mengembangkan beberapa penanda molekuler berdasarkan informasi urutan nukleotida dari DNA genom padi untuk membuat pemetaan resolusi tinggi dan mengisolasi gen Alt3. Salah satu penanda molekuler yang telah dibuat adalah B11 (Miftahudin et al. 2005) yang diturunkan dari sekuen mRNA unknown gene pada klon BAC kromosom 3 padi. Analisis keterpautan pada populasi rye F2 menunjukkan bahwa produk PCR dari penanda molekuler B11 (disebut gen B11) ko-segregasi dengan lokus gen Alt3. Oleh karena itu mungkin saja Alt3 berlokasi sangat dekat dengan gen B11 atau bisa jadi gen B11 adalah gen Alt3. Namun upaya saat itu untuk mengisolasi dan mengklon gen Alt3 dari tanaman rye belum berhasil (Miftahudin et al. 2005). Pada kromosom 3 dari tanaman padi, wilayah yang menunjukkan hubungan sintenik dengan daerah lokus Alt3 merupakan daerah yang kaya gen dengan
kerapatan 4.3 kb per gen. Apabila berhasil diketahui bahwa gen Alt3 tersebut atau heterolognya juga ada di segmen kromosom 3 padi dan dapat diidentifikasi peran dari protein yang disandikannya, maka langkah menuju isolasi gen toleran Al dari tanaman padi semakin dekat.
Penelitian ini bertujuan mengisolasi, mengklon, dan mengkarakterisasi gen toleran Al dari genotipe padi yang toleran Al, kemudian mengintroduksi dan menguji ekspresinya pada tanaman model tembakau (Nicotiana tabacum L.).
Bahan dan Metode
Bahan Tanaman. Bahan tanaman yang digunakan adalah varietas padi IR64 (sensitif Al) dan genotipe padi Hawara Bunar (toleran Al). Benih padi diperoleh dari Kebun Percobaan Muara, Balai Besar Penelitian Tanaman Padi, Bogor, Jawa Barat. Tanaman model yang dipakai adalah tembakau (Nicotiana tabacum L.).
Strain Bakteri dan Plasmid. Bakteri yang digunakan adalah Escherichia coli DH5α dan Agrobacterium tumefaciens AGL-O. Vektor klon berupa pGEM- T-Easy. Vektor entri adalah pENTR/D-TOPO® (Invitrogen) yang berukuran 2580 pb dan mengandung gen penanda resistensi kanamisin (NPTIII). Vektor ekspresi berupa pGWB5 (Nakagawa et al. 2007) dengan ukuran 17960 pb dan mengandung gen penanda seleksi higromisin (HPT), NPTII, dan NPTIII di bawah kendali promotor 35S dari CaMV (Cauliflowers Mozaic Virus) (Gambar 7).
Gambar 7. Diagram skematik vektor ekspresi pGWB5 yang telah disisipi gen toleran Al (gen B11).
Isolasi DNA Genom Padi. Daun muda dan segar seberat 1.5 gram dari tanaman padi IR64 dan Hawara Bunar yang telah berumur 4 minggu digerus dalam N2-cair dan DNA diisolasi menggunakan metode CTAB (Saghai-Maroof et
al. 1984). Kualitas dan kuantitas DNA diukur menggunakan spektrofotometer dan elektroforesis pada 1% gel agarose dalam 1x buffer TBE (Tris-Borate-EDTA pH 8.0), tegangan 65 volt selama 30 menit. Larutan DNA total disimpan pada
suhu -20°C sedangkan larutan DNA kerja dengan konsentrasi 100 ng/μl disimpan di suhu 4°C.
Polymerase Chain Reaction (PCR). Sembilan belas penanda molekuler STS (Sequence Tag Site) yang terkait toleransi tanaman rye terhadap cekaman Al diseleksi pada tanaman padi menggunakan teknik PCR pada mesin PCR SwiftTM Maxi Thermal Cycler (Esco). Sebagai cetakan digunakan DNA total dari IR64 dan Hawara Bunar. Komposisi reaksi PCR sebagai berikut: 100 ng DNA padi, 1X buffer PCR (+Mg2+), 0.2 mM dNTPs, 0.4 μM masing-masing primer STS, dan 1 Unit Taq DNA Polymerase dalam 20 μl total reaksi PCR. Kondisi PCR sebagai berikut: pre-PCR selama 5 menit pada suhu 94°C, dan dilanjutkan 35 siklus. Setiap siklus PCR terdiri dari tahapan: denaturasi DNA cetakan selama 45 detik pada suhu 94°C; penempelan primer selama 45 detik pada suhu annealing (tergantung primernya); dan pemanjangan primer selama 1 menit 30 detik pada suhu 72°C. Pasca PCR selama 10 menit pada suhu 72°C.
