IV. HASIL DAN PEMBAHASAN
4.4 Analisis Fungsi ImpX
Hasil BLASTX menggambarkan bahwa gen yang tersisipi transposon pada kromosom
Xag M715 diduga adalah gen impX. Jika ditelusuri lebih jauh, maka gen impX ini termasuk pfam CreD (Marchler-Bauer dan Bryant 2004). Inner membrane protein CreD merupakan famili protein yang terdiri atas beberapa CreD yang terdapat pada bakteri atau disebut juga Cet inner membrane protein. Mutasi dominan gen cet pada E. coli menyebabkan bakteri ini toleran terhadap colicin E2. Colicin merupakan salah satu bakteriosin yaitu senyawa antibakteri atau antibiotik yang dapat mematikan bakteri pada spesies yang berdekatan atau strain yang berbeda tapi spesies yang sama (Madigan et al. 2003). Parker dan Feil (2004) menyatakan bahwa ketika terjadi induksi, colicin diekspresikan dalam jumlah banyak dan disekresikan ke medium ekstraseluler dengan bantuan protein yang dikode plasmid Sel yang mempunyai plasmid dilindungi dari serangan colicinnya sendiri dengan adanya protein
immunity yang dikode oleh plasmid yang sama. Molekul colicin yang disekresikan terikat pada protein reseptor pada membran luar sel target lalu ditranspor melintasi membran luar menuju periplasmik sel target menggunakan sistem transpor bakteri, Tol atau Ton. Colicin dapat menyebabkan kematian sel melalui beberapa proses termasuk perusakan membran sitoplasma dengan terbentuknya pori atau masuk ke dalam sitoplasma menghambat sintesis protein atau berperan sebagai suatu DNAse atau RNAse.
Untuk lebih meyakinkan hasil di atas, maka dilakukan lagi analisis fungsi protein ImpX dengan melakukan perbandingan urutan asam amino ImpX dengan database. Urutan
asam amino ImpX yang diperoleh relatif pendek, sehingga dicari alternatif lain yang memungkinkan. Metode yang dipakai, yaitu melalui Model Navigator dari
http://swissmodel.expasy.org/repository. Model Navigator yang dipakai adalah Inner Membrane Protein X. campestris pv. campes tris yang sudah ada di database. Alasannya, berdasarkan hasil BLASTN Xcc mempunyai score 291 dan E-value 2e-77 terhadap Xag
YR32. Selain itu, hasil penyejajaran DNA Imp Xcc dan Xag YR32 dengan ClustalW menunjukkan score 79. Data-data di atas menggambarkan kedekatan hubungan Imp Xcc
dengan ImpX. Hasil yang diperoleh menunjukkan bahwa Imp Xcc merupakan domain dari
Secretion protein HlyD, identity 52,6%, E-value 4,2E-32. Omori dan Idei (2003) menjelas kan bahwa Hly merupakan salah satu sistem ATP Binding Cassette (ABC) exporter yang terlibat dalam transpor hemolysin pada E. coli. Ada tiga protein, yaitu HlyB sebagai ABC protein, HlyD sebagai membrane fusion protein (MFP) di periplasmik, dan protein membran luar TolC.
Data di atas memberi keterangan yang lebih jelas tentang fungsi dari ImpX. Berdasarkan karakter-karakter yang dimiliki ABC transporter, maka ImpX memenuhi beberapa kriteria sebagai ABC transporter yaitu N-terminal hidrofobik, mempunyai signal peptida, mempunyai transmembrane region, C-terminal mempunyai Walker Motif A (GXXGKT), signature motif, dan Walker Motif B (KXHD) yang hidrofilik (Gambar 21). Walker Motif A adalah situs tempat menempelnya α dan β fosfat dari ATP, sedangkan Walker Motif B adalah tempat menempelnya ion Mg , signature motif sebagai situs hidrolisis (Pearson et al. 2004).
ImpX mempunyai N-terminal hidrofobik sebagai domain putative transmembrane region. Putative transmembrane region menunjukkan prediksi lokasi heliks transmembran dan prediksi lokasi intervening loop regions. Berdasarkan analisis bioinformatika pada ImpX, dengan panjang asam amino 182 terdapat satu transmembran, artinya ImpX sangat memungkinkan sebagai protein transmembran.