Hasil amplifikasi lalu dimigrasikan pada 1% gel agarose dalam 1x buffer TBE, pada 65 volt selama 1 jam. Gel hasil elektroforesis diwarnai dengan 5 µg/ml etidium bromida, visualisasi di atas lampu UV (WiseUv WUV-M20, Daihan Scientific) dan direkam/foto menggunakan foto gel WiseDoc©Gel Documentation System. Amplifikasi dari pasangan primer yang menampilkan satu pita pada salah satu tetua atau satu pita pada kedua tetua akan diseleksi selanjutnya dengan teknik RT-PCR (Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction) untuk analisis ekspresi. Tahapannya meliputi isolasi RNA total dan RT-PCR.
Isolasi RNA Total. Sebanyak 100 kecambah dari masing-masing IR64 dan Hawara Bunar diberi perlakuan cekaman Al sebesar 0 dan 15 ppm pada pH 4.00±0.02 selama 24 jam. Sepanjang 0.5-1.0 cm ujung akar dari setiap kecambah kemudian dipotong, dimasukkan ke dalam tabung eppendorf 2 ml bebas RNase (tabung baru yang sudah disterilisasi) dan digerus menggunakan stik kaca bebas RNase sambil sesekali dicelupkan ke dalam nitrogen cair. Isolasi RNA selanjutnya dilakukan menggunakan reagen Trizol mengikuti instruksi pabrik (Invitrogen®, Molecular Research Center, Inc., USA).
Total RNA diberi perlakuan enzim DNaseI untuk menghilangkan DNA yang mungkin mengkontaminasi. Komposisi reaksi sebagai berikut: 1x buffer DNaseI, 10000 ng RNA total, dan 0.01% air DEPC (diethyl pyrocarbonate) hingga total volume 10 μl, lalu ditambahkan 0.4 unit enzim DNaseI. Campuran tersebut kemudian diinkubasi pada suhu 37°C selama 10 menit. Untuk menginaktifasi enzim DNaseI, ditambahkan 5 mM EDTA pH 8.0 ke dalam campuran lalu diinkubasi pada suhu 75°C selama 10 menit. Tabung segera ditempatkan di atas es selama 30 menit lalu diambil 1 ul untuk elektroforesis pada 1% gel agarose, pada 65 volt selama 1 jam.
Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR). Tahap ini meliputi proses transkripsi balik (RT) untuk sintesis cDNA dan amplifikasi (PCR). Sintesis cDNA menggunakan kit Superscript First-Strand Synthesis System (Invitrogen®, USA) dan primer oligo d(T)21. Komposisi reaksi sebagai
berikut: 5000 ng RNA, 1x first strand buffer, 1 μM primer Oligo d(T)21, 0.5 mM
dNTPs, 10 mM DTT, 40 unit enzim RTase, 0.01% air DEPC hingga total reaksi 20 μl. Campuran tersebut diinkubasi pada mesin PCR dengan program sebagai berikut: 30°C selama 10 menit, 42°C selama 50 menit, 95°C selama 5 menit, dan 20°C selama 5 menit.
Skrining penanda molekuler STS rye dengan pendekatan PCR memperoleh 5 penanda molekuler. Kelima penanda molekuler tersebut selanjutnya diskrining dengan pendekatan RT-PCR yaitu PCR menggunakan cetakan berupa cDNA IR64 dan Hawara Bunar yang telah mendapat cekaman Al sebesar 0 dan 15 ppm pada pH 4.00±0.02 selama 24 jam. Sebagai kontrol positif, cDNA IR64 dan Hawara Bunar tersebut juga diamplifikasi menggunakan primer ubiquitin padi (forward: 5’-CCAGGACAAGATGATCTGCC-3’ dan reverse: 5’-AAGAAG CTGAAGCATCCAGC-3’). Produk PCR dari primer ubiquitin berukuran 245 pb (Lampiran 4). Penanda molekuler yang menghasilkan produk amplifikasi dengan intensitas ekspresi yang berbeda antara IR64 dan Hawara Bunar akan dipilih untuk mengisolasi gen toleran Al.
Isolasi Gen Toleran Aluminium dari Tanaman Padi. Pendekatan RT- PCR memperoleh penanda molekuler B11 yang berpotensi digunakan sebagai
primer untuk mengisolasi gen toleran Al dari tanaman padi. Pita hasil amplifikasi menggunakan primer B11 dengan cetakan berupa cDNA Hawara Bunar (selanjutnya disebut gen B11 sebagai gen toleran Al) dipurifikasi dan diligasikan ke dalam vektor pGEM-T-Easy dengan prosedur sesuai instruksi pabrik (Promega, Madison, WI, USA).
Hasil ligasi ditransformasikan ke dalam Escherichia coli DH5α untuk diperbanyak dan juga diisolasi plasmidnya untuk dilakukan pengurutan DNA. Transformasi ke dalam sel E. coli DH5α mengikuti metode heat shock (Hanahan et al. 1995) dengan sedikit modifikasi. Seleksi transforman dilakukan dengan seleksi koloni biru putih menggunakan 20 μl dari 50 mg/ml X-gal, 100 μl dari 100 mM IPTG, dan 100 μg/ml ampisilin.
Polymerase Chain Reaction (PCR) Koloni. Beberapa koloni putih yang tumbuh diambil untuk PCR koloni mengikuti prosedur yang dilakukan Suharsono et al. (2008) menggunakan primer B11 forward: 5’-GTTCCCTTTTTCTCCG CTACAG-3’ dan reverse: 5’-TCACAGAGGCCCAATCGTTC-3’. Berdasarkan PCR koloni maka koloni yang positif membawa gen B11 diisolasi plasmidnya dengan cara mengiinokulasikan pada 10 ml media LB+10μg/ml ampisilin dan diinkubasi pada suhu 37°C selama 18 jam. Isolasi plasmid dilakukan menggunakan kit Wizard Plus SV (plasmid) minipreps dengan prosedur sesuai instruksi pabrik (Promega, Madison, WI, USA).
Analisis urutan nukleotida dari gen B11 dilakukan menggunakan program BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ BLAST) (Altschul et al. 1997). Berdasarkan hasil analisis BLAST lalu dirancang sepasang primer untuk memperoleh fragmen gen B11 yang lebih panjang meliputi open reading frame (ORF). Sepasang primer yang telah dirancang yaitu B11_FL forward: 5’-TTCCCCGTAACCCCACGG-3’ dan reverse: 5’-GTCACGAGTG GCATTTGAG-3’.
Plasmid Rekombinan. Primer B11_FL digunakan untuk mengamplifikasi cDNA total Hawara Bunar yang telah diberi perlakuan 15 ppm Al pada pH 4.0 selama 24 jam. Produk amplifikasi kemudian diklon ke vektor pGEM-T-Easy. Plasmid rekombinan pGEM-T-Easy-B11 yang terbentuk lalu diamplifikasi
menggunakan primer B11_ORF (forward: 5’- CACCATGGCGGCGGCGGC GGGTTGGCT-3’ dan reverse: 5’-TTATGAGCTTGAGTCGCCGGGGTTC CCT-3’) untuk analisis over ekspresi. Produk PCR kemudian disisipkan ke dalam vektor klon pENTR/D-TOPO® menggunakan kit kloning pENTR/D-TOPO® (Invitrogen®, USA) untuk menghasilkan vektor entri. Reaksi ligasi sebagai berikut: 2 μl (8 ng) produk PCR dari B11_ORF, 1 μl salt solution, 2 μl air steril, dan 1 μl vektor pENTR/D-TOPO®. Campuran diinkubasi pada suhu 22.5°C selama 5-30 menit, lalu segera tempatkan di atas es. Sebanyak 3 μl vektor entri dimasukkan ke dalam sel E. coli DH5α kompeten, sisanya disimpan pada suhu -20°C. Media seleksi yang digunakan adalah 50 μg/ml kanamisin.
Untuk mengkonfirmasi keberadaan dan orientasi dari gen B11 di dalam vektor entri, dilakukan PCR koloni, isolasi plasmid dari koloni terseleksi, dan pengurutan DNA. Proses PCR dilakukan menggunakan primer B11_ORF forward/T7, dan reverse/T7. Amplifikasi hanya terjadi pada PCR menggunakan pasangan primer B11_ORF forward/T7.
Vektor entri direaksikan dengan vektor biner ekspresi pGWB5 menggunakan kit The Gateway® LR Clonase™ enzyme mix (Invitrogen®, USA) untuk menghasilkan plasmid ekspresi rekombinan. Komposisi reaksi sebagai berikut: 1 μl vektor entri pENTR/D-TOPO-B11, 1 μl vektor ekspresi pGWB5, 2
μl TE pH 8, dan 1 μl LR reaction. Campuran diinkubasi pada suhu 25°C selama 1-18 jam, lalu reaksi diinaktivasi dengan menambahkan 0.5 μl proteinase-K, inkubasi pada suhu 37°C selama 10 menit, lalu segera ditaruh di atas es untuk transformasi ke dalam sel E.coli DH5α kompeten. Seleksi koloni E.coli DH5α yang membawa plasmid ekspresi rekombinan dilakukan pada media LA+50
μg/ml kanamisin+30 μg/ml higromisin.