Berdasarkan analisis Model Hidden Markov menunjukkan bahwa ImpX mempunyai signal peptida dengan probabilitas 0,930. Maximumcleaveage site probability 0,640 antara posisi asam amino 29 dan 30. Protein sekresi pada prokariot melibatkan suatu signal sequence di awal urutan asam amino, yang akan dikenali oleh signal recognition particle
(SRP). Signal peptida akan dipotong oleh enzim signal peptidase (Turner et al. 2000). Hasil bioinformatika ini menggambarkan bahwa ImpX adalah protein sekresi.
M K S L K L L L R F A T I G G L I L L L L I P L L L I R G A V Q D R A R Y R D E A V E R V A Q S K A G E Q Q F I A P V R V L P Y T E D V Q V T E P D E Q G N Q R K V R R K R E G T L L Q T P R R L K L S G E M V P S V R E V G L Y R V Q V Y S W K A T L H A E Y D S F D Y A A A P T R A Y G Q P Y L A I G M S D V R G L V G T P R L Q V N G G K D R V R F Q S A I E R F R K
Gambar 21. Karakter-karakter putative ABC-ATPase transporter ImpX pada Xag YR32.
Keterangan : Huruf merah : signal peptida
Huruf hitam: putative transmembran Huruf coklat : putative Walker Motif A
Huruf oranye : putativesignature motif Huruf ungu : putative Walker Motif B
Putative ABC transporter memiliki Walker Motif A dan B. ImpX mempunyai diagnostic
ABC ATPase Walker Motif A dan B dimulai pada posisi 155 dan 168 yang hidrofilik. Adanya
putative Walker Motif A dan B menunjukkan bahwa bagian C-terminal ImpX sebagai ATPase. PutativeSignature motif berada diposisi 162. ImpX tidak mempunyai EAA motif, hal ini memberi informasi bahwa ImpX merupakan ABC sistem ekspor.
Berdasarkan analisis bioinformatik maka dapat dijabarkan bahwa ImpX merupakan protein transmembran, suatu protein sekresi, suatu putative ABC transporter, mempunyai ATPase, dan ABC sistem ekspor. Tipe ABC–ATPase pada Xag mempunyai N-terminus daerah hidrofobik dan transmembran yang menyatu dengan C-terminus suatu ATPase. Tipe ini termasuk tipe ABC-A1 (Pearson et al. 2004). Demikian juga Saurin et al. (1999) mengemukakan bahwa ABC-A1 juga sebagai alat ekspor protein, bakteriosin, maupun
toksin. ABC-A1 dapat dijumpai pada prokariot dan eukariot. Diagram putative ABC transporter pada Xag dapat dilihat pada Gambar 22.
Gambar 22. Peta fisik Putative ABC-ATPase transporter ImpX pada Xag YR32.
Keterangan : A : N-terminal hidrofobik transmembran B : Signal peptida
C : putative transmembran D : C-terminal hidrofilik E : putative Walker Motif A F : putativesignature motif G : putative Walker Motif B
Jika dihubungkan dengan posisi penyisipan transposon, maka C-terminal ImpX Xag
M715 yang merupakan ATPase akan tidak stabil. Hal ini berarti situs penempelan α dan β dari ATP dan ion Mg , serta situs hidrolisis ATP akan terganggu dan diduga situs-situs ini rusak karena berada masing-masing 19, 11, dan 6 asam amino dari posisi penyisipan transposon, sangat dekat dengan posisi penyisipan transposon. Kemungkinan lain, protein hasil translasi tidak sempurna sehingga kedua situs pada ATPase berubah konform asi pada saat pelipatan protein, atau bahkan tidak terjadi pelipatan, sehingga polipeptida dicacah protease sel nya sendiri, dan tidak ada ABC transporter untuk ekspor molekul toksin dan virulen determinan pada Xag M715. Dugaan lain, kalaupun terjadi pelipatan protein, ATPase
Xag M715 tidak berfungsi secara baik, artinya ATP tidak dapat menempel pada situsnya, sehingga tidak terjadi perubahan ATP menjadi ADP + Pi. Tidak adanya perubahan tersebut menyebabkan tida k terbentuk energy motive force sehingga tidak ada energi untuk mendorong molekul toksin dan virulen determinan yang terlibat patogenisitas pustul bakteri dari sitoplasma menuju lingkungan melintasi membran dalam, periplasmik dan membran luar. Hal serupa terjadi pada Staphylococcus aureus, mutasi pada sekuen Walker Motif A akan menyebabkan hilangnya aktivitas ATPase dan transpor pada FhuC. FhuC adalah ATPase yang terlibat dalam transpor besi (Speziali et al. 2006).