Transformasi ke dalam Sel Agrobacterium tumefaciens. Plasmid ekspresi rekombinan ditransformasikan ke dalam sel Agrobacterium tumefaciens AGL-O dengan metode freeze-thaw mengikuti prosedur yang dilakukan Xu & Li (2008) dan diseleksi pada media LA+50 μg/ml kanamisin+30 μg/ml higromisin.
Introduksi ke Tanaman Tembakau (Nicotiana tabacum L.). Satu koloni A. tumefaciens yang positif membawa plasmid ekspresi rekombinan ditumbuhkan
pada media LB+25 μg/ml rifampisin+50 μg/ml kanamisin+30 μg/ml higromisin, suhu 28°C selama 48 jam. Kultur bakteri disentrifus pada 4000 rpm selama 10 menit. Pelet diresuspensikan dengan 10 ml larutan MS+vitamin B5 (Lampiran 5) mengandung 200 μM asetosiringone lalu diinkubasi goyang dengan kecepatan 150 rpm selama 2-3 jam atau sampai OD600 = 0.3.
Sumber eksplan tembakau yang digunakan adalah daun tembakau hasil perbanyakan kultur in-vitro. Daun yang dipakai untuk infeksi adalah daun ke-2 dan 3 dari pucuk. Lembaran daun dipotong dengan ukuran 1cmx1cm, dimasukkan ke dalam suspensi A. tumefaciens, lalu diinkubasikan pada kondisi tanpa cahaya (gelap), suhu 28°C, penggoyangan dengan kecepatan 75 rpm selama 15 menit. Potongan daun dikeringkan menggunakan tissue steril lalu ditanam pada media ko-kultivasi (Lampiran 6) yang di atasnya telah diberi kertas saring steril. Inkubasi dilakukan di ruangan gelap pada suhu 28°C selama 1 hari. Potongan daun dicuci dengan larutan MS sebanyak 2 kali dan larutan MS+250
μg/ml cefotaksim sebanyak 2 kali. Potongan daun yang sudah bersih ditanam di media eliminasi (Lampiran 6) dan diinkubasi selama 5 hari di ruang kultur jaringan. Potongan daun dipindah ke media seleksi transforman (Lampiran 6) dan diinkubasi selama 6 minggu. Eksplan yang tumbuh dipindah ke media regenerasi (Lampiran 6) dan ditumbuhkan selama 3 bulan atau sampai cukup besar untuk diaklimatisasi selama 4 minggu di dalam pot gelas, lalu ditanam di rumah kaca pada media tanah:arang sekam:pupuk kasting (3.5:0.5:1).
Karakterisasi Tanaman Tembakau Transgenik. Karakterisasi tanaman tembakau transgenik dilakukan untuk mengetahui fungsi gen B11 dalam mengendalikan toleransi cekaman Al. Karakterisasi dilakukan pada tembakau transgenik generasi T0 dan T1.
Karakterisasi tembakau transgenik generasi T0. Karakterisasi tembakau transgenik generasi T0 dilakukan dengan analisis PCR dan uji toleransi cekaman Al. Analisis PCR dilakukan menggunakan cetakan berupa DNA total tembakau transgenik generasi T0 yang diisolasi dengan prosedur mengikuti Miftahudin et al. (2004) serta primer B11_ORF dan HPT (forward: 5’-CTTGATAAACTA AAGGAAAGCCTC-3’ dan reverse: 5’-TCACGACGTCATCTATTACC-3’).
Lima nomor tembakau transgenik yang positif membawa gen B11 dan HPT diambil secara acak lalu daunnya disterilisasi dan sub kultur pada media sub kultur (Lampiran 6) mengandung 100 μg/ml kanamisin pada pH 5.7. Tunas-tunas yang muncul dan telah memiliki lembaran daun yang sempurna (sekitar 3 minggu setelah tanam) dipisahkan dan ditanam pada media regenerasi (Lampiran 6) pH 5.7. Setelah itu dipilih eksplan yang memiliki minimal 3-4 helai daun sempurna untuk analisis toleransi cekaman Al.
Uji toleransi cekaman Al dilakukan pada media regenerasi tembakau (Lampiran 6) mengandung 8.1 ppm Al (300 μM Al) (Fuente et al. 1997) pada pH 4.0. Percobaan terdiri dari 3 ulangan, setiap ulangan terdiri dari 3 botol dan setiap botol ditanami 2 eksplan. Sebagai kontrol, eksplan tembakau transgenik dan non- transgenik ditanam pada media regenerasi, pH 5.7 dengan satu ulangan (karena keterbatasan eksplan). Pengamatan uji toleransi cekaman Al dilakukan pada minggu ke-5 setelah tanam. Variasi morfologi dan habitus tanaman transgenik dan non-transgenik yang ditanam di rumah kaca diamati saat tanaman berbunga (sekitar 3 bulan setelah ditanam di rumah kaca).
Karakterisasi tembakau transgenik generasi T1. Karakterisasi tembakau transgenik generasi T1 dilakukan dengan terlebih dahulu menyeleksi biji generasi T1, lalu uji toleransi cekaman Al dan PCR. Seleksi biji dengan teknik kultur jaringan menggunakan 100 μg/ml antibiotik kanamisin (Lampiran 6) pada pH 5.7 selama 20-30 hari (Delhaize et al. 2001). Uji toleransi cekaman Al dilakukan dengan teknik kultur hara menggunakan 1/6 larutan MS dan konsentrasi Al sebesar 8.1 ppm pada pH 4.2 selama 3 dan 8 hari. Uji toleransi cekaman Al diwakili oleh 37 tanaman untuk setiap nomor tembakau transgenik dan non- transgenik. Sebagai kontrol, tembakau non-transgenik ditanam di larutan 1/6 MS, pH 4.2. Respon toleransi cekaman Al pada tembakau transgenik generasi T1 diukur dengan menghitung pertambahan panjang akar selama tercekam Al.
Biji yang akan diseleksi terlebih dahulu disterilisasi. Proses sterilisasi biji mengikuti prosedur yang dilakukan Bovet et al. (2006) dengan sedikit modifikasi. Biji tembakau yang sudah steril dikeringudarakan di atas kertas serap steril selama sekitar 15 menit kemudian satu persatu biji ditanam pada media seleksi biji
(Lampiran 6) dan diinkubasi pada ruang gelap, suhu 25°C-28°C selama 3 hari. Setelah 3 hari, dipindah ke rak kultur dengan pencahayaan 16 jam terang/8 jam gelap.
Analisis Data. Segregasi sifat resistensi kanamisin pada tembakau transgenik generasi T1 dihitung menggunakan rumus Khi-Kuadrat. Data pertambahan panjang akar tembakau dianalisis secara statistik menggunakan uji-T student. Urutan asam amino deduksi dari gen B11 ditentukan menggunakan program ExPASy-Translate tools (http://www.expasy.ch/tools/dna.html) (Gasteiger et al. 2003). Urutan asam amino deduksi selanjutnya dianalisis menggunakan program BLASTp (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST) (Altschul et al. 1997), PredictProtein (http://www.predictprotein.org) (Rost et al. 2004) dengan bank data Prosite, Scansite (http://scansite. mit.edu/cgi- bin/motifscan_seq.phtml) (Obenauer et al. 2003) dengan bank data Swiss-Prot, dan MotifScan (http://myhits.isb-sib.ch/cgi-bin/motif_scan) dengan bank data pfam_ls dan hamap.
Hasil dan Pembahasan
Penggunaan Penanda Molekuler Sequence Tag Site (STS) Rye terkait Toleransi Cekaman Aluminium pada Padi
Padi memiliki ukuran genom paling kecil di antara spesies tanaman serealia lainnya dan sudah tersedia bank data dari urutan nukleotida pustaka DNA maupun cDNA berukuran besar seperti klon BAC (Bacterial Artificial Chromosome) beserta anotasinya. Kelebihan tersebut menjadikan padi mulai digunakan untuk mengisolasi dan mengklon gen termasuk gen penyandi toleransi cekaman Al melalui pendekatan analisis pemetaan komparatif. Miftahudin et al. (2005) telah melakukan analisis pemetaan komparatif antara rye dan padi dan telah mengembangkan penanda molekuler yang terpaut lokus gen toleran Al rye, Alt3, berdasarkan urutan nukleotida dari klon BAC padi di kromosom 3 yang memiliki hubungan sintenik dengan dengan lokus gen Alt3 tersebut. Empat penanda molekuler telah diaplikasikan pada populasi rye F2 (Miftahudin et al. 2005), dan dua diantaranya yaitu B11 dan B26 bersegregasi bersama-sama dengan lokus gen Alt3, yang berarti keduanya berada pada jarak yang sangat dekat dengan lokus gen
Alt3 berdasarkan peta genetik. Diharapkan bahwa salah satu dari kedua penanda molekuler tersebut sangat dekat baik secara genetik maupun fisik dengan gen Alt3